专利名称：去除n－末端蛋氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及去除肽(包括蛋白质)或者其盐N-末端上选择性氧化的蛋氨酸残基的一种方法。
当在细胞内合成蛋白质时，其氨基末端总是被蛋氨酸占据，其与mRNA上的起始密码子即AμG相对应。然而，在自然条件下产生的成熟蛋白质分子通常不带有蛋氨酸残基，这是因为该残基已在随后的加工过程中被去除掉。
近来有关基因重组技术的发展已有可能使用微生物或者动物细胞如大肠杆菌制备有用的蛋白质。有些情况下，制备出的蛋白质仍保留有上述的蛋氨酸。例如，由大肠杆菌表达的人生长激素中，末端带有蛋氨酸的几乎为100％[Nature，293，408(1981)]，在干扰素-α中为50％[Journal ofInterferon Research，1，381(1981)]。由大肠杆菌表达而产生的非糖化人类白介素-2(rhIL-2)，除了该分子起始氨基酸残基为丙氨酸，与天然人类白介素-2相同，还发现第二分子在氨基末端带有蛋氨酸残基(Met-rhIL-2)。
Dixon报道当DL-丙氨酰(ananyl)甘氨酸与二羟乙酸，吡啶及乙酸铜反应时，可通过转氨基生成丙酮酰甘氨酸[Biochemistry Journal，92，661(1964)]。另外，Dixon报道将这样所得的丙酮酰甘氨酸与氨基硫脲反应可通过断裂酰胺键而产生甘氨酸[Biochemistry Journal，90，2C(1964)]。Dixon还报道将上述的化学反应用于假单胞杆菌属细胞色素C-551，可去除其N-末端谷氨酸[Biochemistry Journal，94，463(1965)]。
虽然，由Dixon报道的反应涉及去除合成的肽或者成熟蛋白质N-末端的氨基酸，但在以后的30多里年再未见到有关报道，即上述的化学反应可用于去除由基因重组技术制备的蛋白质N-末端上的蛋氨酸。
可以推测，在氨基末端带有或者不带有蛋氨酸两个分子之间在三维结构，生物活性及稳定性上可能不同，即使这两个分子是相同的蛋白质；如果氨基末端加上蛋氨酸则可能增加蛋白质的抗原性。这样建立一种相对简单并且有效的可选择性的去除氨基末端蛋氨酸的方法在工业应用中将是非常重要的。
对于解决这一问题的方法，过去有人建议可通过溴化氰(BrCN)裂解来去除蛋氨酸[Science，198，1056(1977)]；可是，由于该反应不仅可导致去除所得成熟蛋白质分子中其它的蛋氨酸，也可使蛋白质处于一种非常剧烈的化学反应中，所以到目前对于这个问题还没有找到满意的解决方法。
目前，还没有能找到一种方法，该方法能够有效的并选择性的去除各种肽或者蛋白质N-末端上的蛋氨酸。这个困难主要是因为很难找到一种化学反应，该反应可在不使终产物的肽或者蛋白质变性的温和条件下，去除N-末端上的蛋氨酸。特别是如去除用于医学的由基因重组技术制备的分子量比较大的蛋白质N-末端上的蛋氨酸，要求去除蛋氨酸后不能降低蛋白质的活性。如此，一般反应不能加热，而是在弱酸至弱碱溶液中进行。所以，目前由于该化学反应有许多限制，还未发现合适的反应条件。
本发明者在研究了如何采用一种方法，该方法能够选择性地去除由基因重组技术制备的蛋白质其N-末端上的蛋氨酸，从而制备出具有天然类型氨基酸序列的蛋白质后，发现将蛋白质中N-末端带有的额外的蛋氨酸去除掉的方法，具体的方法是将蛋白质中的蛋氨酸转变为α-二酮，再进一步使α-二酮与有机二胺反应，如此即可得到N-末端不带有蛋氨酸的肽或者蛋白质。本发明方法是将式(I)代表的带有蛋氨酸的肽或者蛋白质与作为α-二酮衍生物的二羟乙酸，能够给出过渡金属离子的硫酸铜及作为胺衍生物的吡啶进行转氨反应，并将蛋氨酸转化为α-二酮，随后将作为二胺衍生物的邻苯二胺与所得的α-二酮进行水解，去除蛋白质中的N-末端蛋氨酸，反应特点在于不降低肽或者蛋白质的活性。
随后进行了进一步的研究，使得本发明趋于完善。
在式(I)中，X既可以代表一种氨基酸残基，也可以代表具有两个或者更多氨基酸的肽链。X优选代表由基因重组技术制备出的部分蛋白质的肽链。另外，由多个氨基酸组成的肽链或者蛋白质既可以是糖化的也可以是非糖化的。
总之，本发明涉及(1)选择性地去除N-末端氧化的蛋氨酸残基的方法，其包括具有上述N-末端蛋氨酸残基的肽或者其盐与α-二酮衍生物反应，然后使所得的产物水解；(2)上述(1)的方法，其中N-末端具有选择性氧化蛋氨酸残基的肽为一由基因重组技术制备出的蛋白质；(3)在上述(2)的方法，其中由基因重组技术制备出的肽应至少有30个氨基酸残基。优选的一组肽是生长激素，神经营养蛋白-3，β-动物纤维素，甲状旁腺素或者白介素-2，每个肽在其N-末端都具有选择性氧化的蛋氨酸残基；(4)在上述(1)的方法，其中α-二酮衍生物是在过渡金属离子存在的条件下参与反应的；(5)在上述(1)的方法，其中α-二酮衍生物是在碱存在的条件下参与反应的；(6)在上述(1)的方法，其中α-二酮衍生物是在过渡金属离子和碱存在的条件下参与反应的；(7)在上述(1)的方法，其中α-二酮衍生物是二羟乙酸或者其盐；(8)在上述(1)的方法，其中过渡金属离子是铜离子；(9)在上述(5)的方法，其中碱为吡啶；(10)在上述(1)的方法，其中水解是用碱来进行的；(11)在上述(10)的方法，其中碱为胺衍生物；(12)在上述(10)的方法，其中碱为二胺衍生物，或者为硫代-或者硒-氨基脲的衍生物；(13)在上述(12)的方法，其中二胺衍生物为邻苯二胺；(14)制备人生长激素或者其盐的方法，该方法包括将二羟乙酸或其盐在硫酸铜和吡啶存在的条件下与用基因重组技术制备的N-末端带有蛋氨酸的人类生长激素或其盐反应，然后再与邻苯二胺反应；(15)制备神经营养蛋白-3或其盐的方法，该方法包括将二羟乙酸或者其盐在硫酸铜和吡啶存在的条件下与用基因重组技术制备的N-末端带有蛋氨酸的神经营养蛋白-3或其盐反应，然后再与邻苯二胺反应；(16)制备β-动物纤维素或其盐的方法，该方法包括将二羟乙酸或其盐在硫酸铜和吡啶存在的条件下与用基因重组技术制备的N-末端带有蛋氨酸的β-动物纤维素或其盐反应，然后再与邻苯二胺反应；(17)制备白介素-2或其盐的方法，该方法包括将二羟乙酸或其盐在硫酸铜和吡啶存在的条件下与用基因重组技术制备的N-末端带有蛋氨酸的白介素-2或其盐反应，然后再与邻苯二胺反应；
(18)制备甲状旁腺素或其盐的方法，该方法包括将二羟乙酸或者其盐在硫酸铜和吡啶存在的条件下与用基因重组技术制备的N-末端带有蛋氨酸的甲状旁腺素或其盐反应，然后再与邻苯二胺反应；(19)下式化合物CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X其中m为0-2的整数，X为氨基酸残基或者肽链，或者它们的盐；(20)制备氨基酸，肽链，蛋白质或者其盐的方法，该方法包括使上述(19)的化合物水解等；
图1所示为实例2a中所得到的电泳结果。
图2所示为实例5a中所得到的电泳结果。
图3所示为实例7a中所得到的电泳结果。
图4所示为实例9a中所得到的电泳结果。
图5所示为实例11a中所得到的电泳结果。
图6所示为实例24a中所得到的电泳结果。
图7所示为实例38a中所得到的电泳结果。
图8所示为实例67a中所得到的电泳结果。
这里使用的选择性氧化的蛋氨酸残基既可代表为蛋氨酸残基，也可为带有氧化的硫的残基，其中带有氧化的硫的蛋氨酸代表亚砜或者砜基。
例如，在N-末端带有选择性氧化蛋氨酸残基的肽可为下式肽CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X其中m为0-2的一个整数，X为氨基酸残基或肽链，这些肽可以以盐的形式存在。只要不抑制所述的反应可以使用任何盐。但最好选用药物可以接受的盐。例如，无机酸盐如盐酸盐，溴氢酸盐，硝酸盐，硫酸盐，磷酸盐等；有机酸盐如乙酸盐，酞酸盐，富马酸盐，酒石酸盐，马来酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐等；与碱金属所成的盐如钠盐，钾盐等；与碱土金属所成的盐如钙盐等；或铵盐等。
在上述式中，m最好为0，X最好为氨基酸数目不少于2的肽链。
上述去除方法中所用的肽既可以是氨基酸数目少于50的一般肽，也可以是氨基酸数目不少于50的所谓蛋白质。因此，在本说明中，术语“肽”不仅包括少于50个氨基酸的分子，也包括50或者多于50个氨基酸的分子。优选具有50个或者更多的氨基酸的分子(所谓蛋白质)作为肽。
例如，肽优选具有2个至1000个氨基酸，更优选具有15至500个氨基酸。
优选的肽类包括下述分子生长激素(GH)，甲状旁腺素(PTH)，胰岛素，神经生长因子，脑衍化神经营养因子，睫状神经营养因子，胶质衍化神经营养因子，神经营养蛋白-3，4或者6，中枢神经生长因子，胶质细胞生长因子，肺衍化神经生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，血小板衍化生长因子，转化生长因子α或者β，内皮细胞生长因子，组织纤溶酶原激活剂，尿激酶，蛋白C，凝血调节蛋白，骨形态发生蛋白，降钙素，胰岛素样生长激素，干扰素α，β或者γ，白介素-1(α，β)至白介素-12，粒细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，血小板生成素，生长调节素C，红细胞生成素，PACAP，心房肽，内皮素，巨核细胞生长因子，造血干细胞生长因子，肝细胞生长因子，促胃动素，免疫毒素，肿瘤坏死因子，水蛭素，促肾上腺皮质激素，血管紧张素，血管紧张素II和血管紧张素II-拮抗肽，血管紧张素III，缓激肽衍生物，缓激肽增强因子，α，β或γ内啡肽，脑啡肽，中性细胞驱化因子，胃泌素，胰高血糖素，生长激素释放因子，京都酚，血管舒张素，促性腺激素释放素，肥大细胞脱颗粒肽，促黑激素，神经降压肽，胰蛋白酶抑制剂，催产素，前胰岛素C肽，促胰液素，促生长素抑制素，刺激甲状腺激素释放素，泛素，尿抑胃素，加压素衍生物，激肽衍生物，特夫素，生长调节素，促肾上腺皮质激素释放因子，胰岛素样生长因子，降钙素基因相关肽，PTHrP，VIP，DHI，促胰岛素释放素，GRP，CCK-PZ，Galanin，窦肽，促胃动素，PPY，胰多肽，PSP，胰抑制素，hCG，hCS，松弛素，血清胸腺因子，胸腺生成素，胸腺素，因子XIII，因子VIII，尿激酶原，SOD，因子VIIa，抗凝血酶或其变异蛋白(之与天然蛋白比较其生物或者免疫活性相同或者更强，其特点为天然蛋白质中的一个或多个氨基酸被取代，缺失或增加)或者由化学合成的已知或新的肽。在这些肽中，还是以使用由基因重组技术制备出的N-末端带有选择性氧化蛋氨酸的肽较好，这些肽包括有生长激素，神经营养蛋白-3，β-动物纤维素，甲状旁腺素，白介素-2等。
上述的天然肽可来自任何动物种类，但以使用来自人的天然肽为较好。
在本说明书中，α-二酮衍生物可是能引起上述肽或其盐转氨的任何一种。例如，所使用的化合物或其盐分子式为R1-CO-CO-R2其中R1为氢，低级烷基或羧基取代的苯基(R1为氢或甲基较好，但氢更好)；R2为羟基，低级烷氧基或可被低级烷基取代的氨基(R2为羟基较好)。
在上述式中，R1代表的低级烷基为具有1到6个碳原子的烷基，例如，甲基，乙基，丙基异丙基，丁基，异丁基，仲丁基和叔丁基等，R2代表的低级烷氧基为具有1到6个碳原子的烷氧基，例如，甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基等。另外，作为能被低级烷基替换的氨基，其可带有一到两个上述低级烷基。还有，上述通式化合物的盐可与上述肽的盐类似。
α-二酮衍生物举例有二羟乙酸，丙酮酸，草酰乙酸，苯酰甲酸，及2-氧代戊二酸等。其中，以使用二羟乙酸为较好。
在N-末端带有选择性氧化的蛋氨酸残基的肽或其盐与α-二酮衍生物之间的转氨反应优选进行5分钟到2小时(更优选15分钟到1小时)，反应温度约在0到70℃(更优选20到40℃)，通常两者之间的比例约是1到10,000个摩尔(更优选2,000到4,000摩尔)α-二酮衍生物相对于一个摩尔的肽或者其盐。只要不抑制上述的转氨反应，可选用下面的任何一种缓冲盐溶液(如磷酸盐缓冲溶液，乙酸盐缓冲液及柠檬酸盐缓冲液等)。其中，以使用乙酸盐缓冲液为较好。反应的pH优选在2到9的范围内，更优选4到7，以5到6为最好，在上述条件下可以不使带有选择性氧化的蛋氨酸残基的肽或者其盐变性。
为了增强反应，优选在过渡金属离子存在下进行α-二酮衍生物反应。通常相对于一个摩尔的α-二酮衍生物，优选使用0.01到0.1摩尔(更优选0.01到0.05摩尔)的过渡金属离子。过渡金属离子包括有如铜离子(Cu+，Cu2+)，钴离子(Co2+，Co3+)，镍离子(Ni2+，N3+)，铁离子(Fe2+，Fe3+)，锌离子(Zn2+)，铝离子(Al3+)，锰离子(Mn2+等)，镓离子(Ga3+)，铟离子(In3+)，镁离子(Mg2+)及钙离子(Ca2+)等。其中以铜离子及钴离子为较好，而铜离子(Cu2+)更好。这些过渡金属离子最好以盐的形式加入反应溶液中，这些盐可以是与无机酸生成的，无机酸如硫酸，硝酸，盐酸，高氯酸等，也可是与有机酸生成的，有机酸有乙酸，草酸，柠檬酸，及碳酸等。其中以使用硫酸铜及乙酸铜为较好，而硫酸铜则更好。
N-末端带有选择性氧化的蛋氨酸残基的肽或者其盐与α-二酮衍生物的反应优选在碱存在下进行。相对于1个摩尔α-二酮衍生物通常优选使用0.1到2个摩尔(最好0.5到1.0个摩尔)的碱。碱可以使用有机碱，包括有烷基胺衍生物如三乙胺，三丁胺等，芳香胺衍生物如N，N-二甲基苯胺，吡啶，二甲基吡啶，可力丁，4-(二甲氨基)吡啶，咪唑等，以及脲。其中，以使用芳香胺衍生物为较好，而吡啶则更好。
另外，上述的转氨反应优选在过渡金属离子和碱存在的条件下，使N-末端带有选择性氧化的蛋氨酸的肽或者其盐与α-二酮衍生物反应。实际上，是将由金属离子，碱及α-二酮衍生物这三种成分组成的溶液(如硫酸铜，吡啶，二羟乙酸等)加入到由N-末端带有选择性氧化的蛋氨酸残基的肽或者其盐组成的溶液中来进行反应的。
通过转氨反应得到的下式化合物或者其盐-CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X其中m为0-2的整数，X为氨基酸残基或肽链，为新的化合物，其可由反应液通过常规的纯化方法如萃取，盐析，分配，重结晶，以及色谱等来分离纯化，或者不经上述分离纯化将其直接进行下一步的水解反应。
由转氨反应中所得的二酮衍生物通常与碱一起进行水解反应，从而得到去除N-末端选择性氧化的蛋氨酸残基的肽或者其盐。
水解反应中所用的碱举例有胺的衍生物如胱胺，烷基胺衍生物如三乙胺，三丁胺等，芳香胺衍生物如二甲基苯胺，吡啶，二甲基吡啶，可力丁，4-(二甲氨基)吡啶，咪唑等，二胺的衍生物如邻苯二胺，甲苯-3，4-二胺，3，4-二氨基甲酸，2，3-二氨基苯酚，4-氯-邻苯二胺(优选芳香二胺，更优选邻苯二胺衍生物)等，硫氨基脲衍生物如丙酮氨基硫脲，苯氨基硫脲等，氨基硒脲衍生物如氨基硒脲，氨基丙酮硒脲等。其中，优选胺的衍生物，更优选二胺衍生物及硫氨基脲衍生物。尤其是邻苯二胺最优选常用。
相对于一个摩尔二酮衍生物，通常使用的碱量为1到10,000个摩尔(以500到2,000个摩尔为较好)。水解反应在温度为0到70℃的范围内(以20到40℃为较好)，进行1到50个小时(以10到25个小时为较好)。反应最好使用缓冲液作为溶剂来进行。只要不抑制上述的转氨反应，可选用上述的任何一种缓冲盐溶液，如磷酸盐缓冲溶液，乙酸盐缓冲液，及柠檬酸缓冲液等。其中，以使用乙酸盐缓冲液为较好。反应所的pH约在2到9的范围内，但以3到7为较好，以4到6为更好，该pH接近中性，在这种述条件下进行反应可以不使所得的肽或其盐变性。
所得的肽或其盐可由反应液通过常规的纯化方法如萃取，盐析，分配，重结晶，以及色谱等来分离纯化，或者不经上述分离纯化将其直接进行下一步的水解反应。较好的纯化方法是通过SP-Sepharose(Pharmacia Biotech)或者DEAE-5PW(Tosob)，使用离子交换层析法。
由于本发明制备出的多肽在其N-末端不带蛋氨酸并且其氨基酸序列与天然生物活性的多肽序列相同，故其毒性低而生物活性与天然多肽相同，因而该多肽可以安全地作为药物或者诊断试剂来使用。本发明提供了专一除去蛋氨酰肽中N-末端蛋氨酸的方法。
在本发明的说明和附图中，氨基酸的缩写是依据生物化学命名的IUPAC-IUB委员会所推荐的缩写，或者相关领域中通常使用的缩写。
举例如下(缩写代表L型，除非特指)SDS十二烷基硫酸钠Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val缬氨酸Leu亮氨酸Ile异亮氨酸Ser丝氨酸
