专利名称：一种增强间充质干细胞免疫抑制功能的方法
技术领域：
本发明涉及细胞治疗技术领域间充质干细胞技术领域，特别涉及一种增强间充质干细胞免疫抑制功能的方法。
技术背景间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)是中胚层起源的，能够进行自我更新,并具备向成骨、软骨和脂肪细胞分化潜能的一种成体干细胞。因为MSC易于分离培养，增殖能力强，免疫原性较低，且来源广泛不存在伦理学问题，这使其在细胞治疗方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。MSC不仅具有低免疫原性，还具有调节免疫功能的作用。MSC不仅可以通过抑制树突状细胞的成熟和抑制T淋巴细胞，B淋巴细胞以及NK细胞的免疫功能抑制免疫反应，还能分泌多种因子调节免疫系统形成免疫抑制。间充质干细胞的免疫抑制功能使间充质干细胞成为一种良好的生物免疫抑制剂，可以用于器官移植抗排斥反应和自身免疫病如类风湿性关节炎、红斑狼疮、硬皮病、膜肾球肾炎、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血等。但间充质干细胞的免疫抑制疗法需要较大的细胞量才能起到作用，回输大剂量的间充质干细胞可能会产生急性肺栓塞，肝栓塞，肾栓塞，发热，皮疹等副作用，因此如果能提高单个细胞 的免疫抑制能力，在较少细胞量的情况下，间充质干细胞就能起到充分的免疫抑制作用，在提高细胞治疗效力，减少不良副反应，降低治疗成本等方面具有重要意义
发明内容
为了解决以上间充质干细胞的免疫抑制能力较低、需要较大的细胞量才能起作用的问题，本发明提供了一种通过MSC免疫调节过程中的关键蛋白的上调来增强间充质干细胞免疫抑制功能的方法。
本发明是通过以下方式实现的一种增强间充质干细胞免疫抑制功能的方法，将分离的间充质干细胞传代培养，用含有培养因子的培养基培养至细胞70%汇合，再更换溶有IFN- Y、IL-I β和黄体酮的培养基培养。
所述的方法，优选溶有IFN- Y、IL-I β和黄体酮的培养基中含有l_600ng/mL的 IFN- Y U-200ng/mL 的 IL-1 β 和 1-100 μ g/mL 的黄体酮。
所述的方法，优选溶有IFN-Y、IL-I β和黄体酮的培养基中含有50ng/mL的 IFN- Y、20ng/mL 的 IL-1 β 和 10 μ g/mL 的黄体酮。
所述的方法，优选含有培养因子的培养基中含有EGF l-50ng/mL、FGF l_50ng/mL、 VEGF l-50ng/mL和 PDGF l_50ng/mL。
所述的方法，优选含有培养因子的培养基中含有EGF 2ng/mL、FGF 2ng/mL、VEGF 2ng/mL 和 PDGF 2ng/mL。
所述的方法，优选含有培养因子的培养基和溶有IFN- Y、IL-I β和黄体酮的培养基中均含10% (体积比)的胎牛血清和2mM/mL的谷氨酰胺。
所述的方法，优选含有培养因子的培养基和溶有IFN- Y、IL-I β和黄体酮的培养基的基础培养基均为DMEM/F12。3
所述的方法，优选取传代2-5代的间充质干细胞，培养24-48小时，使其达到70%汇合。
所述的方法，优选间充质干细胞在溶有IFN-Y、IL-I β和黄体酮的培养基中培养2-5天后，弃培养基，收获免疫抑制功能增强的间充质干细胞。
所述的方法，优选所述间充质干细胞为人类新生儿脐带间充质干细胞。
通过一些细胞因子和生物分子来刺激MSC细胞表面受体，通过分子通路激活内源基因，上调细胞免疫抑制蛋白的表达和免疫抑制活性物质的分泌，能达到增强MSC免疫抑制功能的效果。Y干扰素(IFN- Y )、白介素I β (IL-I β )和黄体酮不仅能增强MSC对T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的接触抑制，还可以激活MSC内源基因，增加细胞释放的免疫抑制活性物质。细胞因子激活是在不影响MSC细胞内在基因构成，保证生物安全性的基础上提高MSC免疫抑制功能的最好方法。IFN- Y ,IL-I β和黄体酮三种因子联合激活MSC细胞，对于活化不同位置的内源基因，促进多种不同免疫抑制蛋白的分泌起到了强化高效的协同诱导作用。
