产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法和发酵工艺的制作方法
【专利摘要】产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法和发酵工艺，涉及一种基因工程菌株的制备方法和发酵工艺。是要解决现有益生菌中蛋氨酸和赖氨酸含量较低，未能有效提高饲料蛋白转化率的技术问题。制备方法：一、利用PCR从玉米种子胚乳中克隆高蛋氨酸基因片段；二、利用PCR从辣椒花药中克隆高赖氨酸基因片段；三、构建pHT43/Zein和pHT43/Cflr重组载体；四、将重组载体pHT43/Zein转入纳豆芽孢杆菌；五、再转入pHT43/Cflr；即完成。发酵工艺：一、菌种活化；二、种子培养液制备；三、摇瓶发酵；四、发酵罐发酵；即完成。用于生产蛋氨酸和赖氨酸。
【专利说明】产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法和发酵工艺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因工程菌株的制备方法和发酵工艺。
【背景技术】
[0002] 纳豆芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种，革兰阳性菌，好氧，有芽孢，极易成链。 只具有单层细胞外膜，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。在极 端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源胞子。是各种益生菌当中，对环境耐受力最 好可以直达小肠的菌种之一，口服后可改变动物肠道菌丛生态，帮助消化道机能正常化。可 以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫反应。并能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白 酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的 转化率。
[0003] 纳豆芽孢杆菌是一种重要的饲用益生菌，其菌种及发酵产物能够作为饲料添加剂 提升畜禽乳肉蛋的产量和品质。在畜禽生产中，蛋氨酸和赖氨酸是最重要的氨基酸，是饲料 成分中对畜禽生产最重要的影响因素，能有效地提高饲料蛋白转化率。益生菌中蛋氨酸和 赖氨酸含量较低，如能提高益生菌中蛋氨酸和赖氨酸的含量，将使益生菌营养更加丰富、更 好地提高饲料蛋白转化率，从而更有效地发挥益生菌的功用。但目前尚未建立提高益生菌 蛋氨酸和赖氨酸含量的生物技术，致使益生菌未能最佳地发挥其提高饲料转化率的功用， 因而有必要建立提高益生菌蛋氨酸和赖氨酸含量的生物技术，形成更有价值的益生菌新一 代产品。
【发明内容】
[0004] 本发明是要解决现有益生菌中蛋氨酸和赖氨酸含量较低，未能有效提高饲料蛋白 转化率的技术问题，提供产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法和发酵工艺。
[0005] 本发明产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，按以下步骤进行：
[0006] -、利用PCR从玉米种子胚乳中克隆高蛋氨酸基因 Zein全长476bp片段；
[0007] 二、利用PCR从辣椒花药中克隆高赖氨酸基因 Cflr全长720bp片段；
[0008] 三、利用枯草芽孢杆菌特异表达载体pHT43分别构建pHT43/Zein和pHT43/Cflr 基因重组载体；
[0009] 四、以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳豆芽孢杆菌原生质体，将重组载体PHT43/ Zein转入纳豆芽孢杆菌原生质体，然后于转化培养液中25°C培养24小时，然后收集菌体， 涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100 μ g/mL氨苄青霉素和5 μ g/mL氯霉素， 进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行液态培养，每管LB培养基中接种一个 单菌落，于37°C培养24小时，然后对每管菌液采用Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs， 采用SYBR法荧光定量PCR检测Zein基因 mRNA的含量，对荧光定量PCR的结果进行分析， 选择Zein基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法检测蛋氨酸的含量，检测出蛋氨酸的 重组菌为稳定表达商蛋氣酸基因的纳?芽抱杆菌；