The苏氨酸Cys半胱氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Gln谷氨酰胺Asp天冬氨酸Asn天冬酰胺Lys赖氨酸Arg精氨酸His组氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸AsxAsp+AsnGlxGlu+Gln实例本发明将通过下面的参考实例和工作实例进行详细的说明，这些实例仅用于说明本发明的具体实施方案，而非将本发明局限于这些实例。参考实例1Met-rhGH的制备按照日本专利公开171699/1987参考实例4中所述的方法制备Met-rhGH。(i)制备物采用转化大肠杆菌K12×1776/pHGH107(ATCC 31538)。(ii)培养将大肠杆菌K12×1776/pHGH107(ATCC 31538接种在一个容量为2升的玻璃瓶内，瓶内装有1升的液体接种培养液(pH 7.0)，该培养液由1％细菌培养用胰蛋白胨，0.5％细菌培养用酵母，0.5％氯化钠，10mg/l盐酸四环素，10mg/l氨苄青霉素钠盐，20mg/l胸腺嘧啶及100mg/l二氨基pymeric酸ACID组成，然后37℃旋转摇动过夜培养。将所得培养液转移到含有20升制备培养液(pH 6.8)的50升培养罐内，该制备培养液含有1.68％磷酸氢钠，0.30％磷酸二氢钾，0.10％氯化铵，0.05％氯化钠，200mg/l去泡沫剂，1.00％葡萄糖，1.00％酪蛋白氨基酸，246mg/l硫酸镁，10mg/l盐酸四环素，10mg/l氨苄青霉素钠盐，20mg/l胸腺嘧啶及100mg/l二氨基pymeric酸。之后，在37℃通气并搅拌培养10小时。离心所得培养液并收集细菌细胞。参考实例2往参考实例1中所得的湿重为2kg的细胞中加入6L含有8M盐酸胍的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。搅动混合液以使细胞溶于缓冲液中，随后，通过离心(10,000rpm，60分钟)得到6L的细胞提取液。将所得的提取液经70L 10mM Tris-HCl(pH 7.0)透析两次。透析后，将硫酸铵加入到约9L的上述透析液中，并使其终浓度达到20％的饱和，随后离心(4,200rpm，60分钟)得到约10L的上清液。将上述的上清液分为两等份分别通过苯基-东洋珍珠(Toyopearl)650C柱(5cmφ×50cm)，随后吸附并冲洗柱子。由含有40％饱和的硫酸铵及10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)以线性浓度梯度通过洗脱收集Met-rhGH馏分，并通过50mM碳酸氢钠(pH 8.2)透析，随后经离心(4,200rpm，45分钟)得到3.7L的上清液。将上述上清液分成4等份分别通过DEAE-东洋珍珠650C柱(4cmφ×50cm)，随后吸附并洗脱柱子。由10mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.2)及含有1M氯化钠的10mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.2)以线性浓度梯度洗脱收集Met-rhGH馏分，并通过50mM碳酸氢钠(pH 8.2)透析。将约1.2L的透析液通过DEAE-5PW柱(55mmφ×20cm，Tosoh)，随后吸附并由10mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.2)及含有1M氯化钠的10mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.2)以线性浓度梯度通过HPLC洗脱，然后通过50mM碳酸氢钠(pH 8.2)透析从而得到约600ml的Met-rhGH馏分。使用Amicon Diaflow(YM-10membrane，76mmφ，Amicon)将上述溶液浓缩至约294ml，然后使用以100mM碳酸氢钠(pH 8.2)平衡的Toyopearl HW-50F(8cmφ×50cm)柱子进行凝胶过滤，从而得到Met-rhGH馏分。将该馏分通过MILLEX-GV过滤器(0.22μl，Milipore)过滤从而得到869mg Met-rhGH。工作实例1将从参考实例2中所得N-末端带有蛋氨酸的50mg人生长激素(Met-rhGH)溶于40ml的50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中。向混合物中加入含有5ml 0.1M硫酸铜，2.3g二羟乙酸及5ml吡啶的溶液并在25℃条件下放置1小时。将反应液通过以2M乙酸盐-2M乙酸钠缓冲液平衡的葡聚糖凝胶G-25柱(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-rhGH的二酮衍生物馏分。将邻苯二胺加到该馏分中，使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行20小时。将反应液通过以20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)平衡的SephadexG-25柱(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集N-末端不带蛋氨酸的人类生长激素(rhGH)的馏分。以20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡DEAE-5PW柱子(21.5mmID×150mmL)，然后将上述收集的馏分上柱，随后用0-100％溶液B(B＝20mM Tris-HCl缓冲液+1M氯化钠，pH 8.0)以线性浓度梯度的方式用8.5ml/分钟流速洗脱30分钟以收集rhGH馏分。将收集的馏分通过以5％乙醇溶液平衡的Toyopearl HW-50柱子(20mmID×600mmL)(Tosoh Corporation)，随后用同样的溶液以6ml/分钟的速度进行洗脱从而收到rhGH馏分。将收集到的馏分进行冷冻干燥以得到的粉末状的rhGH。工作实例2(rhGH特性的测定)a)用SDS聚丙酰胺凝胶电泳进行分析将在工作实例1中所得的粉末状的rhGH混悬于样本缓冲液中[Laemmli，Nature，227，680(1970)]并将混合液与100mM DTT在100℃加热1分钟，随后用Nulti凝胶10/20(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd)进行电泳。电泳后，以考马斯亮蓝对凝胶染色并且只可见纯化蛋白质的一条带。其结果可见图1所示。在图1中，第1-3道相应地代表rhGH(3μg)，空白及分子量标示物。b)N-末端氨基酸序列分析在工作实例1中得到的rhGH N-末端的氨基酸序列是使用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems，477A model)来测定的。
在工作实例1中得到的rhGH N-末端的氨基酸序列与rhGH的cDNA序列所预计的一致。结果可见表1。[表1]N-末端氨基酸序列分析残基编号检出的PTH1)-氨基酸由rhGH cDNA序列预测的氨基酸1 Phe Phe2 Pro Pro3 Thr Thr4 Ile Ile5 Pro Pro6 Leu Leu7 Ser Ser8 Arg Arg9 Leu Leu10Phe Phe11Asp Asp12Asn Asn13Ala Ala14Met Met15Leu Leu16Arg Arg17Ala Ala18His His19Arg Arg
20Leu Leu分析中采用了1nmol rhGH1)乙内酰苯硫脲c)氨基酸组成的分析使用工作实例1中所得的20μg rhGH采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定氨基酸的组成。在工作实例1中得到的rhGH的氨基酸组成与rhGH的cDNA序列所预计的一致。结果可见表2。[表2]氨基酸组成的分析氨基酸 每1mol残基的数目 由rhGH cDNA序列预测的数值Asx 19.4 20Thr1)9.910Ser1)16.9 18Glx 27.0 27Pro 7.88Gly 7.78Ala 6.97Cys2)4Val 6.87Met 3.23Ile 7.38Leu 24.8 26Tyr 7.68Phe 12.4 13His 2.93Lys 9.0 9Arg 10.311Trp2)1酸水解(6N HCl，1％苯酚，110℃，经24和48小时水解后所得的均值)1)水解时间为0小时时的推测值2)未检测出d)C-末端氨基酸的分析使用工作实例1中所得的约15nmol rhGH采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定C-末端上的氨基酸。在工作实例1中得到的rhGH C-末端上的氨基酸与rhGH的cDNA序列所预计的一致。结果可见表3。[表3]C-末端氨基酸的分析rhGHC-末端氨基酸产率(％)Phe55.4汽相肼解(100 ℃，3.5小时)工作实例3[rhGH活性的测定]依照Journal of Endocrinology & Metabolism，51，1058(1990)所述的方法，使用Nb 2细胞进行工作实例1中纯化所得的rhGH分析，结果显示工作实例1中纯化所得的rhGH与标准品的活性几乎一致。参考实例3Met-NT-3的制备依照参考实例1-3和日本专利申请74775/1996说明书中工作实例1-2所述的方法，制备Met-NT-3。(1)NT-3 DNA的克隆以来自人神经胶质瘤的λgt 11 cDNA文库(Clontech Laboratories，Inc.)感染大肠杆菌Y1090，并将约6×105个噬菌体接种到NZCY培养液中(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HaborLaboratory，1982)，并在37℃条件下培养5小时。将尼龙膜置于板上，并放置1分钟，然后从板上移开。将该尼龙膜依次放入0.5M NaOH-1.5M NaCl的溶液中，1.5M NaCl-0.5M Tris-HCl(pH 8.0)溶液中及2 × SSC溶液中(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，如上所述)。随后进行干燥，并且在80℃下静置2小时。
化学合成DNA(约0.38kb)编码人βNGF，并且通过缺口翻译用[α-32P]dCTP标记DNA[Nature，303，821(1983)]来制备探针。
按照Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1982所述的方法，将所得的尼龙膜与探针杂交。即将尼龙膜放入含有探针的溶液中，并在65℃下静置16小时。在室温下用2 × SSC-0.1％ SDS冲洗上述的膜，此后用1×SSC-0.1％ SDS在60℃下冲洗，随后经过放射自显影得到阳性克隆。将经所得克隆λβ GN1321EcoRI消化的cDNA插入质粒pUC118(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的EcoRI内切酶位点从而得到质粒pUNK5。(2)大肠杆菌NT-3表达载体的构建在从参考实例3(1)中得到的插入有NT-3的质粒pUNK5中，有一个ScaI酶切位点与NT-3N-末端第11个氨基酸编码Tyr的区域相邻，而另一个酶切位点NsiI与NT-3终止密码子下游50个碱基的区域相邻。这样，将ScaI-NsiI片段从质粒pUNK5中分离出来，然后将其通过T4 DNA连接酶与衔接子NGFTE-4(35 Mer)，NGFTE-2(33 mer)，NGFTE-3(7 mer)及NGFTE-4(15 mer)连接起来，随后，通过NdeI及BamHI处理得到0.3kb的NdeI-BamHI片段。
上述的衔接子如下。NGFTE-15′TATGTACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGT 3′35 mer(序列ID No1)BGFTE-25′ACTCCCCTCGGTGACTCTTATGCTCCGCGTACA 3′ 33 mer(序列ID No2)NGFTE-35′TGCCAGG 3′7 merNGFTE-45′GATCCCTGGCATGCA 3′ 15 mer(序列ID No3)具有T7促进子的表达载体pET-3C[Rosenberg et al.，Gene，56，125(1987)用NdeI和BamHI消化得到4.4kb NdeI-BamHI片段。
将所得的4.4kb NdeI-BamHI片段和0.3kb NdeI-BamHI片段通过T4 DNA连接酶连接起来，随后转化大肠杆菌DH1。再从氨苄青霉素耐药转化体(Escherichia coli DH1/pENGFT103)分离得到质粒pENGFT103。(3)大肠杆菌Met-NT-3的制备使用从参考实例3(2)中得到的NT-3表达载体pENGFT103及T4溶菌酶表达载体pLysS，将大肠杆菌MM294(DE3)[Molecular Endocrinology，4，869(1990)]转化，从而得到大肠杆菌MM 294 9DE3)/pLysS，pENGFT103(IFO15932，FERM BP-5483)。
将大肠杆菌MM294(DE3)/pLysS，pENGFT103(IFO15932，FERM BP-5483)接种于含有1升LB培养液[1％胨，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠]的具有2升容量的培养瓶内，培养液还包括50μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml氯酶素，然后将其在30℃条件下旋转振摇培养8小时。然后将所得培养液转移到含有20升制备培养液容量为50升的发酵罐内[制备培养液包括1.68％磷酸氢钠，0.3％磷酸二氢钾，0.1％氯化铵，0.05％氯化钠，0.05％硫酸镁，0.02％去泡沫剂，0.00025％硫酸亚铁，0.0005％盐酸硫胺素，1.5％葡萄糖，1.5％酪蛋白氨基酸]，其后在30℃搅动通风条件下培养。当培养液的Klett值变为约500，100mg/L/分钟时，将异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷加入培养液中，培养再进行7小时。将培养液离心从而得到湿重约340g的细胞并将其在-80℃条件下冷冻。(4)Met-NT-3在大肠杆菌中的制备(大量制备)将大肠杆菌MM294(DE3)/pLysS，pENGFT103(IFO15932，FERM BP-5483)接种于含有1升LB培养液[1％胨，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠]的具有2升容量的培养瓶内，培养液还包括50μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml氯酶素，然后将其在30℃条件下旋转振摇培养16.5小时。然后将所得培养液转移到含有20升LB培养液且容量为50升的发酵罐内[LB培养液包括0.02％去泡沫剂，50μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml氯酶素]，然后在30℃搅动通风条件下培养7小时。将所得培养液转移到含有360升制备培养液的容量为50升的发酵罐内[液体制备培养液包括1.68％磷酸氢钠，0.3％磷酸二氢钾，0.1％氯化铵，0.05％氯化钠，0.05％硫酸镁，0.02％去泡沫剂，0.00025％硫酸亚铁，0.0005％盐酸硫胺素，1.5％葡萄糖，1.5％酪蛋白氨基酸]，后在30℃在搅动通风条件下培养。当培养液的Klett值变为约500，将异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷以100mg/L/分钟加入培养液中，再将培养进行5.5小时。将培养液离心从而得到湿重约6kg的细胞并将其在-80℃条件下冷冻。(5)Met-NT-3的活化将参考实例3(3)中所得的40g湿润细胞混悬于240ml的10mM EDTA(pH 7.0)中。使用SONIFIER 450(Branson Inc.)以超声波在冰冷条件下将混悬液中的细胞破坏，随后进行离心(10000rpm，1小时)。用上述同样的方式处理所得的粒状沉淀物两次并冲洗之。将所得的粒状沉淀物加入到160ml的50mM Tris-HCl/4M尿素/5mM二硫苏糖醇(DTT)中并将混悬液混匀，随后进行离心。将所得粒状沉淀物溶于120ml的20mM柠檬酸/8M尿素(pH3.0)中，随后离心以将上清与沉淀物分离。以上述同样的方法处理沉淀物从而得到上清液，将其与上述的上清液合并得到240ml粒状沉淀物溶液。将粒状沉淀物溶液用760ml 100mM乙酸盐溶液稀释，并通过以100mM乙酸盐溶液平衡的Sephadex G-25柱子(11.3cmφ×50cm)，从而得到已去除尿素的1640ml变性Met-NT-3溶液。将溶液在4℃下静置2天，加50mM磷酸盐缓冲液/12.5％蔗糖(pH 6.8)从而得到8.5L溶液。用5M氢氧化钠或者浓缩的磷酸调节溶液pH为6.0并在4℃在条件下静置2天以激活Met-NT-3。然后，向溶液中加200mM硫酸铜使其终浓度为10μM并搅拌溶液，随后在4℃下静置2天以继续激活Met-NT-3。
