运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法

专利名称：运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法
技术领域：
本发明涉及病原体检验技术，具体地说是运用核酸恒温扩增反应来检测肺炎克雷伯菌的技术。
背景技术：
肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。细菌具有荚膜，在肺泡内生长繁殖时，引起组织坏死、液化、形成单个或多发性脓肿。病变累及胸膜、心包时，可引起渗出性或脓性积液。病灶纤维组织增生活跃，易于机化；纤维素性胸腔积液可早期出现粘连。在院内感染的败血症中，肺炎克雷伯菌为重要病原菌，病死率较高。 肺炎克雷伯菌(KNP)是临床分离及医院感染的重要致病菌之一，随着β -内酰胺类及氨基糖苷类等广谱抗菌素的广泛使用，细菌易产生超广谱β_内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)以及氨基糖苷类修饰酶(AMEs)，对常用药物包括第三代头孢菌素和氨基糖苷类呈现出严重的多重耐药性。肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近期逐年增高，且多耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。肺炎克雷伯菌耐药机制主要包括产生内酰胺酶、生物被膜的形成、外膜孔蛋白的缺失。抗菌药物主动外排等，抗菌药物耐药基因水平播散是多药耐药菌株临床加剧的重要原因。因此能够快速有效的检测肺炎克雷伯菌对于与之相关的疾病防控具有重要的意义。肺炎克雷伯菌的检测方法有常规培养和生理生化反应检测等多种方法，与传统检测手段相比，本发明很好的解决了目前大多数检测技术手段的弊端。首先，无需任何复杂的仪器，只需要一台简单的加热器，如普通的水浴锅或以电、电池为能源的加热器，使得核酸诊断可以前所未有地用于现场诊断。其次，可以加快反应速度，缩短反应时间。第三，易于操作者掌握，对反应条件的要求相对宽松，使得以该技术为基础的产品对操作人员的技能要求不高，这也为核酸试剂的普及创造了条件。

发明内容
针对肺炎克雷伯菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用等温扩增技术快速、便捷、低成本的试剂和检测方法。本发明提供了更加快速和低成本通过等温扩增方法检测肺炎克雷伯菌的方法。本发明是通过以下技术方案实现的(I)设计特异性寡核苷酸引物用于等温扩增技术检测；(2)整合各引物使之不相互干扰。(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；(4)扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带，阴性结果呈现一条紫红色条带。
该方法包括应用该方法检测肺炎克雷伯菌所使用的引物组和与之配套的等温扩增反应条件。其中引物序列如下该引物序列参照GenBank 中的序列 AP006725. I Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae NTUH-K2044DNA, complete genome中的溶质接合蛋白序列为基础进行设计。引物SEQ ID NO. I :5’ -TACGCCCCGGTCTGACSEQ ID NO. 2 :5，-GCGCTTTCACCCCCAACSEQ ID NO. 3 :5’ -GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATTSEQ ID NO. 4:5’ -CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGG
SEQ ID NO. 5 :5，-TGGCAACGACTGGTCTCGCCSEQ ID N0.6 :5， -TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。其中序列SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6使用特殊基团标记，扩增产物中包含上述基团，以便同核酸恒温扩增检测试纸条反应。本发明中反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
Bst 酶5U/ μ LI μ L
Bst酶缓冲液-5 μ L
SEQ ID NO. I:lOpmol/L0.2 μ L SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/L0. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμιηοΙ/L0. 8 μ L
SEQ ID NO. 4ΙΟμηιοΙ/L0. 8 μ L
SEQ ID NO. 5ΙΟμηιοΙ/LI. 5 μ
SEQ ID NO. 6:10 μ mo I/LI. 5 μ L
DNA样品2pL
双蒸水7 μ L
总体积20 μ 其中Bs t 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM (NH4) 2S04, IOmM KCl、2mMMgS04、质量百分比 0. 1% Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8. 8。等温扩增程序为61°C 60分钟。扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带(分别为检测线和质控线)，阴性结果呈现一条紫红色条带(质控线)。
如出现其它结果则表明此次检验失败不能确定样品中是否存在肺炎克雷伯菌，需重新检验。与现有技术相比，本发明的有益效果是相比传统生理生化检测方法，基于等温扩增的鉴定方法适用于直接从临床样品中扩增靶基因，只需要一次等温扩增反应就能够检测肺炎克雷伯菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它PCR方法，本方法制仅需要简单的设备——一个恒温水浴即可，大大提高了性价比节约了成本。等温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目的病原体。它通过扩增靶基因，避免了反复培养，节约时间；该鉴定方法不受培养条件和病原体生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。