[0010] 五、以步骤四获得的稳定表达高蛋氨酸基因的纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳 豆芽孢杆菌原生质体，然后将pHT43/Cflr转入纳豆芽孢杆菌原生质体，于转化培养液中 25°C培养24小时，然后收集菌体，涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100 μ g/ mL氨苄青霉素和5 μ g/mL氯霉素，进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行 液态培养，每管LB培养基中接种一个单菌落，于37°C培养24小时，然后对每管菌液采用 Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs，采用SYBR法荧光定量PCR检测Cf Ir基因 mRNA的含 量，对荧光定量PCR的结果进行分析，选择Cf Ir基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法 检测赖氨酸的含量，检测出赖氨酸的重组菌为稳定表达高蛋氨酸基因和高赖氨酸基因的纳 豆芽孢杆菌；
[0011] 步骤四和步骤五中转化培养液配方：每升转化培养液含5gK2HP04、6gKH 2P04、 2gNa2S04、lg 柠檬酸钠、0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和2g谷氨酸钠，pH7. 5。
[0012] 步骤四荧光定量PCR中作为对照的16SrRNAPCR引物序列为：
[0013] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0014] 下游引物：5' -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3' ；
[0015] 步骤四荧光定量PCR中检测Zein基因的引物序列为：
[0016] 上游引物：5' -CCGTCTCGCAGATTAT-3'，
[0017] 下游引物：5' -GCAGCACCAACAAAGG-3' ；
[0018] 步骤五荧光定量PCR中作为对照的16SrRNAPCR引物序列为：
[0019] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0020] 下游引物：5' -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3' ；
[0021] 步骤五荧光定量PCR中检测Cflr基因的引物序列为：
[0022] 上游引物：5 ' -GAAAGAAATGGTGGGAC-3 '，
[0023] 下游引物：5 ' -CTACAGCAGCAACAGC-3 '。
[0024] 上述产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的发酵工艺，按以下步骤进行：
[0025] -、菌种活化：将上述获得的稳定表达商蛋氣酸基因和商赖氣酸基因的纳?芽抱 杆菌转接到斜面培养基，在37°C培养24小时，得到活化的菌种；
[0026] 二、种子培养液制备：将活化的菌种接种到LB液体培养基，于37°C、200rpm条件下 震荡培养13h，得种子液；
[0027] 三、摇瓶发酵：将种子液按体积百分比5%的接种量接种至LB液体培养基，于 37°C、200rpm条件下震荡培养13h，得发酵液；
[0028] 四、发酵罐发酵：
[0029] 将豆柏和玉米粉分别粉碎至200目，然后将豆柏和玉米粉按照质量比1:2混合，将 混合粉末和步骤三获得的发酵液进行预混，得预混料，并添加尿素和硫乙醇酸钠，然后添加 复合胰酶，每小时按发酵罐培养基体积的〇. 01 %添加乳糖进行动态补料，发酵时间为24小 时，即完成发酵。
[0030] 本发明获得转高蛋氨酸和赖氨酸纳基因纳豆芽孢杆菌及其发酵工艺，发酵代谢产 物蛋氨酸和赖氨酸含量分别提高40%和60%以上。
[0031] 纳豆芽孢杆菌具有很强的利用小分子氮源和碳源合成限制性必需氨基酸、多种生 长调节因子和维生素的能力，以添加剂形式喂饲能够显著提高畜禽的生产性能。
[0032] 本发明方法有效提高了以纳豆芽孢杆菌作为益生菌发酵时代谢产物的蛋氨酸和 赖氨酸含量，显著提高了纳豆芽孢杆菌发酵产品的营养价值，菌体发酵代谢产物作为饲料 添加剂显著提高畜禽的生产性能。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为实验1中稳定表达商蛋氣酸基因和商赖氣酸基因的纳?芽抱杆菌质粒经 XbaI和SmaI双酶切后的电泳图；图2为实验1中发酵液上清的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0034] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0035] 一：本实施方式产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，按 以下步骤进行：
[0036] -、利用PCR从玉米种子胚乳中克隆高蛋氨酸基因 Zein全长476bp片段；
[0037] 二、利用PCR从辣椒花药中克隆高赖氨酸基因 Cflr全长720bp片段；
[0038] 三、利用枯草芽孢杆菌特异表达载体pHT43分别构建pHT43/Zein和pHT43/Cflr 基因重组载体；