用100mM磷酸盐缓冲液/0.1％3-[(3-胆酰胺丙基-二甲铵(ammonio)]-1-丙磺酸(CHAPS)(pH6.0)平衡SP-Sepharose Fast Flow柱子(2.5cmφ×12cm，Pharmacia Biotech Inc.)，将在参考实例3(5)中所得的溶液通过此柱，随后吸附并用100mM磷酸盐缓冲液/0.1％CHAPS/200mM氯化钠(pH 6.0)冲洗。用100mM磷酸盐缓冲液/0.1％CHAPS/400mM氯化钠(pH6.0)洗脱该柱，从而得到含有Met-NT-3的溶液。将溶液装入Resource 15 RPC柱子(2cmφ×30cm，Pharmacia BiotechInc.)，随后用由16％乙腈/0.1％ TFA-36％乙腈/0.1％ TFA组成的溶液以线性浓度梯度方式洗脱柱子。将洗脱液冷冻干燥从而得到约28mg Met-NT-3的白色粉末。工作实例4将参考实例3(6)中所得的50mg Met-NT-3溶于4.6ml水中。向混合物中加入含200μl 100mM硫酸铜，92.5mg二羟乙酸，200μl及吡啶的溶液，缓慢搅拌并在室温下静置15分钟。将反应液通过用2M乙酸盐缓冲液(pH 4.9)平衡的Sephadex G-25柱子(2.5cmφ×59cm)从而收集到36ml的Met-NT-3二酮衍生物。向该溶液中加入78mg邻苯二胺，并将反应在37℃条件下进行15小时。将反应液通过用2M乙酸盐缓冲液(pH 4.9)平衡的Sephadex G-25柱子(2.5cmφ×59cm)从而收集到76ml NT-3馏分。将上述所得馏分装入ODP-50柱子，随后用由(1)0.1％ TFA及(2)0.1％TFA/80％乙腈以线性浓度梯度方式洗脱柱子，并经HPLC进行纯化从而得到NT-3馏分。将所得馏分冷冻干燥从而得到NT-3粉末。工作实例5(NT-3特性的测定)a)SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析将工作实例4中所得的NT-3粉末溶于样本缓冲液中[Laemmli，Nature，227，680(1970)]，并将混合物与100mM DTT于100℃加热1分钟，随后用Multi凝胶10/20(Daiichi Kagaku Pure Chemicals)进行电泳。电泳后，用考马斯亮蓝对凝胶染色并只得到一条纯化的蛋白质带。其结果见图2。在图2中，第一和第二道分别代表分子量标示物和NT-3。b)N-末端氨基酸序列的分析在工作实例4中所得的NT-3的N-末端氨基酸序列可使用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems，477A model)来测定。在工作实例4中所得NT-3的N-末端氨基酸序列与NT-3的cDNA序列所预计的一致。其结果见表4。[表4]
N-末端氨基酸序列分析残基编号 检出的PTH1)-氨基酸由rhGH cDNA序列预测的氨基酸1Tyr Tyr2Ala Ala3Glu Glu4His His5Lys Lys6Ser Ser7His His8Arg Arg9Gly Gly10 Glu Glu11 Tyr Tyr12 Ser Ser13 Val Val14 N.D. Cys15 Asp Asp16 Ser Ser17 Glu Glu18 Ser Ser19 Leu Leu20 Trp Trp分析中采用1nmol的NT-3。1)乙内酰苯硫脲c)氨基酸组成的分析使用工作实例4中所得的20μg NT-3采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定氨基酸的组成。在工作实例4中得到的NT-3的氨基酸组成与NT-3的cDNA序列所预计的一致。结果可见表5。[表5]氨基酸组成的分析氨基酸 每1mol残基的数目 由rhGH cDNA序列预测的数值Asx 11.3 11Thr1)9.49Ser1)12.8 12Glx 12.1 11Pro 2.12Gly 7.98Ala 4.75Cys2)6Val 8.79Met 0 0Ile 6.87Leu 5.15Tyr 4.95Phe 1.11His 3.74Lys 10.0 10Arg 10.2 10Trp2)4酸水解(6N HCl，1％苯酚，110℃，经24和48小时水解后所得的均值)
1)水解时间为0小时时的推测值2)未检测出d)C-末端氨基酸的分析使用工作实例4中所得的约15nmol NT-3采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定C-末端上的氨基酸。在工作实例4中得到的NT-3 C-末端上的氨基酸与NT-3的cDNA序列所预计的一致。结果可见表6。[表6]C-末端氨基酸的分析NT-3C-末端氨基酸产率(％)Thr 5.1汽相肼解(100℃，3.5小时)参考实例4Met-人类BTC的制备按照日本专利公开87894/1994中实例4-6，8及13所述的方法制备Met-人类BTC。(1)大肠杆菌人类BTC cDNA表达质粒的构建按照日本专利公开87894/1994中实例5所述的方法从质粒pTB1515中将编码成熟人类BTC(1-147氨基酸残基)的0.6kb EcoRI-BamHI片段分离出来。将带有ATG翻译启动密码的合成衔接子(序列ID No.45′TATGGATGGG 3；序列ID No.55′AATTCCCATCCA 3′)与上述0.6kb片段的EcoRI位点相连接之后，将所得的0.6kb Ndel-BamHI片段插入到带有T4启动子的质粒pET-3c[Gene，56.125(1987)]中从而构建质粒pTB1505。
为了得到编码人BTC 80个氨基酸的DNA片段[特开昭87894/1994中图10-1及图10-2的1(Asp)-80(Tyr)氨基酸残基]，采用PCR方法以质粒pTB1505作为摸板，并以2个寡核苷酸(序列ID No.65′ATACATATGGATGGGAATTCCA 3′；序列ID NO.75′CCGGATCCTAGTAAAACAAGTCAACTCT 3′)作为引物。用NdeI及BamHI消化所得产物，使用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后将所要的0.25kb DNA片段分离出来。使用T4 DNA连接酶将上述的0.25kb的DNA片段插入到pET-3c的T7启动子下游(参见日本专利公开87894/1994)的图13)。(2)大肠杆菌中人BTC的表达用连接有T7噬菌体的RNA多聚酶基因的lambda噬菌体DE3(Studier，supra)溶解大肠杆菌MM294。然后，将质粒PLysS引入大肠杆菌MM294(DE3)得到大肠杆菌MM294(DE3)/pLysS。将参考实例4(1)中所得的质粒pTB151b引入上述菌株，从而得到大肠杆菌MM294(DE3)/pLysS，pTB1516。将转化体在37℃的条件下培养于含有100μg/ml的氨苄青霉素及10μg/ml氯霉素的20ml L-肉汤培养液中。当Klett约为180时，向培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.4mM，并将培养持续进行4小时。采用离心收集细菌细胞，然后悬浮在0.5ml含有20mM Tris-HCl(pH7.4)，10mM EDTA，0.5M NaCl，10％蔗糖及0.25mM PMSF的缓冲液中，向该混悬液中加入浓度为0.5mg/ml的蛋清溶菌酶。冰浴1小时后，在37℃的条件下将混悬液培养5分钟，然后离心(SORVALL，15000rpm，30分钟，4℃)分离出上清。
转化体大肠杆菌MM294(DE3)/pLysS，pTB1516在1992年4月21日以Accession No.FERN BP-3836保藏在发酵研究所，日本国际贸易和工业科学和技术部并且在1992年4月16日以保藏号IFO 15282保藏在IFO。(3)大肠杆菌转化体产生的BTC的纯化将参考实例4(2)中所得的大肠杆菌转化体MM294(DE3)/pLysS，pTB1516培养一夜，然后将其转移到LB培养液中并在37℃的条件下培养2小时。将IPTG加入该系统使其终浓度为0.1mM，并将培养继续3小时。采用离心收集细胞并在-20℃将其储存。
将5升的储存细胞融化，并将其混悬于300ml含有50mM Tris-HCl(pH7.4)，10mM EDTA，0.2M NaCl，10％蔗糖及1mM PMSF的缓冲液中。将40mg蛋清溶菌酶溶于混悬液中，在4℃条件下培养2小时并经超声处理，然后以转速20000×g离心1小时得到上清。将该上清液通过200mlQ-Sepharose床，并将TCA加入到所得的产物使其终浓度为4％，在4℃条件下静置10分钟。以20000×g的转速离心20分钟得到沉淀物，并悬浮在含有100ml 20mM Tris-HCl(pH 7.4)，1mM EDTA及1mM APMSF的缓冲液中，向该混悬液中加入5N NaOH调节pH至6，并在研钵内将其混匀。将混匀物在转速为100000×g的条件下离心1小时，并将所得上清液装入S-Sepharose柱子(直径1.6×10cmPharmacia)。以含有0.1M磷酸钾(pH 6)，1mM EDTA及1mM APMSF的缓冲液冲洗柱子后，以400ml 0M到1M NaCl梯度洗脱200分钟。收集每5mol的洗脱液。将Nos.20到27高度活性馏分合并作为大肠杆菌BTC。
向上述的活性馏分加入TFA使其终浓度为0.1％，然后将该混合物装入C18反相HPLC柱子(Asahipak ODP-50，直径1.0×25cm，Asahi ChemicalIndustries Co.，Ltd.)。用0.1％ TFA冲洗柱子后，用340ml的乙腈(0-63％)梯度洗脱170分钟。在这一过程中可得到630μg的大肠杆菌BTC。
测定大肠杆菌BTC N-末端20个氨基酸的氨基酸序列。正如预计的那样，BTC序列在其N-末端带有来自起始密码子的Met。工作实例6将参考实例4(3)中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的人β-动物纤维素溶于16ml 50mM磷酸盐缓冲液中(pH 8.0)。向该混合物中加入含有0.1M硫酸铜2ml，二羟乙酸0.92g，及吡啶2ml的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2M乙酸盐-乙酸钠缓冲液平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将邻苯二胺加到该馏分中，使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行20小时。将反应液通过以20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)平衡的Sephadex G-25柱(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集N-末端不带蛋氨酸的人β-动物纤维素(BTC)的馏分。将所收集到的馏分的pH调节到6.0，然后将其装入以100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡的SP-Sepharose柱子(10mmID×200mmL)，随后用0-100％溶液B(B＝100mM磷酸盐缓冲液+1 M氯化钠，pH 6.0)以线性浓度梯度的方式用2.0ml/分钟流速洗脱60分钟收集BTC馏分。将收集的馏分通过以0.1％TFA平衡的ODP-50柱子(10mmID×250mmL)(Showa Denco，Inc.)，随后用20-40％溶液B(B＝乙腈/0.1％TFA)以线性浓度梯度的方式用2ml/分钟流速洗脱60分钟收集BTC馏分。将收集到的馏分进行冷冻干燥以得到的粉末状的BTC。工作实例7(BTC特性的测定)a)SDS聚丙酰胺凝胶电泳分析将在工作实例6中所得的粉末状的BTC 1μg混悬于样本缓冲液中[Laemmli，Nature，227，680(1970)]并将混悬液与100mM DTT一起在100℃加热1分钟，随后用Multi凝胶15/25(Daiichi Pure Chemicals)进行电泳。电泳后，以考马斯亮蓝对凝胶染色并且只可见纯化蛋白质的一条带。其结果可见图3所示。在图3中，第1-2道相应地代表分子量标示物及BTC。b)N-末端氨基酸序列分析在工作实例6中得到的1nmol BTC的N-末端氨基酸序列是使用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems，477A model)来测定的。
在工作实例6中得到的BTC的N-末端氨基酸序列与BTC的cDNA序列所预计的一致。结果可见表7。[表7]N-末端氨基酸序列分析残基编号 检出的PTH1)-氨基酸 由BTC cDNA序列预测的氨基酸1Asp Asp2Gly Gly3Asn Asn4Ser Ser5Thr Thr6Arg Arg7Ser Ser8Pro Pro
9 GluGlu10ThrThr11AsnAsn12GlyGly13LeuLeu14LeuLeu15N.D. N.D.
16GlyGly17AspAsp18ProPro19GluGlu20GluGlu1)乙内酰苯硫脲c)氨基酸组成的分析使用工作实例6中所得的20μg BTC采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定氨基酸的组成。在工作实例6中得到的BTC的氨基酸组成与BTC的cDNA序列所预计的一致。结果可见表8。[表8]氨基酸组成的分析氨基酸 每1mol残基的数目 由BTC cDNA序列预测的数值Asx7.0 7Thr1)5.9 6Ser1)4.8 5Glx9.7 9Pro4.0 4Gly 7.07Ala 4.04Cys2)N.D. 8Val 3.64Met 0 0Ile 2.02Leu 3.03Tyr 3.84Phe 3.03His 2.12Lys 5.15Arg 6.47Trp2)0酸水解(6N HCl，1％苯酚，110℃，经24和48小时水解后所得的均值)1)水解时间为0小时的推测值2)未检测出d)C-末端氨基酸的分析使用工作实例6中所得的约15nmol BTC采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定C-末端上的氨基酸。在工作实例6中得到的BTC C-末端上的氨基酸与BTC的cDNA序列所预计的一致。结果可见表9。[表9]C-末端氨基酸的分析BTC C-末端氨基酸 产率(％)Thr 65.5汽相肼解(100℃，3.5小时)e)BTC生物活性的测定依照Molecular Cell Biology，8，588(1988)所述的方法，使用BALB/C3T3 A31-714克隆4(International Journal of Cancer，12，463(1973))将在工作实例6中纯化所得的BTC进行分析，结果显示工作实例6中纯化所得的BTC与标准品的活性几乎一致。参考实例5蛋氨酰-人类白介素-2的制备按照日本专利公开87894/1994参考实例2中所述的方法制备Met-IL-2。(i)表达质粒的构建用限制性内切酶HgiAl将1294bp DNA片段从含有人IL-2基因的质粒pILOT 135-8中(参见日本专利公开11528/1985实施例1]切下来。以T4 DNA多聚酶处理该切下的1294bp DNA片段以得到平口末端，并使用T4 DNA多聚酶将其与EcoRI连接剂dTGCCATGAATTCATGGCA(序列ID No.8)连接。将所得DNA用EcoRI消化，从而得到具有翻译启动密码子ATG及人IL-2基因的DNA片段。
