一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的lamp引物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、试剂盒及方法，是通过肺炎克雷伯氏菌tyrB基因序列设计LAMP引物，建立适用于临床样品检测、特异性强、灵敏度高的鼠肺炎克雷伯氏菌可视化检测方法；可通过观测绿色荧光的有无快速准确的检测出肺炎克雷伯氏菌的存在，最低检测限为5.6拷贝数/反应。本发明设计和筛选的4条引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性，适合基层现场应用。
【专利说明】-种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学微生物检测【技术领域】，涉及一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP 引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌为革兰氏阴性、不运动型、有荚膜、乳酸发酵、兼性厌氧的杆状细 菌。肺炎克雷伯氏菌通常寄居在大小鼠和其他动物的肠道。作为机会致病菌，肺炎克雷伯 氏菌一旦进入呼吸道，即可感染大小鼠，造成严重肺部损伤，并且该菌在耐抗生素裸鼠中有 取代其他细菌的更强的生长趋势，为实验用啮齿动物的常见健康监控指标之一。
[0003]目前常用的肺炎克雷伯氏菌检测方法包括使用监测拭子直接铺板法及显色培养 基法和常规PCR法/荧光定量PCR法，均可以有效地检测。但细菌培养法较其他方法存在 难以标准化、耗时长，培养基、操作步骤或培养条件在不同实验室差别较大等缺点，故结果 可能不一致或出现假阴/阳性。常规PCR法和荧光定量PCR法，需经过变性、退火、延伸，力口 上DNA提取整个过程大概需要2?4个小时才能出结果，并且需要精密昂贵的仪器和试剂， 对基层开展快速简便的分子诊断不利。
[0004]Notomi等人于2000年发明环介导等温扩增（LAMP)技术，经过逐步改进，该技术借 助6条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，可在等温条件下快速、高特异和灵 敏的扩增靶序列。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、试剂盒及方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] -种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物，包括以下2对引物：外引物F3和B3以 及内引物FIP和BIP;FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ. ID.N0. 2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0. 4所 /_J、i〇
[0008] -种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP试剂盒，该试剂盒包括40iimol.I/1的 FIP1. 0iiL，40iimol.I71 的BIP1. 0iiL，10iimol.I/1 的F30. 5iiL以及 10iimol.I71 的 B30. 5iiL;F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所 示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 3所示，B3的核 苷酸序列如SEQ.ID.NO. 4所示。
[0009] 所述试剂盒还包括2X反应缓冲液12. 5iiL，8U/iiLBst聚合酶1iiL，25mMdNTP 1.5iiL以及荧光染料liiL。
[0010] 所述荧光染料为质量分数〇. 5%的钙黄绿素水溶液。
[0011] 一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，包括以下步骤：
[0012] 1)提取待检测对象（例如大鼠、小鼠）的DNA;
[0013] 2)将以下组份进行混合，构建包括2对引物F3和B3以及FIP和BIP的25iiLLAMP 反应体系：
[0014] 2\反应缓冲液12.51^，4011111〇1.171的卩1?1.0111，4011111〇1.17 1的81?1.0111， 10iimol.I71 的F30. 5iiL，10iimol.I71 的B30. 5iiL，8U/iiLBst聚合酶 1iiL，25mMdNTP 1. 5yL，待检测对象的DNA2yL，荧光染料1yL，超纯水补足至25yL;FIP的核苷酸序列 如SEQ.ID.NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示，F3的核苷酸序列如SEQ. ID.NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 4所示；
[0015] 3)将LAMP反应体系在63°C加热40min，然后在85°C加热5min，反应完成；
[0016] 4)待反应完成后通过以下方式进行结果的判定：