[0039] 四、以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳豆芽孢杆菌原生质体，将重组载体pHT43/ Zein转入纳豆芽孢杆菌原生质体，然后于转化培养液中25°C培养24小时，然后收集菌体， 涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100 μ g/mL氨苄青霉素和5 μ g/mL氯霉素， 进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行液态培养，每管LB培养基中接种一个 单菌落，于37°C培养24小时，然后对每管菌液采用Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs， 采用SYBR法荧光定量PCR检测Zein基因 mRNA的含量，对荧光定量PCR的结果进行分析， 选择Zein基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法检测蛋氨酸的含量，检测出蛋氨酸的 重组菌为稳定表达商蛋氣酸基因的纳?芽抱杆菌；
[0040] 五、以步骤四获得的稳定表达高蛋氨酸基因的纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳 豆芽孢杆菌原生质体，然后将pHT43/Cflr转入纳豆芽孢杆菌原生质体，于转化培养液中 25°C培养24小时，然后收集菌体，涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100 μ g/ mL氨苄青霉素和5 μ g/mL氯霉素，进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行 液态培养，每管LB培养基中接种一个单菌落，于37°C培养24小时，然后对每管菌液采用 Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs，采用SYBR法荧光定量PCR检测Cf Ir基因 mRNA的含 量，对荧光定量PCR的结果进行分析，选择Cf Ir基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法 检测赖氨酸的含量，检测出赖氨酸的重组菌为稳定表达高蛋氨酸基因和高赖氨酸基因的纳 豆芽孢杆菌；
[0041] 步骤四和步骤五中荧光定量PCR中作为对照的16SrRNAPCR引物序列为：
[0042] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0043] 下游引物：5' -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3' ；
[0044] 步骤四荧光定量PCR中检测Zein基因的引物序列为：
[0045] 上游引物：5 ' -CCGTCTCGCAGATTAT-3，，
[0046] 下游引物：5' -GCAGCACCAACAAAGG-3,；
[0047] 步骤五荧光定量PCR中检测Cflr基因的引物序列为：
[0048] 上游引物：5 ' -GAAAGAAATGGTGGGAC-3，，
[0049] 下游引物：5 ' -CTACAGCAGCAACAGC-3，。
[0050] 所述的纳豆芽孢杆菌购自广州农冠生物科技有限公司。
【具体实施方式】 [0051] 二：本实施方式与一不同的是：步骤一中PCR引物为： Fl :5' -GCTCTAGAAGGAAGCAAGGACACCACC-3'，Rl :5' -TCCCCCGGGTCTAGAATGCAGCACCAAC-3'， PCR反应条件为：94°C预变性lmin，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共30个循 环，72°C再延伸lOmin。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0052] 三：本实施方式与一或二不同的是：步骤二中PCR引 物为：F2 :5, -GCTCTAGAAAAAGATGGGTTGTGGGGAAT-3，，R2 :5, -TCCCCCGGGTAAACTAATAAATAGCC (：1'(：1'1^〇：-3'，？〇?循环反应条件为941：预变性308,941：变性308,551：退火308,721：延伸 3min，共30个循环，72°C再延伸lOmin。其它与一或二相同。
【具体实施方式】 [0053] 四：本实施方式与一至三之一不同的是：步骤三中 pHT43/Zein的构建方法为：用XbaI和SmaI分别对基因 Zein和载体pHT43进行双酶切，然 后连接酶切产物，获得重组载体pHT43/Zein。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0054] 五：本实施方式与一至四之一不同的是：步骤三中 pHT43/Cf Ir的构建方法为：用XbaI和SmaI分别对基因 Cf Ir和载体pHT43进行双酶切，然 后连接酶切产物，获得重组载体pHT43/Cflr。其它与一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0055] 六：本实施方式与一至五之一不同的是：步骤四和 步骤五中转化培养液配方：每升转化培养液含5gK 2HP04、6gKH2P04、2gNa2S0 4、lg柠檬酸钠、 0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和 2g 谷氨酸钠， pH7. 5。其它与一至五之一相同。