使用T4 DNA连接酶，将所得的DNA片段插入到已经消化的带有EcoRI-PstI位点的质粒ptrp781中[Nucleic Acids Research，11，3077(1983)]。所得的表达质粒pTF1含有trp启动子下游的翻译启动子密码及人IL-2基因(日本专利公开171699/1987中的图4)。
使用限制性内切酶StuI将DNA片段从pTF1质粒中切下来，然后将其与BamHI连接剂连接起来。将所得的质粒DNA用限制性内切酶BamHI及EcoRI处理，随后将其插入质粒pTB281中，该质粒在其BamHI-EcoRI位点有λPL启动子。所得的表达质粒称为pTB285(日本专利公开171699/1987中的图5)。(ii)转化体的制备用上述所得pTB285的质粒，按照Cohen等人所述的方法[Proceedingsof the National Academy of Science，USA，69，2110(1972)]将大肠杆菌N4830转化，从而得到含有质粒pTB285的转化体；该转化体被命名为大肠杆菌N4830/pTB285。(iii)转化体的培养将转化的大肠杆菌N4830/pTB285(IFO 14437，FERM BP-852)接种于含有50ml液体培养液(pH 7.0)具有250ml容量的培养瓶内，该培养液包括有1％细菌培养用胰蛋白胨(Difco Laboratories，USA)，0.5％细菌培养用酵母提取物(Difco Laboratories，USA)，0.5％氯化钠及50μg/ml氨苄青霉素，然后将其在37℃条件下旋转振摇培养过夜。然后将所得培养液转移到含有2.5升M9培养液容量为5升的发酵罐内，该培养液包括0.5％酪蛋白氨基酸，0.5％葡萄糖，50μg/ml氨苄青霉素，其后在35℃搅动通风条件下培养6小时，42℃ 3小时。将所得到的2.5升培养液离心从而收集细菌细胞。将细胞在-80℃条件下冷冻储存。(iv)提取将20克冷冻的细胞样本均匀悬浮在100ml含有7M盐酸胍及0.1MTris-HCl的提取液(pH 7.0)中，并在4℃条件下搅拌1小时。随后将混悬液以转速为28,000×g离心20分钟并得到上清液。(v)蛋氨酰白介素-2的馏分纯化将所得的上清液经0.01M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)透析后，再经转速为19,000×g离心10分钟，并收集上清液。将所得上清通过用DE52(DEAEcellulose，Wattman，UK)装柱且以0.01M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)平衡的50ml柱子，以吸附蛋白质；然后用NaCl以线性浓度梯度的方式(0-0.15MNaCl，1升)洗脱IL-2，并得到活性馏分。(vi)蛋氨酰白介素-2蛋白质的纯化使用YM-5膜(Amicon，USA)浓缩上述的活性馏分至5ml后，将所得活性馏分用经0.1M Tris-HCl(pH 8.0)-1M NaCl缓冲液平衡的装有SephacrylS-200(Pharmacia，Sweden)的柱子进行凝胶过滤。使用YM-5膜将所得的40ml活性馏分浓缩至3ml。用Ultrapore RPSC柱子(Altex，USA)吸附所得浓缩物，并使用三氟乙酸-乙腈系统作为洗脱剂进行HPLC。保持下述的条件。柱子 Ultrapore RPSC(4.6×75mm)柱子温度 30℃洗脱溶液A 0.1％三氟乙酸-99.9％水洗脱溶液B0.1％三氟乙酸-99.9％乙腈洗脱程序 0分钟.(68％A+32％B)-25分钟.(55％A+45％B)-35分钟.(45％A+55％B)45分钟.(30％A+70％B)-48分钟.(100％B)流速 0.8ml/分钟检测波长 230nm在保留时间约39分钟，收集Met-IL-2馏分。(vii)使用SP-5PW柱子纯化Met-IL-2将含有上述所得混合物的(pH 5.0，蛋白质浓度1.03mg/ml)0.5ml 0.005M乙酸铵缓冲液吸附于用0.025M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)平衡的SP-5PW柱子并进行HPLC(0.75×7.5cm，Tosoh)以洗脱蛋白质。柱子温度和流速分别维持在35℃和0.5ml/分钟。使用一改型的5,500型液体层析仪。
在保留时间约70分钟时收集Met-IL-2馏分。工作实例8将参考实例5中得到的20mg蛋氨酰人IL-2(Met-IL-2)溶于27ml 20mM乙酸铵缓冲液中(pH 5.0)。向该混合物中加入含有25mM硫酸铜3.375ml，二羟乙酸1.55g，及吡啶3.375ml的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)平衡的Sephadex G-25的柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速通过柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。将邻苯二胺加到该馏分中，使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。将反应液通过以20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)平衡的Sephadex G-25柱(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速通过柱子从而收集人白介素-2(IL-2)的馏分。将所收集到的馏分装入以25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)平衡的SP-5PW柱子，随后用30-80％溶液B(B＝25mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0)以pH梯度的方式用1.0ml/分钟流速洗脱25分钟收集IL-2馏分。将收集的馏分通过以(1)0.1％TFA及(2)0.1％TFA+80％乙腈(80％∶20％)平衡的ODP-50柱子(4.6mmID×150mmL)，随后用20-100％溶液B以线性浓度梯度的方式用0.8ml/分钟流速洗脱15分钟收集IL-2馏分。将收集到的馏分进行冷冻干燥以得到的粉末状的IL-2。工作实例9(IL-2特性的测定)a)SDS聚丙酰胺凝胶电泳分析将在工作实例8中所得的粉末状的IL-23μg混悬于样本缓冲液中[Laemmli，Nature，227，680(1970)]并将混悬液与100mM DTT一起于100℃加热5分钟，随后用Nulti凝胶10/20(DaiichiPure Chemicals进行电泳。电泳后，以考马斯亮蓝对凝胶染色并且只可见纯化蛋白质的一条带。其结果可见图4所示。在图4中，第1-2道分别代表IL-2及分子量标示物。b)N-末端氨基酸序列分析在工作实例8中得到的1nmol IL-2的N-末端氨基酸序列是使用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems，477A model)来测定的。在工作实例8中得到的IL-2 N-末端的氨基酸序列与IL-2的cDNA序列所预计的一致。结果可见表10。[表10]N-末端氨基酸序列分析残基编号 检出的PTH1)-氨基 由IL-2 cDNA序列预测的氨基酸1 Ala Ala2 Pro Pro3 Thr Thr4 Ser Ser5 Ser Ser6 Ser Ser7 Thr Thr8 Lys Lys9 Lys Lys
10 Thr Thr11 Gln Gln12 Leu Leu13 Gln Gln14 Leu Leu15 Glu Glu16 His His17 Leu. Leu18 Leu Leu19 Leu Leu20 Asp Asp1)乙内酰苯硫脲c)氨基酸组成的分析使用工作实例8中所得的20μg IL-2采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定氨基酸的组成。在工作实例8中得到的IL-2的氨基酸组成与IL-2的cDNA序列所预计的一致。结果可见表11。[表11]氨基酸组成的分析氨基酸 每1mol残基的数目由IL-2 cDNA序列预测的数值Asx 12.0 12Thr1)12.9 13Ser1)8.0 8Glx 18.5 18Pro 5.0 5Gly 2.1 2Ala5.0 5Cys-3Val3.5 4Met4.0 4Ile9.1 9Leu22.4 22Tyr3.0 3Phe6.0 6His3.1 3Lys11.0 11Arg4.1 4Trp-1酸水解(6N HCl，1％苯酚，110℃，经24和48小时水解后所得的均值)1)水解时间为0小时的推测值-未检测出d)C-末端氨基酸的分析使用工作实例8中所得的约15nmol IL-2，采用氨基酸分析仪(Beckman 6300E system)测定C-末端上的氨基酸。在工作实例8中得到的IL-2C-末端上的氨基酸与IL-2的cDNA序列所预计的一致。结果可见表12。[表12]C-末端氨基酸的分析IL-2 C-末端氨基酸 产率(％)Thr 30.0汽相肼解(100℃，3.5小时)e)IL-2生物活性的测定依照Biochem.Biophy s.Res.Commun.，109，363(1982)所述的方法，使用IL-2依赖细胞将在工作实例8中纯化所得的IL-2进行分析，结果显示工作实例8中纯化所得的IL-2与标准品的活性几乎一致。
按照本发明的方法，可将N-末端蛋氨酸残基从N-末端带有蛋氨酸残基的肽或者其盐(包括蛋白质)中选择性地，特异地并有效地去除掉。依照本发明，任何肽类都可在温和的条件下通过化学方法将N-末端蛋氨酸残基去除。所以，本发明对于采用基因重组技术制备的天然型肽的工业生产，也就是去除N-末端蛋氨酸残基的技术是非常有意义的。参考实例6(应用T7启动子构建人生长激素(hGH)表达载体)如日本专利公开号12996/1994中所述将从质粒pHGH107(ATCC 31538或ATCC 40011)中分离出的hGH结构基因作为约0.75kb EcoRI-EcoRV片段。另一方面，从质粒pET-3C上分离出的T7启动子和耐氨苄青霉素基团作为约4.6kb NdeI-BanHI片段[Rosenberg et al.，Gene，56，125(1987)]。用T4 DNA聚合酶处理这两个片段并用T4 DNA连接酶连接，接着将其引入大肠杆菌JM109中并筛选抗氨苄青霉素的转化体。从获得的12个克隆中，制备质粒并用PstI消化。结果发现有6个克隆的hGH基因是以正确方向插入到质粒中的。由6个克隆中的一个转化体得到质粒被命名为pTGA201。参考实例7(Met-人类hGH在大肠杆菌中表达)用具有T7噬菌体的RNA多聚酶基因的lambda噬菌体(Studier，supra)转化大肠杆菌JM109.。然后，将参考实例6中所得的hGH表达载体pTGA201.引入大肠杆菌JM109(DE3)，从而得到大肠杆菌JM109(DE3)/pTGA201[FERMBP-5632；IFO16001]。
将转化的大肠杆菌JM109(DE3)/pTGA201接种于含有1L LB培养液(pH7.0)具有2L容量的培养瓶内，该培养液包括有1％细菌培养用胰蛋白胨，0.5％细菌培养用酵母提取物，0.5％氯化钠及50μg/ml氨苄青霉素，然后将其在30℃条件下旋转振摇培养16小时。然后将所得培养液转移到含有20升LB培养液
容量为50升的发酵罐内，其后在37℃条件下搅动通风培养6小时。再将所得培养液转移到含有360升制备培养液[1.68％磷酸氢钠，0.3％磷酸二氢钾，0.1％氯化铵，0.05％氯化钠，0.024％硫酸镁，0.02％抗泡沫剂(New pole LB-625)0.0005％盐酸硫胺素，1.5％葡萄糖，1.5％酪蛋白氨基酸]容量为500升的发酵罐内，在37℃条件下搅动通风培养。当培养液的Klett值变为约500时，将100mg/L/分钟的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷加入培养液中继续培养4小时。将培养液离心从而收集湿重约4.5kg的细胞并在-80℃冷冻储存。参考实例8Met-hGH的活化将参考实例7中所得的2kg湿细胞溶于6升50mMTris-HCl和盐酸胍(pH8.0)的溶液中，随后进行离心(10000rpm，120分钟)。将18升含有50mM Tris-HCl，0.28mM GSSG和0.7M精氨酸的溶液(pH 8.0)加入到得到的6升上清液中调节pH至8.0，随后在4℃条件下静置5天以继续激活Met-hGH。参考实例9(Met-hGH的纯化)将参考实例8中所得的溶液在电传导不超过10mS的条件下进行盐析，并加入20mM Tris-HCl及2.5M尿素的溶液(pH 8.0)用Pellicon试剂盒系统(PTGC membrane；Millipore Corporation)进行浓缩。将所得浓缩物进行离心(10000rpm，60分钟)从而得到5升的上清液。将上清液装入以20mM Tris-HCl及2.5M尿素溶液(pH 8.0)平衡的DEAE-Toyopearl 650M柱子(20cmφ×84cm，Tosob)，随后进行吸附及冲洗。用0-25％溶液B(B＝20mM Tris-HCl，2.5M尿素，1M NaCl，pH 8.0)以线性浓度梯度方式以300ml/分钟的流速洗脱100分钟。再将含有Met-hGH的洗脱液10升进行盐析并用Pellicon试剂盒系统(PTGC membrane；Millipore Corporation)进行浓缩。使用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将浓缩液通过DEAE-5PW柱子(21cmφ×30cm，Tosob)。用70-85％溶液B(A＝50mM Tris-HCl，2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]及2.5M尿素(pH4.0))以pH梯度方式以320ml/分钟的流速将该柱洗脱70分钟。向所得的6升Met-hGH馏分中加入2M Tris-HCl(pH7.8)将pH值调整至7.2，随后使用Pellicon试剂盒系统(PTGC membrane；Millipore Corporation)进行盐析和浓缩从而得到9,979mg的Met-hGH。工作实例10(N-端Met的去除)将参考实例9中得到的1650ml Met-hGH中加入含有35mM硫酸铜，2.5M二羟乙酸及6M吡啶的溶液413ml，并且搅拌该混合物，然后在在25℃条件下静置1小时。将反应液以3升/小时流速通过用20mM Tris-HCl和2.5M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25的柱子(11.3cmφ×12.5cm，Pharmacia)，用同样的溶液冲洗柱子来收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。将4L含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM邻苯二胺及3M尿素伴随搅拌直接加到该馏分中。洗脱后，将8L反应液在4℃条件下静置3天。反应液使用Pellicon试剂盒系统(PTGC membrane；Millipore Corporation)进行盐析。将浓缩的反应液4L以3升/小时流速通过用20mMTris-HCH和2.5M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(11.3cmφ×140cm，Pharmacia)，从而收集4.7升hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLCsystem；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(21cmφ×30cm，.Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCH和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素pH4.0)以pH梯度的方式以320ml/分钟流速洗脱70分钟收集10升hGH馏分。向收集Met-hGH馏分中加入500ml 2M Tris-HCl(pH 7.8)将pH值调整至7.2，接着应用Minitan II(PTGC膜；Millipore)进行浓缩。将浓缩液500ml以2升/小时流速通过用蒸馏水平衡的Sephaeryl S-100柱子(11.3cmφ×50cm，Pharmacia)，收集1651ml的hGH，随后再用Millipack 60(Millipore)过滤，获得hGH溶液1487ml(3309mg hGH).工作实例11(hGH特性的测定)a)SDS聚丙酰胺凝胶电泳分析往工作实例10中所得的hGH溶液中加入同体积含有100mM DTT的样本缓冲液[Laemmli，Nature，227，680(1970)]，混合物于95℃加热2分钟，随后用Multi凝胶10/20(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd)进行电泳。电泳后，以考马斯亮蓝对凝胶染色并且只可获得一条大约22kd纯化蛋白质条带。其结果见图5所示。在图5中，第1-2道分别代表分子量标示物及hGH。b)N-末端氨基酸序列分析在工作实例10中得到的hGH N-末端氨基酸序列是使用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems，477A model)来测定的。