[0017] 反应完成后观察LAMP反应体系是否有颜色的变化，若LAMP反应体系颜色发生变 化则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到肺炎克雷伯氏菌；若LAMP反应体系颜色未发 生变化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到肺炎克雷伯氏菌。
[0018] 所述待检测对象的DNA的提取方法为：
[0019] 将待检测对象的血液、组织液或化脓液接种于肉汤培养基中，然后在37°C条件下 培养24h得菌液，取菌液离心，将离心得到的上清用DNA试剂盒提取DNA。
[0020] 在检测时还分别设立阳性对照和阴性对照，以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为阳性 对照，以超纯水为阴性对照；在进行结果的判定时，还与阳性对照和阴性对照比较，若待检 测对象所对应的LAMP反应体系以及阳性对照所对应的LAMP反应体系均呈绿色，则判定待 检测对象的检测结果为阳性反应，若待检测对象所对应的LAMP反应体系以及阴性对照所 对应的LAMP反应体系均呈橘黄色，则判定待检测对象的检测结果为阴性反应。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0022] 本发明采用肺炎克雷伯氏菌tyrB基因作为检测目标并合成LAMP引物，实现了对 肺炎克雷伯氏菌简便、快捷、准确的检测；该基因经NCBI BLAST搜索后，在肺炎克雷伯氏菌 种属间变异率低且兼顾不同血清型之间的保守序列，与其他种属细菌的同源性非常低，因 此可以作为通用性基因检测肺炎克雷伯氏菌。
[0023] 本发明提供的检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特异性强：所检测的阴性对 照和大小鼠基因组均无阳性结果。
[0024] 本发明提供的检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其检测灵敏度高：常规PCR检 测方法灵敏度为l〇〇pg/reaction(100copy number/reaction)数量级，采用本发明检测方 法，检测下限为13. 5fg/反应（5. 6拷贝数/反应）
[0025] 本发明提供的检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其检测迅速、出结果方便：常 规PCR整个过程在2?4个小时才能出结果，荧光定量PCR也需要1?1.5个小时，本发明 提供的检测方法在约50分钟即可出现阳性结果。并且操作简便，对仪器要求低，仅需要普 通水浴锅，并可以通过染料直接观测结果，省去了电泳的步骤，可在基层检测鼠肺炎克雷伯 氏菌的实践中有广泛的应用前景，是一种为实验动物部门简便、快捷、准确的检测鼠肺炎克 雷伯氏菌的方法，并且适合基层使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为阳性反应和阴性反应的颜色特异性示意图；
[0027] 图2为LAMP特异性实验结果示意图；
[0028] 图3为梯度稀释后的LAMP检测结果示意图；
[0029] 图中：P0S表示阳性对照的检测结果，K.p表示待检测对象（感染肺炎克雷伯 氏菌）的检测结果，Kp表示肺炎克雷伯氏菌基因组DNA的检测结果，Sa表示金黄色葡 萄球菌基因组DNA的检测结果，H 20表示阴性对照的检测结果，P. a表示绿脓杆菌基因组 DNA的检测结果，Rat表示大鼠基因组DNA的检测结果，Mouse表示小鼠基因组DNA的检 测结果，a表不5. 6X 106copies/li L的检测结果，b表不5. 6X 105copies/li L的检测结 果，c表不5. 6X 104copies/li L的检测结果，d表不5. 6X 103copies/li L的检测结果，e 表示5. 6X 102copies/ ii L的检测结果，f表示5. 6X lOcopies/ ii L的检测结果，g表示 5. 6copies/ii L的检测结果，h表不5. 6X KTicopies/ii L的检测结果。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限 定。
[0031] 本发明公开了一种检测实验用鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，该检测方法基于 环介导等温扩增来进行的。
[0032] 本发明针对肺炎克雷伯氏菌tyrB基因（基因登录号AF074934)，设计了包括外引 物、内引物的特异性引物。只需在建立的LAMP反应体系加入样品即可通过观测绿色荧光的 有无快速准确的检测出肺炎克雷伯氏菌的存在，最低检测限为5. 6拷贝数/反应，为快速检 测大小鼠肺炎克雷伯氏菌提供了一个适合基层的便捷方法。
[0033] 1、引物设计与合成：
[0034] 考虑到检测的特异性和准确性，采用肺炎克雷伯氏菌tyrB基因作为检测目标并 合成LAMP引物，这是由于tyrB基因经NCBI BLAST搜索后，在肺炎克雷伯氏菌种属间变异 率低且兼顾不同血清型之间的保守序列，与其他种属细菌的同源性非常低，因此可以作为 通用性基因检测肺炎克雷伯氏菌。
