一种用于检测基因变异的pcr引物设计方法及试剂盒的制作方法

专利名称：一种用于检测基因变异的pcr引物设计方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因变异的检测方法及试剂盒领域，特别涉及一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法及试剂盒。
背景技术：
基因变异在生物体中时刻发生，有的变异是无意的，它不影响生物体正常生长，但是，总有一些变异后果非常严重，给人类的生存带来挑战。科学工作者发明了许多检测基因变异的方法，具体包括PCR-限制性酶切分析、PCR-SSCP分析、PCR-测序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-LDR、连接酶反应LDR、PCR-HRM分析、ARMS-PCR等。其中最为常用方法为PCR-限制性酶切分析、PCR-测序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-HRM分析、ARMS-PCR。PCR-限制性酶切分析是针对位点明确、且突变型与野生型在序列上至少存在一种酶切位点差异。PCR完成后，用该酶进行酶切后，测序鉴定。耗时、·繁琐，但灵敏度高。对于有些样品由于野生型和突变型之间无差异酶切位点，导致该方法不可用。PCR-测序分析是突变检测的金标准方法，可发现未知变异位点。实验周期久、灵敏度低(10%左右)。PCR-基因芯片分析是针对大量已知突变位点的有效方法，但是其灵敏度仅能做到59TlO%，且成本较高。PCR-HRM分析成本低、通量大，由于不能自动化分析结果，需实验人员判读，仅在科研中有所应用。ARMS-PCR是目前开发基因变异最为常用技术，系统中包含通用引物和变异区域特异引物(以后简称“变异引物”)。通用引物可与野生型和突变型同时结合、变异引物与基因变异区域完全互补，与野生型仅在3端有I飞个碱基的差异，因此基因变异的检测完全依赖于变异引物的设计好坏决定试剂盒的灵敏度和特异性(见图I)。由于变异引物与野生型模板仅有广3个碱基不互补，也存在一定几率结合而发生错误弓I导的PCR合成，这种结合的概率很高，约为O. 19Tl%。一旦发生此类反应，则结果和试剂盒的可靠性大大下降。影响此类反应的因素主要是核酸提取残留盐离子、模板浓度过高两个，这两个因素在实际应用中不是可控因素，因此无法在研究测试初期通过优化反应条件来降低。欧洲DxS基于ARMS-PCR/Scorpion系统开发的K_ras试剂已获得CE认证，并在SFDA提出注册申请。因此基于ARMS-PCR开发新的分子诊断试剂盒是一个较为可靠的方法。由于基因变异，面对复杂的基因变异，传统的分子诊断方法显得很无力，这是因为在此类基因变异样品中，含有大量的野生型背景，从而为鉴别这些重要基因是否发生后果严重的变异带来巨大麻烦。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法及试剂盒，该方法易于设计、可控，该试剂盒灵敏度高、重复性好，稳定可靠。本发明的一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法，包括在基因高度(基因序列相似性大于80%)同源和保守的区域设计正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段与基因变异区域野生型完全互补6 20个碱基的寡核苷酸；在变异基因的位置设计与变异基因完全互补的反向引物。所述的寡核苷酸与基因变异区域野生型完全互补的碱基数为8 15个。所述的寡核苷酸的退火温度在37飞5°C之间。将所述的PCR引物设计方法与实时荧光PCR、PCR-ELISA, PCR-反向分子杂交或PCR-基因芯片技术联合使用。一种用于检测基因变异的试剂盒，包括dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl体系、引物和探针；所述的引物包括正向引物和反向引物；所述的正向引物包括正向PCR通用 引物和附加于通用引物的5’端的一段与基因变异区域野生型完全互补6 20个碱基的寡核苷酸；所述的反向引物设计在变异基因的位置，且与变异基因完全互补。所述的Taq DNA聚合酶的用量为O. 5 IU/测试；Mg2+的浓度为O. 5 I. 5mM ;所述的Tris-KCl体系中KCl浓度为3(T50mM，甘油的质量浓度为10% ;引物和探针的用量为各IOP/测试。对于野生型的扩增，本发明中所述正向通用引物附加寡核苷酸优于反向引物与野生型模板结合而阻止野生型扩增；对于突变型的扩增，由于所述正向通用引物附加寡核苷酸与之不完全配对，因此反向引物可以结合到突变基因模板上进行扩增。根据本发明的基因变异检测PCR引物设计方法，通用引物可以引导一个DNA链合成，当此次合成DNA链时野生型时，“变性一退火”后，可发生自身引导合成的DNA链内折叠，阻碍变异引物与野生型模板结合，称之为阻遏ARMS-PCR系统。在此阻遏ARMS-PCR系统中，通用引物的5端附加一段与变异引物高度同源、但与变异基因的野生型完全互补的寡核苷酸序列(见图2)，该序列在分子内优先与变异基因的野生型结合，从而抑制或阻碍了变异引物与野生型结合的几率(见图3)，解决了变异引物特异性问题，从而极大的提高了变异引物的灵敏度。