在工作实例10中得到的hGH N-末端氨基酸序列与由hGH的cDNA序列所预计的一致。结果可见表13。[表13]N-末端氨基酸序列分析残基编号检出的PTH1)-氨基酸(pmol) 由hGH cDNA序列预测的氨基酸1 Phe(949) Phe2 Pro(404) Pro3 Thr(422) Thr4 Ile(744) Ile5 Pro(283) Pro6 Leu(514) Leu7 Ser(136) Ser8 Arg(36) Arg9 Leu(377) Leu10 Phe(408) Phe
11 Asp(77)Asp12 Asn(230) Asn13 Ala(435) Ala14 Met(334) Met15 Leu(398) Leu16 Arg(67)Arg17 Ala(488) Ala18 His(30)His19 Arg(42)Arg20 Leu(406) Leu1)乙内酰苯硫脲c)氨基酸组成的分析使用工作实例10中所得的20μg hGH采用氨基酸分析仪(L-8500A，Hitachi)测定氨基酸的组成。在工作实例10中得到的hGH的氨基酸组成与hGH的cDNA序列所预计的一致。结果可见表14。[14]氨基酸组成的分析氨基酸 每1mol残基的数目 由hGH cDNA序列预测的数值Asx 20.2 20Thr1)10.0 10Ser1)16.7 18Glx 2727Pro 8.1 8Gly 8.2 8Ala 7.6 7Cys2)N.D. 4Val 7.0 7Met 3.0 3Ile 7.7 8Leu 27.9 26Tyr 8.1 8Phe 12.7 13His 3.2 3Lys 8.9 9Arg 10.9 11Trp 0.8 1酸水解(6N HCl，4％硫代乙醇酸，110℃，经24和48小时水解后所得的均值)1)水解时间为0小时的推测值2)未检测出d)C-末端氨基酸的分析使用工作实例10中所得的约15nmol hGH采用氨基酸分析仪(L-8500A，Hitachi)测定C-末端上的氨基酸。在工作实例10中得到的hGH C-末端上的氨基酸与hGH的cDNA序列所预计的一致。结果可见表15。[表15]C-末端氨基酸的分析C-末端氨基酸产率(％)Phe52汽相肼解(100℃，3.5小时)工作实例12(rhGH生物活性的测定)依照Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，51，1058(1980)所述的方法，使用Nb2细胞将在工作实例10中纯化所得的hGH进行分析，结果显示工作实例10中纯化所得的hGH与标准品(ChemiconInternational，USA)的活性几乎一致。工作实例13(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH用20mM Tris-HCH和8M尿素溶液(pH8.0)来取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至10mg/ml。向所得的1ml溶液中加入含有20mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，20mM氯化镍及6M尿素的1ml溶液(pH7.0)，搅拌混合物，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mMTris-HCl和4M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM邻苯二胺的溶液，并且搅拌该混悬液，在37℃条件下静置15小时。将反应液通过用20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，.Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素pH4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。工作实例14(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液用20mM Tris-HCH和8M尿素溶液(pH8.0)来置换，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至10mg/ml。向所得的1ml溶液中加入含有20mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，20mM氯化钴及6M尿素的1ml(pH7.0)溶液，搅拌混合物，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mM Tris-HCH和4M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM邻苯二胺的溶液，并且搅拌该混悬液，在37℃条件下静置15小时。将反应液通过用20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的SephadexG-25的柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素pH4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟收集hGH馏分。工作实例15(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液用20mM Tris-HCH和8M尿素溶液(pH8.0)取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至10mg/ml。向所得的1ml溶液中加入含有20mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸锌及6M尿素的1ml溶液，搅拌混合液，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mMTris-HCH和4M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM邻苯二胺的溶液，并且搅拌该混合物，在37℃条件下静置15小时。将反应液通过用20mMTris-HCl溶液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素(pH4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。工作实例16(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液用20mM Tris-HCl和8M尿素溶液(pH8.0)取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至10mg/ml。向所得的1ml溶液中加入含有20mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，20mM乙酸铜及6M尿素的1ml溶液，搅拌混合液，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mM Tris-HCl和4M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM邻苯二胺的溶液，并且搅拌该混合液，在37℃条件下静置15小时。将反应液通过用20mM Tris-HCl溶液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素(pH4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。
工作实例17(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液20mM Tris-HCl和8M尿素溶液(pH8.0)取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至10mg/ml。向所得的1ml溶液中加入含有20mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜及6M尿素的1ml溶液，搅拌混合液，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mM Tris-HCl和4M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM邻苯二胺的溶液，并且搅拌该混合液，在37℃条件下静置15小时。将反应液通过用20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的SephadexG-25的柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素(pH4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。工作实例18(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液用20mM Tris-HCl和8M尿素溶液(pH 8.0)取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至10mg/ml。向所得的1ml溶液中加入含有20mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜及6M尿素的1ml溶液，搅拌混合液，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mM Tris-HCl和4M尿素溶液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM4-氯-邻苯二胺的溶液，并且搅拌该混合液，在37℃条件下静置15小时。将反应液通过用20mMTris-HCl溶液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素(pH 4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。工作实例19(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液用20mM Tris-HCl和8M尿素溶液(pH8.0)取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至10mg/ml。向所得的1ml溶液中加入含有20mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜及6M尿素的1ml溶液，搅拌混合液，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mM Tris-HCl和4M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM 3，4-氨基-二氨基苯甲酸的溶液，并且搅拌该混合液，在37℃条件下静置15小时。将反应液通过用20mMTris-HCl溶液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH 8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素(pH 4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。工作实例20(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液用20mM Tris-HCl和8M尿素溶液(pH8.0)取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至10mg/ml。向所得的1ml溶液中加入含有20mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜及6M尿素的1ml溶液，搅拌混合液，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mM Tris-HCl和4M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，80mM半胱胺的溶液，并且搅拌该混悬液，在37℃条件下静置15小时。将反应液通过用20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素(pH4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。工作实例21(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液用20mM Tris-HCl和3M尿素溶液(pH8.0)取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43 mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至5mg/ml。向所得的2ml溶液中加入含有0.8mM乙酸，4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，10mM硫酸铜及2.5M尿素的2ml溶液，搅拌混合液，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mM Tris-HCl和2.5M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，3M尿素和80mM邻苯二胺的溶液，并且搅拌该混悬液，在4℃条件下静置3天。将反应液通过用含20mMTris-HCl和2.5M尿素的溶液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLCsystem；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M尿素(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素(pH 4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。工作实例22(N-末端Met的去除)将参考实例9中得到的Met-hGH溶液用20mM Tris-HCl和3M尿素溶液(pH8.0)取代，使用超滤系统(Diaflo membrane YM 10，43 mm；Amicon)将Met-hGH浓缩至5mg/ml。向所得的2ml溶液中加入1M咪唑，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜及2.5M尿素的2ml溶液，搅拌混合液，室温条件下静置60分钟。