【具体实施方式】 [0056] 七：本实施方式产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的发酵工艺，按 以下步骤进行：
[0057] -、菌种活化：将获得的稳定表达商蛋氣酸基因和商赖氣酸基因的纳?芽抱杆菌 转接到斜面培养基，在37°C培养24小时，得到活化的菌种；
[0058] 二、种子培养液制备：将活化的菌种接种到LB液体培养基，于37°C、200rpm条件下 震荡培养13h，得种子液；
[0059] 三、摇瓶发酵：将种子液按体积百分比5%的接种量接种至LB液体培养基，于 37°C、200rpm条件下震荡培养13h，得发酵液；
[0060] 四、发酵罐发酵：
[0061] 将豆柏和玉米粉分别粉碎至200目，然后将豆柏和玉米粉按照质量比1:2混合，将 混合粉末和步骤三获得的发酵液进行预混，得预混料，并添加尿素和硫乙醇酸钠，然后添加 复合胰酶，每小时按发酵罐培养基体积的〇. 01 %添加乳糖进行动态补料，发酵时间为24小 时，即完成发酵。
[0062] 步骤四所述复合胰酶购买自重庆奥力生物制药有限公司，商品名称为胰酶，按干 燥品计算，每Ig胰酶中含胰蛋白酶不得少于1800活力单位，胰淀粉酶不得少于21000活力 单位，胰脂肪酶不得少于12000活力单位。
[0063] LB液体培养基由10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl和蒸馏水组成。 [0064]
【具体实施方式】八：本实施方式与【具体实施方式】七不同的是：步骤一所述斜面培养 基为营养琼脂培养基，包括蛋白胨l〇g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15?20g、氨苄青霉素 l〇mg、氯霉素5mg和蒸馈水IOOOmL, 121°C高压灭菌15min。其它与【具体实施方式】七相同。 [0065]
【具体实施方式】九：本实施方式与【具体实施方式】七或八不同的是：步骤四中混合粉 末的质量为发酵液质量的10%。其它与【具体实施方式】七或八相同。
【具体实施方式】 [0066] 十：本实施方式与七至九之一不同的是：步骤四中尿 素的质量为预混料质量的0. 05%，硫乙醇酸钠的质量为预混料质量的0. 05%，复合胰酶的 质量为预混料质量的〇. 3%。其它与七至九之一相同。
[0067] 实验 1 :
[0068] 本实验产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，按以下步骤进行：
[0069] -、利用PCR从玉米种子胚乳中克隆高蛋氨酸基因 Zein全长476bp片段；
[0070] 步骤一中 PCR 引物为：F1 :5' -GCTCTAGAAGGAAGCAAGGACACCACC-3'，Rl :5' -TCCCCC GGGTCTAGAATGCAGCACCAAC-3'，PCR 反应条件为：94°C预变性 lmin，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸lmin，共30个循环，72°C再延伸lOmin。
[0071] 二、利用PCR从辣椒花药中克隆高赖氨酸基因 Cflr全长720bp片段；
[0072] 步骤二中 PCR 引物为：F2 :5'-GCTCTAGAAAAAGATGGGTTGTGGGGAAT-3'，R2 :5'-TCCCC CGGGTAAACTAATAAATAGCCCTCTTCCC-3'，PCR 循环反应条件为 94°C预变性 30s，94°C变性 30s， 55°C退火30s，72°C延伸3min，共30个循环，72°C再延伸10min。
[0073] 三、用XbaI和SmaI分别对基因 Zein和载体pHT43进行双酶切，然后连接酶切产 物，获得重组载体pHT43/Zein ;用XbaI和SmaI分别对基因 Cflr和载体pHT43进行双酶切， 然后连接酶切产物，获得重组载体pHT43/Cflr ;
[0074] 四、以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳豆芽孢杆菌原生质体，将重组载体pHT43/ Zein转入纳豆芽孢杆菌原生质体，然后于转化培养液中25°C培养24小时，然后收集菌体， 涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100 μ g/mL氨苄青霉素和5 μ g/mL氯霉素， 进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行液态培养，每管LB培养基中接种一个 单菌落，于37°C培养24小时，然后对每管菌液采用Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs， 采用SYBR法荧光定量PCR检测Zein基因 mRNA的含量，对荧光定量PCR的结果进行分析， 选择Zein基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法检测蛋氨酸的含量，检测出蛋氨酸的 重组菌为稳定表达商蛋氣酸基因的纳?芽抱杆菌；