具体而言,如图2所不,本发明的通用引物分为A、B两部分，B部分为正常的PCR引物，A部分为与变异引物C相互竞争结合位点的寡核苷酸序列。通用引物B段与野生型模板D段和突变型模板F段完全互补，是PCR合成的一个引导链；变异引物C与突变型模板G’完全互补，是PCR合成的另一个引导链。H与H’区是设计荧光探针和杂交探针的位置；E和E’是野生型发生基因变异的位置。G和G’是E和E’发生基因变异的新序列。在适当的条件下，A部分与野生型E’结合效率高于变异引物C ;变异引物C更易于G’结合。特别是，反应完成第I个循环后(如图3所示)，通用引物合成的野生型DNA链在“变性一退火”过程中，会自动形成发卡结构，从而屏蔽掉变异引物的结合位点。此类分子内折叠的效率通常比分子间结合效率高10倍以上，因此能取得较好的屏蔽效果。本发明公开的引物设计方法中引物设计参照通用的引物设计原则不允许引物间或/和引物内3’端出现5个以上碱基互补；变异引物的长度在15bp 25bp之间，退火温度(用软件Primer Express 3· O计算)在42 60°C之间；优选变异引物的长度在16bp 22bp之间，退火温度(用软件Primer Express 3. O计算)在48、2°C之间；通用引物B区的长度在15bp 25bp之间，退火温度(用软件Primer Express 3. O计算)在42 60°C之间；优选通用引物B区的长度在16bp 20bp之间,退火温度(用软件Primer Express 3. O计算)在48 52°C之间；通用引物A区的长度在6 20bp之间,退火温度(用软件Primer Express 3. O计算)在37 55°C之间；可能发生变异的区域设计在通用引物A区的较中间的位置。本发明的基因变异的PCR弓丨物设计方法，其特点是在ARMS-PCR弓丨物设计中，在通用引物中附加一段与基因变异区域的野生型完全互补序列，该序列在PCR退火时，会优于针对变异基因设计的变异基因检测引物退火到野生型上，阻碍了变异引物与野生型基因的
彡口口依据本发明的引物设计方法设计的引物，可用于实时荧光PCR、PCR_ELISA、PCR-反向分子杂交、PCR-基因芯片分析等实验中。与其他方法联用，可开发多种基因变异检测试剂盒。根据上述方法，本发明可以与实时荧光PCR技术设计各种用于基因变异检测PCR试剂盒，其中包括dNTPs、二价阳离子、耐热DNA聚合酶、缓冲体系、引物、探针等常规试剂，其中耐热DNA聚合酶使用量为O. 5 IU/测试、二价阳离子浓度在O. 5^1. 5mM、KCl浓度为 3(T50mM、引物和探针各IOP/测试、10%甘油。PCR循环参数中退火温度要高于变异引物Tm值1(T15°C，保证变异引物的严谨性和封闭的效果。根据本发明提供的PCR引物设计方法，在大量野生型基因存在的情况下，可选择性扩增变异基因的目的片段，从而实现变异基因的检测。该方法解决了传统测序方法灵敏度高不足、基因芯片方法非特异性杂交的问题，大大提高了变异基因的检测灵敏度。本发明旨在大量野生型背景下，提供变异基因检测引物的设计方法和试剂盒，在ARMS-PCR基础上开发新一代检测方法，与ARMS-PCR/Scorpion系统比较，本发明的优点具体为I.野生型背景是突变型1000倍以上，仍然可以检出突变型；2.本方法可与实时荧光PCR、PCR-ELISA、PCR_反向分子杂交、PCR-基因芯片分析等技术联合，用于变异基因的检测领域。有益效果(I)本发明的一种用于基因变异的PCR引物设计方法，其特点是易于设计、可控且扩增灵敏度高；(2)本发明得到的基因变异检测试剂盒与传统测序检测基因变异比较，具有灵敏度高(100倍以上)、特异性强、时间短(3小时内完成检测)、操作步骤少的优点。


图I是通用ARMS-PCR工作原理；图2是本发明中阻遏ARMS-PCR中弓丨物设计原理；图3是阻遏ARMS-PCR工作原理；图4为实施例I的扩增曲线；图5为实施例I的扩增曲线；图6为实施例I的扩增曲线；图7为实施例I的扩增曲线；图8为实施例I的扩增曲线；图9为实施例2的扩增曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I一种鉴定K-ras密码子12/13突变情况的方法
I.提取肿瘤患者组织基因组DNA ；2.进行PCR扩增，20 μ I PCR反应体系如下待测肿瘤组织基因组DNA 5(Tl00ng，Taq 酶(5U/μ 1)0. 125 μ 1，上下游引物和探针(10 μ Μ)各 1μ I (引物 Krasl2-1A_F 5’ -TGTGGTAGTTGGAGCTA-3’、Krasl2_lT_F :5’ -TGTGGTAGTTGGAGCTT-3’、Krasl2_2A_F 5’ -GTGGTAGTTGGAGCTGA-3’、Krasl2_2T_F :5’ -GTGGTAGTTGGAGCTGT-3’、Krasl3_2A_F 5’-GTAGTTGGAGCTGGTGA-3’ 、Krasl213_R5，-AGCTGGTGGCGTATATTCGTCCACAAAATGATTC-3，，探针 Krasl213_P :5，-FAM-AAGAGTGCCTTGACGATACAGC-BHQ1-3’)，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 缓冲液(含 Mg2+) I. 5 μ 1，甘油10%，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为95°C变性5min，随后95°C变性10sec，58°C退火延伸35sec，进行45个循环，最后37°C延伸Imin ;在58°C进行荧光信号收集。