使反应液通过用20mM Tris-HCl和2.5M尿素缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×30cmL，Pharmacia)，收集Met-hGH的二酮衍生物馏分。向洗脱的溶液中加入同体积含有4M乙酸，4M乙酸钠，3M尿素和80mM邻苯二胺的溶液，并且搅拌该混合液，在4℃条件下静置3天。将反应液通过用含20mMTris-HCl和2.5M尿素的溶液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱子(10mmID×40cmL，Pharmacia)，从而收集到hGH馏分。采用HPLC方法(Gilson HPLC system；Gilson)将所收集到的馏分通过DEAE-5PW柱子(2.15cmφ×15cm，Tosoh)。随后用70-85％溶液B(A＝50mMTris-HCl和2.5M(pH8.0)；B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸盐]和2.5M尿素(pH 4.0))以pH梯度的方式用7.5ml/分钟流速洗脱70分钟，收集hGH馏分。工作实例23将参考实例4中得到的10mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有50mM硫酸铜0.5ml，二羟乙酸0.25g，及吡啶0.5ml的溶液(pH 5.0)，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素和50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。将反应液通过以50mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集N-末端不带蛋氨酸的BTC馏分。将所收集到的BTC馏分的pH调节到6.0，然后将其装入以200mM NaCl和100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.0)平衡的SP-5PW柱子(7.5｀mID×75mmL，Tosoh)，随后用0-100％溶液B(B＝100mM磷酸盐缓冲液+200mM氯化钠，pH 9.0)以线性浓度梯度的方式用0.8ml/分钟流速洗脱30分钟，收集BTC馏分。将收集的馏分通过以0.1％TFA平衡的ODP-50柱子(10mmID×250mmL，Showa Denco)。随后用20-60％溶液B(B＝80％乙腈/0.1％TFA)以2ml/分钟流速洗脱40分钟，收集BTC馏分。将收集到的馏分进行冷冻干燥，得到760μg粉末状的BTC。工作实例24(BTC特性的测定)a)SDS聚丙酰胺凝胶电泳分析往工作实例23中所得的BTC溶液中加入含100mM DTT的样本缓冲液中[Laemmli，Nature，227，680(1970)]并将混合液于95℃加热1分钟，随后用Multi凝胶15/25(Daiichi Pure Chemicals进行电泳。电泳后，以考马斯亮蓝对凝胶染色并且只获得一条约16kd的纯化蛋白质带。结果发现所得BTC在用DTT还原条件下形成了强二聚物。结果可见图6所示。在图6中，第1-2道分别代表分子量标示物及BTC。b)N-末端氨基酸序列分析在工作实例23中得到的BTC N-末端氨基酸序列是使用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems，477A model)来测定的。在工作实例23中得到的BTC N-末端氨基酸序列与BTC的cDNA序列所预计的一致。结果可见表16。[表16]N-末端氨基酸序列分析残基编号检出的PTH1)-氨基酸(pmol) 由BTC cDNA序列预测的氨基酸1Asn(271) Asn2Gly(432) Gly3Asn(249) Asn4Ser(95) Ser5Thr(150) Thr6Arg(98) Arg7Ser(89) Ser8Pro(255) Pro9Glu(177) Glu10 Thr(140) Thr11 Asn(139) Asn12 Gly(187) Gly13 Leu(227) Leu14 Leu(281) Leu15 N.D. Cys16 Gly(126) Gly17 Asp(70) Asp18 Pro(100) Pro19 Glu(44) Glu20 Glu(75) Glu使用1nmolBTC来进行分析。
1)乙内酰苯硫脲c)氨基酸组成的分析使用工作实例23中所得的20μg BTC，采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定氨基酸的组成。在工作实例23中得到的BTC的氨基酸组成与BTC的cDNA序列所预计的一致。结果可见表17。[表17]氨基酸组成的分析氨基酸 每1mol残基的数目由BTC cDNA序列预测的数值Asx 7.0 7Thr1)5.9 6Ser1)4.8 5Glx 9.1 9Pro 4.0 4Gly 7.1 7Ala 4.0 4Cys2)N.D. 8Val 4.6 4Met 0 0Ile 1.9 2Leu 3.0 3Tyr 4.0 4Phe 3.0 3His 2.4 2Lys 5.1 5Arg 7.0 7Trp2)N.D. 0酸水解(6N HCl，1％苯酚，110℃，经24和48小时水解后所得的均值)1)水解时间为0小时的推测值2)未检测出d)C-末端氨基酸的分析使用工作实例23中所得的约15nmol BTC，采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定C-末端上的氨基酸。在工作实例23中得到的BTC C-末端上的氨基酸与BTC的cDNA序列所预计的一致。结果可见表18。[表18]C-末端氨基酸的分析C-末端氨基酸产率(％)Thr 60.5汽相肼解(100℃，3.5小时)工作实例25(BTC生物活性的测定)依照Molecular Cell Biology，8，588(1988)所述的方法，使用BALB/c3T3 A31-714克隆4(International Journal of Cancer，12，463(1973))进行工作实例23中纯化所得的BTC的分析，结果显示工作实例23中纯化所得的BTC具有促进细胞生长的活性，并与标准品的活性几乎一致(在日本专利公开87894/1994的工作实例13中所述的纯化BTCI)。工作实例26将参考实例4中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液中加入含有50mM硫酸铜0.5ml，二羟乙酸0.25g，及吡啶0.5ml的溶液(pH 5.0)，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素和50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻甲苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例27将参考实例4中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有50mM硫酸铜0.5ml，二羟乙酸0.25g，及吡啶0.5ml的溶液(pH 5.0)，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素和50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入2，3二氨基苯酚使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例28将参考实例4中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于4ml的3M尿素溶液中。向该混合液加入含有50mM硫酸铜0.5ml，二羟乙酸0.25g，及吡啶0.5ml的溶液(pH 5.0)，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素和50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入2，3二氨基苯甲酸使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC.工作实例29将参考实例4中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于4ml3M尿素溶液中。向该混悬液加入含有50mM硫酸铜0.5ml，二羟乙酸0.25g，及吡啶0.5ml的溶液(pH5.0)，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素和50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入4-氯邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例30将参考实例4中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有50mM硫酸铜0.5ml，二羟乙酸0.25g，及吡啶0.5ml的溶液(pH 5.0)，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素和50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将半胱胺加到该馏分中使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例31将参考实例4中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于2ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有4M乙酸钠，20mM乙酸，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸镍及6M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。.工作实例32将参考实例4中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于2ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有4M乙酸钠，20mM乙酸，0.4M二羟乙酸，20mM氯化钴及6M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例33将参考实例4中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有，20mM乙酸，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸锌及6M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例34将参考实例4中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于2ml3M尿素溶液中。向该混悬液加入含有4M乙酸钠，50mM乙酸铜0.5ml，0.25g二羟乙酸及0.5ml吡啶的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例35将参考实例4中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于2ml的3M尿素溶液中。向该混悬液加入含有4M乙酸钠，0.8mM乙酸，0.4M二羟乙酸，10mM硫酸铜及3M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例36将参考实例4中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-BTC溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有1M咪唑，0.5M二羟乙酸，20mM硫酸铜及3M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-BTC的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例23中同样方法纯化反应液以获得纯化的BTC。工作实例37将参考实例3中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有二羟乙酸0.25g，50mM硫酸铜0.5ml及吡啶0.5ml的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。将反应液通过以50mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集N-末端不带蛋氨酸的NT-3馏分。将所收集到的馏分的pH调节到6.0，然后将其装入以200mM NaCl和100mM磷酸盐缓冲液(pH5.0)平衡的SP-5PW柱子(21.5mmID×150mmL，Tosoh)，随后用0-100％溶液B(B＝100mM磷酸盐缓冲液+200mM氯化钠，pH9.0)以线性浓度梯度的方式用6ml/分钟流速洗脱55分钟，收集NT-3馏分。将收集的馏分通过以0.1％TFA平衡的ODP-50柱子(10mmID×250mmL，Showa Denco)。随后用20-60％溶液B(B＝80％乙腈/0.1％TFA)以2ml/分钟流速洗脱40分钟，收集NT-3馏分。将收集到的馏分进行冷冻干燥，得到600μg的NT-3。工作实例38(NT-3特性的测定)a)SDS聚丙酰胺凝胶电泳分析往工作实例37中所得的NT-3溶液中加入含100mM DTT的样本缓冲液[Laemmli，Nature，227，680(1970)]并将混合液于100℃加热1分钟，随后用Multi凝胶15/25(Daiichi Pure Chemicals)进行电泳。电泳后，以考马斯亮蓝对凝胶染色并且只获得一条纯化蛋白质带。其结果可见图7所示。在图7中，第1-2道分别代表分子量标示物及NT-3。b)N-末端氨基酸序列分析在工作实例37中得到的NT-3 N-末端氨基酸序列是使用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems，477A model)来测定的。在工作实例37中得到的NT-3 N-末端氨基酸序列与NT-3的cDNA序列所预计的一致。结果可见表19。[表19]N-末端氨基酸序列分析残基编号 检出的PTH1)-氨基酸(pmol)由NT-3 cDNA序列预测的氨基酸1 Tyr(499) Tyr2 Ala(762) Ala3 Glu(609) Glu4 His(371) His5 Lys(725) Lys6 Ser(190) Ser
7 His(285) His8 Arg(254) Arg9 Gly(474) Gly10 Glu(373) Glu11 Tyr(391) Tyr12 Ser(128) Ser13 Val(412) Val14 N.D. Cys15 Asp(219). Asp16 Ser(56)Ser17 Glu(141) Glu18 Ser(68)Ser19 Leu(142) Leu20 Trp(40)Trp使用1nmol的NT-3来进行分析。1)乙内酰苯硫脲c)氨基酸组成的分析使用工作实例37中所得的20μg NT-3，采用氨基酸分析仪(Beckman6300E system)测定氨基酸的组成。在工作实例37中得到的NT-3的氨基酸组成与NT-3的cDNA序列所预计的一致。结果可见表20。[表20]氨基酸组成的分析氨基酸 每1mol残基的数目 由BTC cDNA序列预测的数值Asx 11.1 11Thr1)9.0 9Ser1)12.0 12Glx 11.0 11Pro 2.0 2Gly 7.8 8Ala 4.7 5Cys2)N.D. 6Val 9.0 9Met 00Ile 6.6 7Leu 5.1 5Tyr 4.8 5Phe 0.9 1His 4.1 4Lys 10.0 10Arg 9.8 10Trp2)N.D. 4酸水解(6N HCl，1％苯酚，110℃，经24和48小时水解后所得的均值)1)水解时间为0小时的推测值2)未检测出d)C-末端氨基酸的分析使用工作实例37中所得的约15nmol NT-3，采用氨基酸分析仪(Beckman 6300E system)测定C-末端上的氨基酸。在工作实例37中得到的NT-3 C-末端上的氨基酸与NT-3的cDNA序列所预计的一致。结果可见表21。[表21]C-末端氨基酸的分析
