呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒的制作方法

本技术属于呼吸道致病菌快速检测领域。涉及一种微流控芯片快速检测技术和核酸等温扩增技术；具体涉及一种呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒，具体包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特定基因保守序列具有的特异性引物和引物组；还涉及将引物和引物组用于等温扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
：下呼吸道感染(lowerrespiratorytractinfection,lrti)是常见的呼吸系统疾病住院原因之一，包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等。常见病症包括社区获得性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重期、支气管扩张急性加重期等。对于下呼吸道感染性疾病，临床常规的血液等生化指标分析仅能通过免疫细胞及球蛋白水平初步判断病因，无法确定病原菌的种属。临床上呼吸道感染性疾病非典型性和混合感染的趋势逐渐增加，很难通过病原鉴定以外的方法进行诊治。目前临床上对病原菌鉴定的方法主要是培养法。其主要步骤取样、培养、鉴定。培养法本身存在较多缺陷，不能满足临床需要。首先培养法检测耗时长，培养时间与所感染的细菌种类有关，至少用时2-3天，当临床出现急性病症时，培养法无法适用；其次该方法准确性低，尤其是批量鉴定时，样品之间很容易互相感染；并且难以检出需要特殊培养条件的细菌，如军团菌、l-型细菌、肺炎链球菌等；再次受国内实验室安全防护条件的限制，实验室工作人员在分离培养病原菌时存在着高风险被感染的可能；最后培养法对实验条件要求较高，需要的培养基种类较多，乡镇医院、社区医疗单位和户外等均无法使用细菌培养的检测方法，很容易对病人造成贻误。对于普通pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)技术鉴定病原微生物的方法，因其对实验室要求高，需要特殊仪器，容易出现假阳性和交叉污染等缺点，也不利于其应用的开展。综上所述，在当前医疗卫生重心转移的大背景下，在临床上尤其是基层医疗机构对快速准确，操作简单，实验环境要求低的诊断产品具有迫切需求。其中，现有技术cn102952875a提供了一种细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒。该试剂盒包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测探针。该基因芯片包括检测待测细菌耐药基因的探针。利用该试剂盒和基因芯片进行耐药基因检测的方法，包括步骤：1)利用试剂盒中的引物，pcr扩增待测样本dna中的耐药基因；2)扩增产物与试剂盒中的检测探针进行荧光标记反应；3)荧光标记的扩增产物与基因芯片进行杂交，确定样本所含耐药基因。该方法包括核酸提取、多重pcr和荧光标记反应、基因芯片预处理、荧光标记的多重pcr产物与芯片的杂交反应、芯片扫描和结果分析五个步骤操作复杂。且每个步骤都需要诸多的仪器和苛刻的实验环境，很容易遭成扩增产物污染，出现结果假阳性。另外与科研单位相比医院检验科实验用仪器较少，尤其是区域型小医院没有经费及条件购置多通道pcr仪，且该方案中原材料包括探针，探针的成本较高将导致产品售价过高，超出部分患者接受范围不利于该试剂盒推广。现有技术cn104313166a一种铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，所述铜绿假单胞菌多重耐药基因包括oprd2、tem、oxa10、aac3、aac6、vim、veb、imp共8个耐药基因，试剂盒包括核酸扩增组份和杂交组份；核酸扩增组份具体包括：预混液、引物混合液、聚合酶、阳性质控品、阴性质控品；杂交组份具体包括：微球杂交液、质控微球和链霉亲和素-藻红蛋白。该方案中的探针及微球都是价格较贵的原料，荧光定量pcr仪的价格较高，需要经培训的专业人士操作，部分医院更没有相关仪器。另外该方法pcr过程中设计较多升降温过程，使得整个实验时间周期较长。本发明所开发的呼吸道核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)，结合了恒温扩增技术，实时荧光技术和微流控芯片技术，对下呼吸道分泌物样本中的核酸进行检测，特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速。技术实现要素：鉴于现有技术存在的问题，本发明的一个目的在于提供一种呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒，包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌七种致病菌特异性片段检测用引物组。具体地，本发明通过以下技术方案实现：一种呼吸道微流控芯片快速检测试剂盒，所述试剂盒为对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特异性基因为模板设计的特异性引物组、检测芯片、核酸扩增反应液、阳性模板。所述引物组包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌七种病原菌检测用引物组，其特征在于能扩增靶基因特异碱基序列，所述靶基因分别为：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌，为所述引物与所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。所述引物组由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌各6个引物组成。