[0075] 步骤四中转化培养液配方：每升转化培养液含5gK2HP04、6gKH 2P04、2gNa2S04、lg柠 檬酸钠、0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和 2g 谷 氨酸钠，pH7. 5。
[0076] 步骤四荧光定量PCR中作为对照的16SrRNAPCR引物序列为：
[0077] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0078] 下游引物：5, -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3,；
[0079] 步骤四荧光定量PCR中检测Zein基因的引物序列为：
[0080] 上游引物：5 ' -CCGTCTCGCAGATTAT-3，，
[0081] 下游引物：5' -GCAGCACCAACAAAGG-3,；
[0082] 五、以步骤四获得的稳定表达高蛋氨酸基因的纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳 豆芽孢杆菌原生质体，然后将pHT43/Cflr转入纳豆芽孢杆菌原生质体，于转化培养液中 25°C培养24小时，然后收集菌体，涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100 μ g/ mL氨苄青霉素和5 μ g/mL氯霉素，进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行 液态培养，每管LB培养基中接种一个单菌落，于37°C培养24小时，然后对每管菌液采用 Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs，采用SYBR法荧光定量PCR检测Cf Ir基因 mRNA的含 量，对荧光定量PCR的结果进行分析，选择Cf Ir基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法 检测赖氨酸的含量，检测出赖氨酸的重组菌为稳定表达高蛋氨酸基因和高赖氨酸基因的纳 豆芽孢杆菌；
[0083] 步骤四中转化培养液配方：每升转化培养液含5gK2HP04、6gKH 2P04、2gNa2S04、lg柠 檬酸钠、0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和 2g 谷 氨酸钠，pH7. 5。
[0084] 步骤五荧光定量PCR中作为对照的16SrRNAPCR引物序列为：
[0085] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0086] 下游引物：5, -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3,；
[0087] 步骤五荧光定量PCR中检测Cflr基因的引物序列为：
[0088] 上游引物：5 ' -GAAAGAAATGGTGGGAC-3 '，
[0089] 下游引物：5' -CTACAGCAGCAACAGC-3,；
[0090] 对本实验获得的稳定表达商蛋氣酸基因和商赖氣酸基因的纳?芽抱杆菌质粒经 XbaI和SmaI双酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，获得476bpZein和720bpCflr 基因片段特异性条带，说明该重组菌已同时转入Zein和Cflr基因。图1中M为DNA分子 质量标准，泳道1为稳定表达商蛋氣酸基因和商赖氣酸基因的纳?芽抱杆菌质粒经XbaI和 SmaI双酶切获得的Zein和Cf Ir基因片段，泳道2为稳定表达高蛋氨酸基因和高赖氨酸基 因的纳豆芽孢杆菌质粒经SmaI酶切获得的片段。
[0091] 上述稳定表达高蛋氨酸基因和高赖氨酸基因的纳豆芽孢杆菌的发酵工艺，按以下 步骤进行：
[0092] -、菌种活化：将上述获得的稳定表达商蛋氣酸基因和商赖氣酸基因的纳?芽抱 杆菌转接到斜面培养基，在37°C培养24小时，得到活化的菌种；
[0093] 二、种子培养液制备：将活化的菌种接种到LB液体培养基，于37°C、200rpm条件下 震荡培养13h，得种子液；
[0094] 三、摇瓶发酵：将种子液按体积百分比5%的接种量接种至LB液体培养基，于 37°C、200rpm条件下震荡培养13h，得发酵液；
[0095] 四、发酵罐发酵：
[0096] 将豆柏和玉米粉分别粉碎至200目，然后将豆柏和玉米粉按照质量比1:2混合，将 混合粉末和步骤三获得的发酵液进行预混，得预混料，并添加尿素和硫乙醇酸钠，然后添加 复合胰酶，每小时按发酵罐培养基体积的〇. 01 %添加乳糖进行动态补料，发酵时间为24小 时，即完成发酵。步骤四中混合粉末的质量为发酵液质量的10%，尿素的质量为预混料质 量的0. 05%，硫乙醇酸钠的质量为预混料质量的0. 05%，复合胰酶的质量为预混料质量的 0· 3%。