C-末端氨基酸产率(％)Thr 42.0汽相肼解(100℃，3.5小时)工作实例39(NT-3生物活性的测定)使用DRG对从工作实例37中纯化所得的NT-3进行分析，结果显示工作实例37中纯化所得的NT-3具有与从CHO细胞中获得的NT-3几乎一致的活性。工作实例40将参考实例3中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于4ml3M尿素溶液中。向该混悬液加入含有二羟乙酸0.25g，50mM硫酸铜0.5ml及吡啶0.5ml的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入甲苯-3，4-二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例41将参考实例3中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有二羟乙酸0.25g，50mM硫酸铜0.5ml及吡啶0.5ml的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入2，3，-二氨基苯酚使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例42将参考实例3中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有二羟乙酸0.25g，50mM硫酸铜0.5ml及吡啶0.5ml的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入3，4-二氨基苯甲酸使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例43将参考实例3中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有二羟乙酸0.25g，50mM硫酸铜0.5ml及吡啶0.5ml的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入4-氯邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例44将参考实例3中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于4ml3M尿素溶液中。向该混液加入含有二羟乙酸0.25g，50mM硫酸铜0.5ml及吡啶0.5ml的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入半胱胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例45将参考实例3中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于2ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有4M乙酸钠，20mM乙酸，0.4mM二羟乙酸，20mM硫酸镍及6M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例46将参考实例3中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于2ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有4M乙酸钠，20mM乙酸，0.4mM二羟乙酸，20mM氯化钴及6M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例47将参考实例3中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于2ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有4M乙酸钠，20mM乙酸，0.4mM二羟乙酸，20mM硫酸锌及6M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例48将参考实例3中得到的40mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于4ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有50mM乙酸铜0.5ml，0.25g二羟乙酸及0.5ml吡啶的溶液，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例49将参考实例3中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于2ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有4M乙酸钠，0.8mM乙酸，0.4M二羟乙酸，10mM硫酸铜及3M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。工作实例50将参考实例3中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的Met-NT-3溶于2ml3M尿素溶液中。向该混合液加入含有1M咪唑，0.5M二羟乙酸，20mM硫酸铜及3M尿素的溶液2ml，在25℃条件下静置1小时。将反应液通过用2.5M尿素及50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以同样的缓冲液以6ml/分钟的流速冲洗柱子从而收集Met-NT-3的二酮衍生物馏分。将同体积的4M乙酸-4M乙酸钠溶液加到该馏分中，然后再加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行15小时。应用工作实例37中同样方法纯化反应液以获得纯化的NT-3。
变性Met-NT-3的激活以及激活Met-NT-3的纯化可应用以下方法。具体方法将从参考实例3(5)中得到的粒状沉淀溶液离心(10000rpm)，向所得的上清中加入含1.8M尿素，0.2M精氨酸，0.2mM GSSG及1.0mM GSH的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)将其稀释约20倍体积。将混合物在4℃的条件下静置4周使变性的Met-NT-3进行重折叠(激活).
重折叠后，将溶液的pH调整到6.0并且装入用100mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的SP-Sepharose柱子(22mmID×120mmL)，接着用100mM磷酸盐缓冲液+100mM NaCl(pH6.0)的溶液洗脱柱子从而收集Met-NT-3馏分。将收集的馏分通过用0.1％TFA平衡过ODP-50柱子(21.5mmID×300mmL，Showa)，接着用0-80％B(B＝乙腈/0.1％TFA)以5ml/分钟的流速洗脱柱子从而收集Met-NT-3馏分。将收集的馏分冷冻干燥获得粉末状的Met-NT-3。
除了上述的精氨酸，瓜氨酸，丙氨酸，缬氨酸，天冬氨酸等都可用来使上述变性的肽进行重折叠。工作实例51将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M氯化镍，4M乙酸钠，20mM乙酸及6M尿素的溶液3.375ml，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。以工作实例8中同样的方法处理反应液从而获得冷冻干燥的粉末状IL-2。工作实例52将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M氯化钴，4M乙酸钠，20mM乙酸及6M尿素的溶液3.375ml，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。以工作实例8中同样的方法处理反应液从而获得冷冻干燥的粉末状IL-2。工作实例53将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M硫酸锌，4M乙酸钠，20mM乙酸及6M尿素的溶液3.375ml，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例54将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M乙酸铜，4M乙酸钠，20mM乙酸及6M尿素的溶液3.375ml，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例55将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M硫酸铜3.375ml及吡啶3.375ml的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入半胱胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例56将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混悬液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M硫酸铜3.375ml及吡啶3.375ml的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入亚甲苯基-3，4-二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例57将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M硫酸铜3.375ml及吡啶3.375ml的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入4-氯-邻苯二胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例58将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M硫酸铜3.375ml及吡啶3.375ml的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入3，4-二氨基苯甲酸使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例59将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混悬液加入含有1.55g二羟乙酸，0.1M硫酸铜3.375ml及吡啶3.375ml的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的SephadexG-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入2，3-二氨基苯酚使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例60将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入同体积的含有0.5M二羟乙酸，20mM硫酸锌，40mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)及6M尿素的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例61将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入同体积的含有0.5M二羟乙酸，20mM乙酸铜，40mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)及6M尿素的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例62将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入同体积的含有0.5M二羟乙酸，20mM氯化镍，40mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)及6M尿素的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例63将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中。向该混合液加入同体积的含有0.5M二羟乙酸，20mM氯化钴，40mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)及6M尿素的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。工作实例64将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)中，接着在2升含有3M尿素的20mM Tris-HCL(pH8.0)溶液中透析。向该透析过的溶液中加入同体积的含有1M咪唑，0.5M二羟乙酸，20mM硫酸铜及2.5M尿素的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的11-2。工作实例65将参考实例5中得到的20mg N-末端带有蛋氨酸的白介素-2(Met-IL-2)溶于27ml的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)中，接着在2升含有3M尿素的20mM Tris-HCL(pH 8.0)溶液中透析。向该透析过的溶液中加入同体积的含有4M乙酸钠，0.4M二羟乙酸，10mM硫酸铜，0.8M乙酸及2.5M尿素的溶液，在室温条件下静置1小时。将反应液通过用20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)平衡的Sephadex G-25柱子(25mmID×600mmL)，并以300ml/小时的流速冲洗柱子从而收集Met-IL-2的二酮衍生物馏分。向该馏分中加入邻苯二胺使其终浓度为20mM，随后抽真空并以氮气密封，反应在37℃下进行21小时。应用工作实例8中同样的方法纯化反应液以获得冻干粉末状的IL-2。参考实例10将在EP-A-499990和JP-A-304976/1993中所述的大肠杆菌MM294(DE3)/pE-C35PTH[IFO 15213]接种到1L含有1％细菌培养用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠及50μg/ml氨苄青霉素的培养液(pH7.0)中，将其在30℃条件下旋转振摇培养。然后将所得1L培养液转移到19L含有1％细菌培养用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，和0.5％氯化钠的培养液(pH 7.0)中，其后在37℃搅动通风条件下培养8小时，再将所得17L培养液转移到含有343升M-9培养液