[0035] 采用引物设计软件Primer Explorer 4. 0,针对肺炎克雷伯氏菌tyrB基因的保守 区设计了 4条LAMP引物，包括正向/反向内引物FIP/BIP，正向/反向外引物F3/B3，所述 引物与tyrB(基因登录号：AF074934)基因150?333位的核酸序列的一部分或其互补链 互补。具体的引物序列见表1。
[0036] 表1 LAMP方法检测鼠肺炎克雷伯氏菌用引物序列
[0037]
【权利要求】
1. 一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物，其特征在于：包括以下2对引物：外引物 F3和B3以及内引物FIP和BIP ;FIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，BIP的核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 2所示，F3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4 所示。
2. -种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括 40 ii mol ? I71 的 FIP 1. 0 ii L，40 ii mol ? I71 的 BIP 1. 0 y L，10 y mol ? I71 的 F3 0? 5 y L 以 及lOiimol ? I71的B3 0. 5iiL ;F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，FIP的核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，F3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
3. 如权利要求2所述一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试 剂盒还包括2 X反应缓冲液12. 5 ii L，8U/ ii L Bst聚合酶1 ii L，25mM dNTP 1. 5 ii L以及荧 光染料1 y L。
4. 如权利要求3所述一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述荧 光染料为质量分数〇. 5%的钙黄绿素水溶液。
5. -种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 提取待检测对象的DNA ; 2) 将以下组份进行混合，构建包括2对引物F3和B3以及FIP和BIP的25 ii L LAMP反 应体系： 2 X 反应缓冲液 12.5 iiL，的 FIP 1.0 iiL，的 BIP 1.0 iiL， 10 ii mol ? I71 的 F3 0? 5 ii L，10 ii mol ? I71 的 B3 0? 5 ii L，8U/ ii L Bst 聚合酶 1 ii L，25mMdNTP 1. 5 y L，待检测对象的DNA 2 y L，荧光染料1 y L，超纯水补足至25 y L ;FIP的核苷酸序列 如SEQ. ID. NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，F3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示； 3) 将LAMP反应体系在63°C加热40min，然后在85°C加热5min，反应完成； 4) 待反应完成后通过以下方式进行结果的判定： 反应完成后观察LAMP反应体系是否有颜色的变化，若LAMP反应体系颜色发生变化则 为阳性反应，表明在待检测对象中检测到肺炎克雷伯氏菌；若LAMP反应体系颜色未发生变 化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到肺炎克雷伯氏菌。
6. 如权利要求5所述一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：所述待检 测对象的DNA的提取方法为： 将待检测对象的血液、组织液或化脓液接种于肉汤培养基中，然后在37°C条件下培养 24h得菌液，取菌液离心，将离心得到的上清用DNA试剂盒提取DNA。
7. 如权利要求5所述一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：在检测 时还分别设立阳性对照和阴性对照，以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为阳性对照，以超纯水 为阴性对照；在进行结果的判定时，还与阳性对照和阴性对照比较，若待检测对象所对应的 LAMP反应体系以及阳性对照所对应的LAMP反应体系均呈绿色，则判定待检测对象的检测 结果为阳性反应，若待检测对象所对应的LAMP反应体系以及阴性对照所对应的LAMP反应 体系均呈橘黄色，则判定待检测对象的检测结果为阴性反应。
【文档编号】C12R1/22GK104328174SQ201410583258
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】师长宏, 路凡, 陈新雨, 张海, 赵勇, 白冰, 张彩勤 申请人:中国人民解放军第四军医大学