所述引物组包含：一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：正向外引物f3ttatgtatcaggtacttat反向外引物b3ttttgttatttaacccaatcattta正向内引物fipattcttcgttactcattacatacatgtgaattattataacttgtaataac反向内引物bipaaccgaagataaaaaagaacctctgaatattttttgagttgaacctggtg正向环引物lfaatggatagacgtcatatgaaggt反向环引物lbctcaacaagttccagattacaactt可以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因特异性序列；一种金黄色葡萄球菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：正向外引物f3gttactttacagatataatg反向外引物b3gaaaaagtgtacgagttcttga正向内引物fipgtttcataaccttcataaatatttccatacagtcatttcactaa反向内引物bipgaggtcatttaatatttattacttcgatcactggacctag正向环引物lfaactcatagtgtacaaca反向环引物lbgtacctgttatgaaagtgttca可以扩增金黄色葡萄球菌基因特异性序列；一种大肠埃希菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：正向外引物f3gtaatcgtggtgattgatga反向外引物b3ggttcgttgtaaatactcca正向内引物fiptctttcgtattgtttacctacttatgtcgtatttaacctc反向内引物biptacatagaagagtaagtcaacgttttggtttttgtcactatatatc正向环引物lfttcgaaaccaattactaaaga反向环引物lbtataacttacagtagatt可以扩增大肠埃希菌基因特异性序列；一种肺炎克雷伯菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：正向外引物f3gtctctacaataggaat反向外引物b3atgagacctactgggaca正向内引物fipaacctaaatgttaaaataagtcagggagacgaccgt反向内引物bipagttaataaagtaggagtactttattttgttctagtatggaatcgg正向环引物lfcgatgacataataaataaccg反向环引物lbtatatataccactacca可以扩增肺炎克雷伯菌基因特异性序列。一种铜绿假单胞菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：正向外引物f3tgttatggaaatgtccacctt反向外引物b3tcttatgatatttctgag正向内引物fipgtacagaacataatacagaggaacacgatgaacaacgt反向内引物bipatatcgtctgacctatacccttcgtcatactttagat正向环引物lfccagataagagaatttcaga反向环引物lbatattatcgttatcagg可以扩增铜绿假单胞菌基因特异性序列；一种鲍曼不动杆菌伯检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：正向外引物f3tgttacaattaacttcttata反向外引物b3cttgtaatatcgttatagtagtt正向内引物fipagtgaattcggttatcgtaatatcgaataataaaaaaaaattagtcac反向内引物bipaatgatatgtatcaaaatatagagtattaactcatgttagatgg正向环引物lftataagagaggtctac反向环引物lbccgttaaaaattataagg可以扩增鲍曼不动杆菌基因特异性序列。一种嗜麦芽窄食单胞菌伯检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：正向外引物f3gtataatattggaggttcct反向外引物b3atgaagtagtacagatg正向内引物fiptatacaagatatcaatagtgtaacctatgatcaggga反向内引物bipacaactagtcgttcaccggtacgagtaaattacaaactagatg正向环引物lfgattacggggtaggaa反向环引物lbacccgatgacaagggtat可以扩增嗜麦芽窄食单胞菌基因特异性序列。本发明前述每组引物都经多次筛选，最终引物为扩增效率高，特异性好的引物序列。本发明的另一个目的在于提供一种呼吸道微流控芯片快速检测芯片，是针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特异性基因片段的检测方法及专用的微流控芯片。所述专用微流控芯片，其特征在于微流控芯片上固定有上述七种引物组及阳性质控品和阴性质控品组成的阵列。所述检测方法是指基于核酸等温扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的检测方法。上述目的是通过如下技术方案实现的：本发明所提供的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的方法，是通过针对上述七种病原菌特定基因片段设计引物，并利用核酸等温扩增技术，以微流控芯片为载体，在恒温平台上进行扩增，并根据显色反应进行结果判读。本发明的另一个目的在于，提供七种利用上述不同引物组基于核酸等温扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的检测试剂盒。其特征在于，所述试剂盒至少包括含有扩增反应液及上述固定有上述引物组的基因芯片。所述扩增反应液中包括如下试剂：表1扩增反应液具体组分及浓度序号试剂组分终浓度110×thermopolbuffer1×2mgso42-7mmol/l3bsa0.2-2mg/ml4datp0.2-3mmol/l5dgtp0.2-3mmol/l6dctp0.2-1.5mmol/l7dttp0.2-1.5mmol/l9betaine0.2-1mol/l10dutp0.01-0.5mmol/l11evagreen1×13ung0.001u/μl14bstpolymerase0.25-0.5u/μl所述酶为每微升含8-16个活性单位的bstdna聚合酶。所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为te缓冲液；所述阳性对照模板为酵母菌dna片段(1～100nm)。