[0097] 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳对发酵液上清进行目的蛋白鉴定，如图2所示，发酵液 上清可见16kDa Zein和24kDa Cflr蛋白特异性条带，说明该重组菌已同时表达Zein和 Cflr蛋白。获得转高蛋氨酸和赖氨酸基因纳豆芽孢杆菌。图2中泳道M为蛋白质分子质量 标准；泳道1为纳豆芽孢杆菌发酵液上清；泳道2为转pHT43纳豆芽孢杆菌发酵液上清；泳 道3、4、5为转pHT43/Cflr和pHT43/Zein纳豆芽孢杆菌发酵液上清。
[0098] 步骤四所述复合胰酶购买自重庆奥力生物制药有限公司，商品名称为胰酶，按干 燥品计算，每Ig胰酶中含胰蛋白酶不得少于1800活力单位，胰淀粉酶不得少于21000活力 单位，胰脂肪酶不得少于12000活力单位。
[0099] 步骤一所述斜面培养基为营养琼脂培养基，包括蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠 5g、琼脂15?20g、氨节青霉素10mg、氯霉素5mg和蒸馈水IOOOmL, 121°C高压灭菌15min。
[0100] LB液体培养基由10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl和蒸馏水组成。
[0101] 所述的纳豆芽孢杆菌购自广州农冠生物科技有限公司。
[0102] 本实验的发酵代谢产物赖氨酸由菌种发酵前发酵液干物质含量47. 45mg/g提高 至菌种发酵后发酵液干物质含量78. 73mg/g，提高了 65. 92%，发酵代谢产物蛋氨酸含量由 菌种发酵前发酵液干物质含量33. 82mg/g提高至菌种发酵后发酵液干物质含量49. 51mg/ g，提高了 46. 39%。赖氨酸和蛋氨酸分别占蛋白质20种氨基酸的二十分之一，以上比例的 提高对于将纳豆芽孢杆菌作为添加剂应用于畜禽生产具有重要价值。
[0103] 纳豆芽孢杆菌具有很强的利用小分子氮源和碳源合成限制性必需氨基酸、多种生 长调节因子和维生素的能力，以添加剂形式喂饲能够显著提高畜禽的生产性能。
[0104] 本方法有效提高了以纳豆芽孢杆菌作为益生菌发酵时代谢产物的蛋氨酸和赖氨 酸含量，显著提高了纳豆芽孢杆菌发酵产品的营养价值，菌体发酵代谢产物作为饲料添加 剂显著提高畜禽的生产性能。
【权利要求】
1. 产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进 行： 一、 利用PCR从玉米种子胚乳中克隆高蛋氨酸基因 Zein全长476bp片段； 二、 利用PCR从辣椒花药中克隆高赖氨酸基因 Cflr全长720bp片段； 三、 利用枯草芽孢杆菌特异表达载体PHT43分别构建pHT43/Zein和pHT43/Cflr基因 重组载体； 四、 以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳豆芽孢杆菌原生质体，将重组载体pHT43/Zein 转入纳豆芽孢杆菌原生质体，然后于转化培养液中25°C培养24小时，然后收集菌体，涂布 LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加100 μ g/mL氨苄青霉素和5 μ g/mL氯霉素，进行 阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行液态培养，每管LB培养基中接种一个单菌 落，于37°C培养24小时，然后对每管菌液采用Trizol法提取RNA并反转录为cDNAs，采用 SYBR法荧光定量PCR检测Zein基因 mRNA的含量，对荧光定量PCR的结果进行分析，选择 Zein基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法检测蛋氨酸的含量，检测出蛋氨酸的重组 菌为稳定表达商蛋氣酸基因的纳?芽抱杆菌； 五、 以步骤四获得的稳定表达高蛋氨酸基因的纳豆芽孢杆菌为出发菌株，制备纳豆芽 孢杆菌原生质体，然后将pHT43/Cflr转入纳豆芽孢杆菌原生质体，于转化培养液中25°C培 养24小时，然后收集菌体，涂布LB培养基平板，所述LB培养基平板中添加 100 μ g/mL氨苄 青霉素和5 μ g/mL氯霉素，进行阳性菌株的筛选，挑取单菌落于LB培养基中进行液态培养， 每管LB培养基中接种一个单菌落，于37°C培养24小时，然后对每管菌液采用Trizol法提 取RNA并反转录为cDNAs，采用SYBR法荧光定量PCR检测Cflr基因 mRNA的含量，对荧光 定量PCR的结果进行分析，选择Cflr基因扩增阳性的菌种，采用高效液相色谱法检测赖氨 酸的含量，检测出赖氨酸的重组菌为稳定表达高蛋氨酸基因和高赖氨酸基因的纳豆芽孢杆 菌； 步骤四和步骤五中荧光定量PCR中作为对照的16SrRNAPCR引物序列为： 上游引物：5' -GCGTGAGTGATGAAGGITT-3'， 下游引物：5' -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3' ； 步骤四荧光定量PCR中检测Zein基因的引物序列为： 上游引物：5' -CCGTCTCGCAGATTAT-3'， 下游引物：5' -GCAGCACCAACAAAGG-3' ； 步骤五荧光定量PCR中检测Cflr基因的引物序列为： 上游引物：5' -GAAAGAAATGGTGGGAC-3'， 下游引物：5' -CTACAGCAGCAACAGC-3'。