3. PCR结果分析(附图4-8)a. CT〈40，判定为阳性(+ )；b. CT>40，判定为阴性(_)；实施例2一种鉴定K-ras密码子61突变情况的方法I.提取肿瘤患者组织基因组DNA ;2.进行PCR扩增，20 μ I PCR反应体系如下待测肿瘤组织基因组DNA 5(Tl00ng，Taq 酶(5υ/μ 1)0. 125μ 1，上下游引物和探针(10μΜ)各 1μ I (引物 Kras61_F 5’ -TTCTCGACACAGCAGGTCT-3’、Kras61-R :5’ -AGCAGGTCAAGAGGACCCACCTATAATGGAGAATATC-3’，探针 Kras61-P :5’ -FAM-CAGTGCAATGAGGGACCAGTAC-BHQI-3' )，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10 XPCR缓冲液(含Mg2+) I. 5 μ 1，甘油10%，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为95°C变性5min，随后95°C变性lOsec，58°C退火延伸35sec，进行45个循环，最后37°C延伸Imin ;在58°C进行荧光信号收集。3. PCR结果分析(附图9)c. CT〈40，判定为阳性(+ )；d. CT>40，判定为阴性(_)。
权利要求
1.一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法，包括在基因同源和保守的区域设计正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段与基因变异区域野生型完全互补6 20个碱基的寡核苷酸；在变异基因的位置设计与变异基因完全互补的反向引物。
2.根据权利要求I所述的一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法，其特征在于所述的寡核苷酸与基因变异区域野生型完全互补的碱基数为8 15个。
3.根据权利要求I所述的一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法，其特征在于所述的寡核苷酸的退火温度在37飞5°C之间。
4.根据权利要求I所述的一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法，其特征在于将所述的PCR引物设计方法与实时荧光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子杂交或PCR-基因芯片技术联合使用。
5.一种用于检测基因变异的试剂盒，包括dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl体系、引物和探针；所述的引物包括正向引物和反向引物，其特征在于所述的正向引物包括正向PCR通用引物和附加于通用引物的5’端的一段与基因变异区域野生型完全互补6 20个碱基的寡核苷酸；所述的反向引物设计在变异基因的位置，且与变异基因完全互补。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测基因变异的试剂盒，其特征在于所述的TaqDNA聚合酶的用量为O. 5 IU/测试。
7.根据权利要求5所述的一种用于检测基因变异的试剂盒，其特征在于所述的Mg2+的浓度为O. 5^1. 5mM。
8.根据权利要求5所述的一种用于检测基因变异的试剂盒，其特征在于所述的Tris-KCl体系中KCl浓度为3(T50mM，甘油的质量浓度为10%。
9.根据权利要求5所述的一种用于检测基因变异的试剂盒，其特征在于所述的引物和探针的用量为各IOP/测试。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法及试剂盒，该引物设计方法包括在基因同源和保守的区域设计正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段与基因变异区域野生型完全互补6~20个碱基的寡核苷酸；在变异基因的位置设计与变异基因完全互补的反向引物；所述的试剂盒，包括dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl体系、引物和探针。本发明的引物设计方法易于设计、可控且扩增灵敏度高；本发明的试剂盒灵敏度高、特异性强、时间短、使用操作步骤少。
文档编号C12Q1/68GK102912031SQ201210448690
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者楼敬伟, 李丙亮, 谢彩霞 申请人:上海宝藤生物医药科技有限公司