本发明同时提供一种使用前述呼吸道微流控芯片快速检测试剂盒的检测方法，为所述七种呼吸道致病菌的检测试剂盒的检测方法，该方法具体步骤为：1)样品处理和模板提取，样品范围适用于痰液样品标本；临床样本液化后取1ml菌液加入离心管中，12000rpm，离心2min后弃上清，加入600μl超纯水，12000rpm，离心2min后弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200ul超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。2)分别取24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.545μl及0.159μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置.3)阳性质控品，取0.159μl1×105酵母dna，0.545μl0.1％琼脂糖和0.296μl引物混合之后，点在相应位置。4)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的核酸等温扩增取扩增反应液，加入待检模板，形成如下的反应体系。表2反应体系中具体组分及浓度振荡混匀后离心，将离心后的上清液注入芯片，转至ichip-400仪器(ichip-仪器为本公司自主研发的等温显色检测系统，包括软件和硬件两部分)中，温度65℃进行反应，时间60min。5)核酸反应产物的检测检测：与阴性对照孔比较，检测孔在ichip-400设备上有s形曲线判定为阳性。在ichip-400设备上未见s形曲线为阴性。本发明通过提供七种针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特定基因片段具有特异性的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌进行检测。本发明提供的检测试剂和检测方法可检出1×10‐3cfu/μl的耐药菌、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决携带耐药基因的病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小，该试剂盒仅需要48μl扩增反应液便可以同时对11中耐药基因进行检测、污染小，该实验全称为闭盖氏反应，且体系中含有ung酶，减少了污染的可能、成本低、且便携等诸多优点。附图说明图1为基因芯片排布示意图，其中，①为进样口卡扣，②为进样孔，③为反应池，④为排气孔；图2为用图1所示的基因芯片对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；图3为用图1所示的基因芯片对金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；图4为用图1所示的基因芯片对大肠埃希菌进行实际检测结果；图5为用图1所示的基因芯片对肺炎克雷伯菌进行实际检测结果；图6为用图1所示的基因芯片对铜绿假单胞菌进行实际检测结果；图7为用图1所示的基因芯片对鲍曼不动杆菌进行实际检测结果；图8为用图1所示的基因芯片对嗜麦芽窄食单胞菌进行实际检测结果。图中，1-10通道和“+”、“-”分别代表的是图中右侧曲线为质控线，用于质控芯片和仪器，左侧曲线为检测指标的扩增线；横坐标单位是分钟(min)纵坐标没有单位；1-10通道和“+”、“-”含义如下：1为阳性质控，2为阴性质控，3为耐甲氧西林葡萄球菌，4为金黄色葡萄球菌，5为大肠埃希氏菌，6为肺炎克雷伯菌，7为铜绿假单胞菌，8为鲍曼不动杆菌，9为嗜麦芽窄食单胞菌，10为阴性质控；“+”代表相应指标检出“-”代表相应指标未检出。具体实施方式下面通过具体的实施例和附图对本发明进行说明，以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌检测过程通过基因芯片来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。实施例一1引物制备通过大量实验筛选出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特异性基因的核酸片段设计出核酸扩增引物并合成，得到如下的引物：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌序列编号1正向外引物f3ttatgtatcaggtacttat序列编号2反向外引物b3ttttgttatttaacccaatcattta序列编号3正向内引物fipattcttcgttactcattacatacatgtgaattattataacttgtaataac序列编号4反向内引物bipaaccgaagataaaaaagaacctctgaatattttttgagttgaacctggtg序列编号5正向环引物lfaatggatagacgtcatatgaaggt序列编号6反向环引物lbctcaacaagttccagattacaactt金黄色葡萄球菌序列编号7正向外引物f3gttactttacagatataatg序列编号8反向外引物b3gaaaaagtgtacgagttcttga序列编号9正向内引物fipgtttcataaccttcataaatatttccatacagtcatttcactaa序列编号10反向内引物bipgaggtcatttaatatttattacttcgatcactggacctag序列编号11正向环引物lfaactcatagtgtacaaca序列编号12反向环引物lbgtacctgttatgaaagtgttca大肠埃希菌序列编号13正向外引物f3gtaatcgtggtgattgatga序列编号14反向外引物b3ggttcgttgtaaatactcca序列编号15正向内引物fiptctttcgtattgtttacctacttatgtcgtatttaacctc序列编号16反向内引物biptacatagaagagtaagtcaacgttttggtttttgtcactatatatc序列编号17正向环引物lfttcgaaaccaattactaaaga序列编号18反向环引物lbtataacttacagtagatt肺炎克雷伯菌序列编号19正向外引物f3gtctctacaataggaat序列编号20反向外引物b3atgagacctactgggaca序列编号21正向内引物fipaacctaaatgttaaaataagtcagggagacgaccgt序列编号22反向内引物bipagttaataaagtaggagtactttattttgttctagtatggaatcgg序列编号23正向环引物lfcgatgacataataaataaccg序列编号24反向环引物lbtatatataccactacca铜绿假单胞菌序列编号25正向外引物f3tgttatggaaatgtccacctt序列编号26反向外引物b3tcttatgatatttctgag序列编号27正向内引物fipgtacagaacataatacagaggaacacgatgaacaacgt序列编号28反向内引物bipatatcgtctgacctatacccttcgtcatactttagat序列编号29正向环引物lfccagataagagaatttcaga序列编号30反向环引物lbatattatcgttatcagg鲍曼不动杆菌序列编号31正向外引物f3tgttacaattaacttcttata序列编号32反向外引物b3cttgtaatatcgttatagtagtt序列编号33正向内引物fipagtgaattcggttatcgtaatatcgaataataaaaaaaaattagtcac序列编号34反向内引物bipaatgatatgtatcaaaatatagagtattaactcatgttagatgg序列编号35正向环引物lftataagagaggtctac序列编号36反向环引物lbccgttaaaaattataagg嗜麦芽窄食单胞菌序列编号37正向外引物f3gtataatattggaggttcct序列编号38反向外引物b3atgaagtagtacagatg序列编号39正向内引物fiptatacaagatatcaatagtgtaacctatgatcaggga序列编号40反向内引物bipacaactagtcgttcaccggtacgagtaaattacaaactagatg序列编号41正向环引物lfgattacggggtaggaa序列编号42反向环引物lbacccgatgacaagggtat2基因芯片制备参照图1所示的基因芯片排布示意图，芯片是由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌所对应七组引物，pc(阳性质控品)、nc(阴性质控品)组成的阵列。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，分别取24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.545μl及0.159μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。金黄色葡萄球菌，分别取24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.545μl及0.159μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。大肠埃希菌，分别取24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.545μl及0.159μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。肺炎克雷伯，分别取24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.545μl及0.159μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。铜绿假单胞菌，分别取24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.545μl及0.159μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。鲍曼不动杆菌，分别取24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.545μl及0.159μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。嗜麦芽窄食单胞菌，分别取24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.545μl及0.159μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。阳性质控品，取0.159μl1×105酵母dna，0.545μl0.1％琼脂糖和0.296μl引物混合之后，点在相应位置，自然晾干。3耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌基因组。4上述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌七种菌株基因dna提取：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌取1ml菌液加入1.5ml离心管中，12000rpm，离心2min后弃上清，加入600μl超纯水，再次12000rpm，离心2min后弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200μl超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴加热5min，12000rpm离心2min取上清。5基于核酸扩增法的基因扩增取扩增反应液28μl，加入35μl待检模板及7μl水，形成如下表总体积为70μl的反应体系，反应体系如下：(反应总体积为70μl)表3反应体系中各组分及浓度在温度为65℃的ichip-400上反应50分钟。6扩增产物的检测与阴性对照孔比较，检测孔在ichip-400设备上有s形曲线判定为阳性。在ichip-400设备上未见s形曲线为阴性。