2. 根据权利要求1所述的产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，其特征在于 步骤一中 PCR 引物为：F1 :5' -GCTCTAGAAGGAAGCAAGGACACCACC-3'，R1 :5' -TCCCCCGGGTCTAG AATGCAGCACCAAC-3'，PCR 反应条件为：94°C预变性 lmin，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C 延伸lmin，共30个循环，72°C再延伸lOmin。
3. 根据权利要求1所述的产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，其特征在于 步骤二中 PCR 引物为：F2 :5' -GCTCTAGAAAAAGATGGGTTGTGGGGAAT-3'，R2 :5' -TCCCCCGGGTAA ACTAATAAATAGCCCTCTTCCC-3'，PCR 循环反应条件为 94°C预变性 30s，94°C变性 30s，55°C退 火30s，72°C延伸3min，共30个循环，72°C再延伸lOmin。
4. 根据权利要求1所述的产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，其特征在于 步骤三中pHT43/Zein的构建方法为：用Xbal和Smal分别对基因 Zein和载体pHT43进行 双酶切，然后连接酶切产物，获得重组载体pHT43/Zein。
5. 根据权利要求1所述的产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，其特征在于 步骤三中pHT43/Cflr的构建方法为：用Xbal和Smal分别对基因 Cflr和载体pHT43进行 双酶切，然后连接酶切产物，获得重组载体pHT43/Cf lr。
6. 根据权利要求1所述的产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的制备方法，其特征在于 步骤四和步骤五中转化培养液配方：每升转化培养液含5gK 2HP04、6gKH2P04、2gNa2S0 4、lg柠 檬酸钠、0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和 2g 谷 氨酸钠，pH7. 5。
7. 产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的发酵工艺，其特征在于具体工艺按以下步骤进 行： 一、 菌种活化：将稳定表达商蛋氣酸基因和商赖氣酸基因的纳?芽抱杆菌转接到斜面 培养基，在37°C培养24小时，得到活化的菌种； 二、 种子培养液制备：将活化的菌种接种到LB液体培养基，于37°C、200rpm条件下震荡 培养13h，得种子液； 三、 摇瓶发酵：将种子液按体积百分比5 %的接种量接种至LB液体培养基，于37°C、 200rpm条件下震荡培养13h，得发酵液； 四、 发酵罐发酵： 将豆柏和玉米粉分别粉碎至200目，然后将豆柏和玉米粉按照质量比1:2混合，将混合 粉末和步骤三获得的发酵液进行预混，得预混料，并添加尿素和硫乙醇酸钠，然后添加复合 胰酶，每小时按发酵罐培养基体积的0. 01 %添加乳糖进行动态补料，发酵时间为24小时， 即完成发酵。
8. 根据权利要求7所述的产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的发酵工艺，其特征在 于步骤一所述斜面培养基为营养琼脂培养基，包括蛋白胨l〇g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂 15?20g、氨节青霉素10mg、氯霉素5mg和蒸馈水lOOOmL，121°C高压灭菌15min。
9. 根据权利要求7所述的产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的发酵工艺，其特征在于 步骤四中混合粉末的质量为发酵液质量的10%。
10. 根据权利要求7所述的产蛋氨酸和赖氨酸的基因工程菌株的发酵工艺，其特征 在于步骤四中尿素的质量为预混料质量的0. 05 %，硫乙醇酸钠的质量为预混料质量的 0. 05%，复合胰酶的质量为预混料质量的0. 3%。
【文档编号】C12P13/08GK104278006SQ201410583223
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】高学军, 刘营, 张双, 武彩霞, 骆超超, 娄丽, 李学琳, 潘洪宝, 孙喆 申请人:东北农业大学