的500L发酵罐内，其后在37℃搅动通风条件下培养7小时从而得到350L培养液。将所得的培养液离心从而收集湿重约4kg的细胞并在-80℃冷冻储存。参考实例11向参考实例10中所得的10g湿润细胞中加入含7M盐酸胍的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)40ml并且将细胞溶于该溶液，随后进行离心(10000rpm，60分钟)获得40ml细胞提取物。用大约2L 20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)稀释细胞提取物，随后离心(4200rpm，20分钟)从而得到约2L细胞上清液，将细胞上清液装入SP-Toyopearl 650M柱子(5cmφ×30cm，Tosob)，随后进行吸附及冲洗。用含1M NaCl的20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)洗脱柱子。使用HPLC方法将洗脱液装入ODS-120T柱子(21.5cmφ×30cm，Tosob)，随后用(1)含有0.1％TFA和(2)含0.1％TFA的80％乙腈以线性浓度梯度方式洗脱从而得到大约30ml的Met-[Cys35]-PTH(1-84)馏分。将该馏分在含有6M尿素的0.1M乙酸溶液(5L)中进行透析。向所得的溶液中加入约4mg的DMAP-CN[1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓三氟硼酸盐]，将溶液在室温条件下静置15分钟以获得Met-[Cys(CN)35]-PTH(1-84)。将获得的反应液装入SP-Toyopearl 650M柱子(1.0cmφ×30cm，Tosob)并用含10mMNaCl的20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)冲洗柱子以去除反应剂。随后用1M NaCl的20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)进行洗脱。将洗脱的溶液在5L的6M尿素溶液中透析。将获得的溶液(约8ml)冰浴冷却，向其中加入1N NaOH约400ul，将混合物在0℃条件下静置10分钟。以20mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)平衡Toyopearl HW-50F(2cmφ×50cm)柱子，然后用该柱将所得的反应液进行凝胶过滤从而收集Met-PTH(1-34)馏分。使用HPLC方法将该馏分装入ODS-120T柱子(21.5cmφ×30cm，Tosob)，随后用(1)含有0.1％TFA和(2)含0.1％TFA的80％乙腈以线性浓度梯度方式洗脱从而得到大约50ml的Met-PTH(1-34)馏分。将该馏分冷冻干燥获得约5mg的Met-PTH(1-34)。工作实例66将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml蒸馏水中。向该混合液加入含有46.4mg二羟乙酸，2.5mg硫酸铜及94.8mg吡啶的溶液，将混合液在室温条件下静置1小时。将反应液离心并使用HPLC法将所得上清液装入ODP-50柱子(1cmφ×25cm，ShowaDenko)，随后由(1)含有10％乙腈的20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)及(2)含有60％乙腈的20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)组成的溶液以线性浓度梯度方式进行洗脱，从而得到5.4ml Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分进行冷冻干燥并加入4ml蒸馏水。向该混合液中加入含80mM邻苯二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液4ml，随后抽真空并以氮气密封，将混合液在37℃下静置17小时。使用HPLC法将反应液装入ODP-50柱子(1cmφ×25cm，Showa Denko)，随后由(1)含有0.1％TFA及(2)含有0.1％TFA的80％乙腈组成的溶液以线性浓度梯度方式进行洗脱，从而得到PTH(1-34)馏分。将该馏分用20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)稀释5倍并将该稀释液装入用含有2M尿素的20mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)平衡的SP-5PW柱子(7.5mmφ×75mm，Tosoh)，随后用0-50％溶液B(B＝20mM MES，2M尿素及0.5M NaCl)以线性浓度梯度的方式用0.8ml/分钟流速洗脱30分钟，收集PTH(1-34)的馏分并将该馏分用1升蒸馏水透析。将该透析液进行冷冻干燥从而得到冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例67(PTH(1-34)特性的测定)a)SDS聚丙酰胺凝胶电泳分析用100mM DTT的样本缓冲液[NOVEX JAPAN]将在工作实例66中所得的PTH(1-34)粉末悬浮，随后用微型肽聚丙烯酰胺凝胶电泳装置(TEFCO)进行电泳。电泳后，以考马斯亮蓝对凝胶染色并且只获得一条纯化蛋白质带。其结果可见图8所示。在图8中，第1-2道分别代表分子量标示物及PTH(1-34)。b)N-末端氨基酸序列分析在工作实例66中得到的PTH(1-34)N-末端氨基酸序列是使用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems，477A model)来测定的。在工作实例66中得到的PTH(1-34)N-末端氨基酸序列与PTH(1-34)的cDNA序列所预计的一致。结果可见表22。[表22]N-末端氨基酸序列分析残基编号 检出的PTH1)-氨基酸(pmol) 由PTH(1-34)cDNA序列预测的氨基酸
1 Ser(71) Ser2 Val(243)Val3 Ser(91) Ser4 Glu(139)Glu5 Ile(198)Ile6 Gln(55) Gln7 Leu(86) Leu8 Met(118)Met9 His(34) His10 Asn(95) Asn11 Leu(135)Leu12 Gly(77) Gly13 Lys(50) Lys14 His(30) His15 Leu(103)Leu16 Asn(40) Asn17 Ser(29) Ser18 Met(36) Met19 Glu(142)Glu20 Arg(27) Arg使用400pmol的PTH(1-34)来进行分析。1)乙内酰苯硫脲c)氨基酸组成的分析使用工作实例66中所得的PTH(1-34)，采用氨基酸分析仪(HitachiL-8500A Amino Acid Analyzer)测定氨基酸的组成。在工作实例66中得到的PTH(1-34)的氨基酸组成与PTH(1-34)的cDNA序列所预计的一致。结果可见表23。[表23]
氨基酸组成的分析氨基酸 每1mol残基的数目 由PTH(1-34)cDNA序列预测的数值Asx 4.0 4Thr 0 0Ser 2.8 3Glx 4.9 5Pro 0 0Gly 1.0 1.0Ala 0 0Cys1)- 0Val 2.9 3Met 2.0 2Ile 0.9 1Leu 5.0 5Tyr 0 0Phe 1.0 1His 3.0 3Lys 2.9 3Arg 2.0 2Trp 1.0 1酸水解(6N HCl，1％硫代乙醇酸，110℃，经24小时水解后所得的均值)1)未检测出d)C-末端氨基酸的分析使用工作实例66中所得的PTH(1-34)，采用氨基酸分析仪(HitachiL-8500A Amino Acid Analyzer)测定C-末端上的氨基酸。在工作实例66中得到的PTH(1-34)C-末端上的氨基酸与PTH(1-34)的cDNA序列所预计的一致。结果可见表24。[表24]C-末端氨基酸的分析C-末端氨基酸产率(％)Phe94.4汽相肼解(100℃，6小时)e)PTH(1-34)生物活性的测定使用MC3T3-E1细胞(成骨样细胞株)，按照Shizue Nakagawa et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，200，1735(1994)中所述的方法，对从工作实例66中所得的PTH(1-34)进行分析，结果显示工作实例66中所得的PTH(1-34)具有与标准品几乎一致的活性。工作实例68将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM氯化镍，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM邻苯二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例69将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM氯化钴，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混悬液加入4ml含有80mM邻苯二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例70将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸锌，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM邻苯二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例71将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM乙酸铜，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM邻苯二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例72将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml 150mM Tris-HCl(pH 8.5)的溶液。再向该混合液加入半胱胺使其终浓度为40mM，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例73将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM亚甲苯基-3，4-二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例74将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM4-氯邻苯二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例75将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM3，4-二氨基苯甲酸，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例76将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 4M尿素中。向该混合液加入含有4M乙酸铵，0.4M二羟乙酸，20mM硫酸铜，20mM乙酸及4M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM2，3二氨基苯酚，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例77将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 3M尿素及20mM Tris-HCl(pH 8.0)的溶液中。向该混合液加入含有1M咪唑，0.5M二羟乙酸，20mM硫酸铜及2.5M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM邻苯二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。工作实例78将参考实例11中得到的5mg N-末端带有蛋氨酸的Met-PTH(1-34)溶于1ml 3M尿素及20mM Tris-HCl(pH 8.0)的溶液中。向该混合液加入含有4M乙酸钠，0.8M乙酸，0.4M二羟乙酸，10mM硫酸铜及2.5M尿素的溶液1ml，并在室温条件下静置1小时。将反应液离心，并按照工作实例66所述通过HPLC方法使用ODP-50柱子纯化上述的离心上清液，从而得到Met-PTH(1-34)的二酮衍生物馏分。将该馏分冷冻干燥，然后加入4ml蒸馏水。再向该混合液加入4ml含有80mM邻苯二胺，4M乙酸及4M乙酸铵的溶液，随后抽真空并以氮气密封，按照工作实例66中所述的同样方法处理该反应液，从而获得冻干粉末状的PTH(1-34)。
序列表序列ID No1序列长度35序列类型核酸链的数目单链拓扑结构直线序列种类其它核酸合成的DNA序列TATGTACGCG GAGCATAAGA GTCACCGAGG GGAGT序列ID No2序列长度33序列类型核酸链的数目单链拓扑结构直线序列种类其它核酸合成的DNA序列ACTCCCCTCG GTGACTCTTA TGCTCCGCGT ACA序列ID No3序列长度15序列类型核酸链的数目单链拓扑结构直线序列种类其它核酸合成的DNA序列GATCCCTGGC ATGCA序列ID No4序列长度10序列类型核酸链的数目单链拓扑结构直线序列种类其它核酸合成的DNA序列TATGGATGGG序列ID No5序列长度12序列类型核酸链的数目单链拓扑结构直线序列种类其它核酸合成的DNA序列AATTCCCATC CA序列ID No6序列长度22序列类型核酸链的数目单链拓扑结构直线序列种类其它核酸合成的DNA序列ATACATATGG ATGGGAATTC CA序列ID No7序列长度28序列类型核酸链的数目单链拓扑结构直线序列种类其它核酸合成的DNA序列CCGGATCCTA GTAAAACAAG TCAACTCT序列ID No8序列长度18序列类型核酸链的数目单链拓扑结构直线序列种类其它核酸合成的DNA序列TGCCATGAAT TCATGGCA
权利要求
1.除去N-末端蛋氨酸残基的方法，其中该蛋氨酸残基可是氧化的，该方法包括用α-二酮衍生物与N-末端带有蛋氨酸残基的肽或者其盐反应，然后将所得产物进行水解。
2.按照权利要求1中的方法，其中肽是通过基因重组技术来制备的。
3.按照权利要求2中的方法，其中上述由基因重组技术制备出的肽选自生长激素，神经营养蛋白-3，β-动物纤维素，甲状旁腺素，及白介素-2，上述的每一种肽在其N-末端都带有一个选择性氧化的蛋氨酸残基。
4.按照权利要求1中的方法，其中在过渡金属离子存在的条件下α-二酮衍生物参与反应。
5.按照权利要求1中的方法，其中在碱存在的条件下α-二酮衍生物参与反应。
6.按照权利要求1中的方法，其中在过渡金属离子及碱存在的条件下α-二酮衍生物参与反应。
7.按照权利要求1中的方法，其中α-二酮衍生物为二羟乙酸或者其盐。
8.按照权利要求4中的方法，其中过渡金属离子为铜离子。
9.按照权利要求5中的方法，其中碱为吡啶。
10.按照权利要求1中的方法，其中使用碱来进行水解。
11.按照权利要求10中的方法，其中碱为胺衍生物。
12.按照权利要求10中的方法，其中碱为(1)二胺衍生物或者(2)硫代-或者硒基-氨基脲衍生物。
13.按照权利要求12中的方法，其中二胺衍生物为邻苯二胺。
14.一种制备N-末端不带蛋氨酸残基肽的方法，上述的肽包括生长激素，神经营养蛋白-3，β-动物纤维素，甲状旁腺素，及白介素-2或者其盐，该方法包括将二羟乙酸或者其盐在硫酸铜及吡啶存在的条件下，与由基因重组技术制备的N-末端带有蛋氨酸残基的肽或者其盐反应，然后再与邻苯二胺反应。
15.下式化合物CH3-S(O)m-(CH2)3-CO-CO-X其中m为0-2的整数，X为氨基酸残基或肽链，或者其盐。
16.一种制备氨基酸，肽或者其盐的方法，其包括将按权利要求15制备的化合物进行水解。
全文摘要
本发明提供将肽或者其盐N－末端上所带有的选择性氧化蛋氨酸残基有选择的,特异的,有效的化学去除方法。该方法是以α－二酮衍生物与N－末端上所带有的选择性氧化蛋氨酸残基的肽或者其盐反应,随后进行水解。
文档编号C07K1/12GK1178798SQ9711325
公开日1998年4月15日 申请日期1997年6月13日 优先权日1996年6月14日
发明者西村纪, 末永正人, 大前弘明, 辻伸次 申请人:武田药品工业株式会社