实验结果为：图2为用图1所示的基因芯片对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；图3为用图1所示的基因芯片对金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；图4为用图1所示的基因芯片对大肠埃希菌进行实际检测结果；图5为用图1所示的基因芯片对肺炎克雷伯菌进行实际检测结果；图6为用图1所示的基因芯片对铜绿假单胞菌进行实际检测结果；图7为用图1所示的基因芯片对鲍曼不动杆菌进行实际检测结果；图8为用图1所示的基因芯片对嗜麦芽窄食单胞菌进行实际检测结果；通过上述结果可知，本发明提供的检测试剂和检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决呼吸道病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超过权利要求所记载的技术方案前提下，还有其他变体或改型。<130>2017<160>42<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<400>1ttatgtatcaggtacttat19<210>2<211>25<212>dna<400>2ttttgttatttaacccaatcattta25<210>3<211>50<212>dna<400>3attcttcgttactcattacatacatgtgaattattataacttgtaataac50<210>4<211>50<212>dna<400>4aaccgaagataaaaaagaacctctgaatattttttgagttgaacctggtg50<210>5<211>24<212>dna<400>5aatggatagacgtcatatgaaggt24<210>6<211>25<212>dna<400>6ctcaacaagttccagattacaactt25<210>7<211>20<212>dna<400>7gttactttacagatataatg20<210>8<211>22<212>dna<400>8gaaaaagtgtacgagttcttga22<210>9<211>44<212>dna<400>9gtttcataaccttcataaatatttccatacagtcatttcactaa44<210>10<211>40<212>dna<400>10gaggtcatttaatatttattacttcgatcactggacctag40<210>11<211>18<212>dna<400>11aactcatagtgtacaaca18<210>12<211>22<212>dna<400>12gtacctgttatgaaagtgttca22<210>13<211>20<212>dna<400>13gtaatcgtggtgattgatga20<210>14<211>20<212>dna<400>14ggttcgttgtaaatactcca20<210>15<211>40<212>dna<400>15tctttcgtattgtttacctacttatgtcgtatttaacctc40<210>16<211>46<212>dna<400>16tacatagaagagtaagtcaacgttttggtttttgtcactatatatc46<210>17<211>21<212>dna<400>17ttcgaaaccaattactaaaga21<210>18<211>18<212>dna<400>18tataacttacagtagatt18<210>19<211>17<212>dna<400>19gtctctacaataggaat17<210>20<211>18<212>dna<400>20atgagacctactgggaca18<210>21<211>36<212>dna<400>21aacctaaatgttaaaataagtcagggagacgaccgt36<210>22<211>46<212>dna<400>22agttaataaagtaggagtactttattttgttctagtatggaatcgg46<210>23<211>21<212>dna<400>23cgatgacataataaataaccg21<210>24<211>17<212>dna<400>24tatatataccactacca17<210>25<211>21<212>dna<400>25tgttatggaaatgtccacctt21<210>26<211>18<212>dna<400>26tcttatgatatttctgag18<210>27<211>38<212>dna<400>27gtacagaacataatacagaggaacacgatgaacaacgt38<210>28<211>37<212>dna<400>28atatcgtctgacctatacccttcgtcatactttagat37<210>29<211>20<212>dna<400>29ccagataagagaatttcaga20<210>30<211>17<212>dna<400>30atattatcgttatcagg17<210>31<211>21<212>dna<400>31tgttacaattaacttcttata21<210>32<211>23<212>dna<400>32cttgtaatatcgttatagtagtt23<210>33<211>48<212>dna<400>33agtgaattcggttatcgtaatatcgaataataaaaaaaaattagtcac48<210>34<211>44<212>dna<400>34aatgatatgtatcaaaatatagagtattaactcatgttagatgg44<210>35<211>16<212>dna<400>35tataagagaggtctac16<210>36<211>18<212>dna<400>36ccgttaaaaattataagg18<210>37<211>20<212>dna<400>37gtataatattggaggttcct20<210>38<211>17<212>dna<400>38atgaagtagtacagatg17<210>39<211>37<212>dna<400>39tatacaagatatcaatagtgtaacctatgatcaggga37<210>40<211>43<212>dna<400>40acaactagtcgttcaccggtacgagtaaattacaaactagatg43<210>41<211>16<212>dna<400>41gattacggggtaggaa16<210>42<211>18<212>dna<400>42acccgatgacaagggtat18当前第1页12