用于PRRSV谱系1C变异株荧光RT-PCR检测的引物探针组、试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于微生物检测，具体涉及用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)谱系1c变异株荧光rt-pcr检测的引物对、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive respiratory syndromevirus，prrsv)是一种可以引起以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的猪繁殖与呼吸综合征的病毒，该病流行广，对养猪业危害严重。

2、prrsv属于单分子线状单股正链rna，全长约为15kb。prrsv分为两个基因型：欧洲型(基因i型)和北美型(基因ii型)。但由于prrsv病毒基因变异，导致对于新型变异株的检测方法不准确，且一般的检测方法无法区分出经典株和变异株，因此需要开发新的方法检测prrsv谱系变异株。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于prrsv谱系1c变异株荧光rt-pcr检测的引物对、试剂盒及其检测方法，能够快速、灵敏、高特异性地检测出prrsv谱系1c变异株。

2、根据本发明的一个方面，提出了用于prrsv谱系1c变异株荧光rt-pcr检测的引物探针组，包括：如seq id no.1和seq id no.2所示序列的引物对和如seq id no.3所示序列的探针；或如seq id no.4和seq id no.5所示序列的引物对和如seq id no.6所示序列的探针；或如seq id no.7和seq id no.8所示序列的引物对和如seq id no.9所示序列的探针；或如seq id no.10和seq id no.11所示序列的引物对和如seq id no.12所示序列的探针。

3、在本发明的一些实施方式中，所述的prrsv谱系1c变异株含有两个prrsv谱系1c变异株序列的基因核苷酸，其中，一个为全基因序列，genbank登录号为mw887655.1；另一个为测序获得的长度为603bp的序列，基因序列为(5’-3’)：

4、atgttggggaaatgcttgaccgcgggctgttgctcgcaattgctttttttgtggtgtatcgtgccgttctgttttgttgcgctcgtcaacgccaacaacagcagcagctcccatttacagttgatttataacctgacgatatgtgagctgaatggcacagattggctaaatgaaagatttgactgggcagtggagactttcgttatctttcctgtgttgactcatatcgtctcttacggtgcccttaccactagccattttcttgacacggtcggcttggccactgtgtccaccgccggatattatcacgggcggtatgtattgagtagcatttacgctgtctgtgccctggctgcgttgatttgcttcgccattaggttggcgaaaaattgcatgtcctggcgctactcatgcaccagatataccaattttctcctggatactaagggcaaactctaccgctggcggtcatccgtcattatagagaaagggggtaaagtggatgttgggggtcacttaatcgacctcaaaagagttgtgcttgatggttccgcggcaacccctgtaaccaagatttcagcggaacaatggggtcgtccatag。

5、根据本发明的另一个方面，提出了用于prrsv谱系1c变异株荧光rt-pcr检测的试剂盒，包括如上述引物探针组。

6、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂，用于提取和获得待测样本的rna或cdna模板。

7、在本发明的一些优选的实施方式中，所述核酸抽提试剂包括trizol试剂、depc水溶解rna沉淀。

8、根据本发明的再一个方面，提出了用于prrsv谱系1c变异株荧光rt-pcr检测的检测方法，包括以下步骤：

9、s1、获取待测样本的rna或cdna模板；

10、s2、加入如权利要求1所述的引物探针组，使用荧光rt-pcr方法进行检测。

11、在本发明的一些实施方式中，所述步骤s2的反应体系为：按照20μl反应体系，引物和探针浓度均为10μm，上下游引物用量为各0.8μl，探针用量为各0.4μl，模板用量为2μl。

12、在本发明的一些实施方式中，所述的方法为非诊断性和非治疗性方法。

13、在本发明的一些实施方式中，所述步骤s2的反应条件为：

14、模板为rna时反应条件为：50℃15min；95℃5min；95℃15s，58℃20s并收集荧光信号，40个循环；或

15、模板为cdna时反应条件为：50℃2min；95℃5min；95℃15s，58℃20s并收集荧光信号，40个循环。

16、在本发明的一些具体的实施方式中，有益效果至少包括：本发明实施例设计的引物探针组具有极高的特异性及灵敏度，能够准确检测prrsv谱系1c变异株，且对prrsv的欧洲型和美洲型经典株及其它类别病毒检测呈阴性，操作方便、灵敏度高、特异性强。

技术特征：

1.用于prrsv谱系1c变异株荧光rt-pcr检测的引物探针组，其特征在于，包括：如seqid no.1和seq id no.2所示序列的引物对和如seq id no.3所示序列的探针；或

2.用于prrsv谱系1c变异株荧光rt-pcr检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物探针组中的至少一种。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂，用于提取和获得待测样本的rna或cdna模板。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸抽提试剂包括trizol试剂、depc水溶解rna沉淀。

5.用于prrsv谱系1c变异株荧光rt-pcr检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s2的反应体系为：按照20μl反应体系，引物和探针浓度均为10μm，上下游引物用量为各0.8μl，探针用量为各0.4μl，模板用量为2μl。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s2的反应条件为：

技术总结
本发明涉及用于PRRSV谱系1C变异株荧光RT‑PCR检测的引物探针组、试剂盒及其检测方法。具体地，本发明提供用于PRRSV谱系1C变异株荧光RT‑PCR检测的引物探针组，包括：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物对和如SEQ ID NO.3所示序列的探针；或如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列的引物对和如SEQ IDNO.6所示序列的探针；或如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对和如SEQ ID NO.9所示序列的探针；或如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列的引物对和如SEQ ID NO.12所示序列的探针。本发明的引物探针组以及RT‑PCR检测方法，能够快速、灵敏、高特异性地检测出PRRSV谱系1C变异株。

技术研发人员：薛俊欣,朱忠武,冯之航,蒋静,李健,熊炜,蔡一村,张强,王艳
受保护的技术使用者：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12