图I样品检测结果，样品DNA使用核酸恒温扩增肺炎克雷伯菌的检测技术检测，扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结 果呈现两条紫红色条带(分别为检测线和质控线)，阴性结果呈现一条紫红色条带(质控线)，试纸条I为I株肺炎克雷伯菌标准株扩增产物检测结果，试纸条2和3分别为2株肺炎克雷伯菌野生株扩增产物检测结果，试纸条4为阴性对照。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。实施例I样本1株肺炎克雷伯菌标准株的细菌培养物，2株肺炎克雷伯菌野生株的细菌培养物。I.样品DNA抽提取Iml样品培养物，离心得到沉淀物质在Iml缓冲液中重悬，加入Iml裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液置-20°c保存。3.等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量
Bst 酶5U/pLΙμΙ
Bst酶缓冲液-5 μι
SEQ ID NO. IΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμηιοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 4ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5ΙΟμηιοΙ/LI. 5 μ
SEQ ID NO. 6:ΙΟμιηοΙ/LI. 5 μ
DNA样品2 μ L
双蒸水7 μ L
总体积20 μ L其中Bs t 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8· 8。等温扩增程序为61 °C，60分钟。等温扩增共进行4管检测，其中DNA样品所加入的分别为样品I为肺炎克雷伯菌标准株培养物的DNA样本；样品2和3为肺炎克雷伯菌野生株培养物的DNA样本；样品4为阴性对照。4.被检测样品结果观察扩增完毕后通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阴性对照显示阴性结果，肺炎克雷伯菌标准株和野生株均显示阳性结果。实施例2样本某待测样品。I.样品DNA抽提某样品怀疑含有肺炎克雷伯菌，取Iml该样品培养物，离心得到沉淀物质在Iml缓冲液中重悬，加入Iml裂解液,沸水浴10分钟,室温下10000转/分钟,离心5分钟,取上清液置_20°C保存。3.等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量
Bst 酶5U/ μ LIpL
Bst酶缓冲液-5 μ L
SEQ ID NO. I:10 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμπιοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 410 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5:10 μ mol/LI. 5 μ L
SEQ ID NO. 6:10 μ mol/LI. 5 μ L
DNA样品2 μ L
双蒸水7 μ L
总体积20 μ L其中Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8· 8。等温扩增程序为63 °C，60分钟。 等温扩增共进行3管检测，其中DNA样品所加入的分别为样品I为阴性对照；样品2为阳性对照，即含肺炎克雷伯菌标准株的DNA样本；样品3为待测样本。4.被检测样品结果观察扩增完毕后通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阴性对照显示阴性结果，肺炎克雷伯菌标准株的DNA样本和待测样本的DNA显示阳性结果。6天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的样本中含有肺炎克雷伯菌。核酸恒温扩增检验结果与常规微生物培养和生化检测结果一致。以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
权利要求
1.一种运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法，其特征在于，包括以下六个引物SEQ ID NO. I :5’ -TACGCCCCGGTCTGACSEQ ID NO. 2 :5’ -GCGCTTTCACCCCCAACSEQ ID NO. 3 :5’ -GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATTSEQ ID NO. 4 :5’ -CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGGSEQ ID NO. 5 :5’ -TGGCAACGACTGGTCTCGCCSEQ ID NO. 6 :5’ -TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。
2.根据权利要求I所述的一种运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量 Bst 酶 5U/pLΙμBst酶缓冲液 -5μSEQ ID NO. I ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L SEQ ID NO. 2 ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L SEQ ID NO. 3: 10 μ mo I/LO. 8 μ L SEQ ID NO. 4 10 μ mol/LO. 8 μ L SEQ ID NO. 5: 10 μ mol/LI. 5 μ L SEQ ID NO. 6: 10 μ mol/LI. 5 μ L DNA样品2 μ L 双蒸水7 μ L总体积20 μ L 其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8· 8。
3.根据权利要求I所述的一种运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法，其特征在于，核酸扩增程序为61°C，60分钟。
全文摘要
本发明公开了一种运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法，设计了六个引物组序列，5’-TACGCCCCGGTCTGAC；5’-GCGCTTTCACCCCCAAC；5’-GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATT；5’-CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGG；5’-TGGCAACGACTGGTCTCGCC；5’-TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。针对肺炎克雷伯菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用核酸恒温扩增技术快速低成本的检测方法。
文档编号C12Q1/04GK102899419SQ201210448968
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者张霞, 郑文杰, 刘伟, 张宏伟, 曲鹏, 吴冬雪, 赵良娟, 刘培, 高旗利 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心