Y干扰素等细胞因子与MSC表面的受体结合后，通过JAK/STAT信号通路调控细胞核内染色体上相应基因的表达，上调细胞表面蛋白和免疫抑制活性物质的分泌，增强MSC 的免疫抑制功能。因子与靶受体结合，使受体的单链形成二聚体，连接受体的JAK蛋白彼此接近并相互磷酸化激活自己。JAK蛋白一旦被激活，就会磷酸化因子受体的细胞内部分，创建一个细胞质内STAT蛋白可以停靠的区域，STAT—旦与其结合，它的氨基酸顺序上的一个酪氨酸残基就被JAK磷酸化，从而STAT蛋白被激活。磷酸化的STAT形成二聚体并从受体上脱离下来，转位到细胞核作为转录因子识别特定的DNA序列，上调免疫抑制蛋白的表达。
本发明的有益效果(1)本发明使用多种细胞因子联合激活细胞表面的受体，活化MSC内源基因，上调免疫抑制蛋白和分泌性因子的产量，不仅可以增强MSC对免疫系统树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的接触抑制，还可以通过调节炎性因子的浓度使局部的免疫反应进一步减弱；(2)Y干扰素等因子副作用小，成本低，激活细胞受体的效率高，是MSC细胞免疫调节的有效辅助剂；(3)经过IFN-Y ,IL-I β和黄体酮共培养激活后，MSC细胞对淋巴细胞增殖的抑制率提高了 2-7倍，MSC细胞内免疫抑制蛋白的表达提高了 2-12倍，细胞分泌抗炎因子的能力提高了 5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了 10%-30%，MSC细胞的免疫抑制活性大为增加。
图I为实施例I得到的MSC参与混合淋巴细胞反应淋巴细胞增殖抑制率对比图，图2为实施例I得到的MSC免疫抑制蛋白表达上调情况图，图3为实施例I得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的变化情况，图4为实施例2得到的MSC参与混合淋巴细胞反应淋巴细胞增殖抑制率对比图，图5为实施例2得到的MSC免疫抑制蛋白表达上调情况图，图6为实施例2得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的变化情况，图7为实施例3得到的MSC参与混合淋巴细胞反应淋巴细胞增殖抑制率对比图，图8为实施例3得到的MSC免疫抑制蛋白表达上调情况图，图9为实施例3得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的变化情况，各图中的“+因子”代表使用含有IFN-Y、IL-I β、黄体酮为培养因子的培养基培养后得到的MSC。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施实例I :I、增强MSC的免疫抑制功能脐带间充质干细胞的提取使用经产妇同意授权的新生儿脐带作为间充质干细胞的来源。将新生儿脐带在含1% 双抗的生理盐水中洗涤三次，去除表面的血污，然后剪成约I厘米长的小段。用眼科剪将脐带沿血管平行方向纵向剖开，将2根脐动脉和I根脐静脉血管从脐带中剥离干净。剩余华通胶部分用含1%双抗的生理盐水充分洗涤3次，剪碎至约Imm3大小。
将剪碎的组织块均匀的平铺在75cm2培养瓶内，加入5mL培养基，放置在37°C，5% CO2的培养箱内培养5-10天。培养基成分为DMEM/F12 (Hyclone)中加入10% (体积)FBS (胎牛血清，购自 Gibco)、2mM 谷氨酰胺(Sigma)、2ng/mL FGF(R&D)、2ng/m L EGF(R&D)、2ng/ mL VEGF (R&D)和2ng/mL PDGF (R&D)。每隔三天更换一次培养基，细胞长满后传代培养。
取传代2-5代的间充质干细胞重铺于75cm2培养瓶(Corning)中，在与传代培养时相同的培养基中培养24-48小时至细胞70%汇合。此时更换培养基为10% (体积)胎牛血清、2mM/mL 谷氨酰胺、IFN- y (Sigma) 50ng/mL> IL-I β (Sigma) 20ng/mL、黄体酮(Sigma) 10 μ g/mL的DMEM/F12培养基。IFN-Y、IL-I β、黄体酮为培养因子。共培养72小时后，弃培养基，收获免疫抑制功能得到增强的MSC。培养同批次MSC细胞不加IFN- Y、IL-I β和黄体酮作为对照组。
关于IFN- Y、IL-I β和黄体酮加入培养基中的方式，可以先将IFN- Y、IL-I β和黄体酮溶解在溶有DMEM/F12 (Hyclone)培养基中，配制成较高的浓度，分装于灭菌的EP管中，使用时，再按照终浓度加入。
将收获的免疫抑制功能得到增强的MSC更换培养基进行培养，培养基组成为基础培养基DMEM/F12 (Hyclone)中含有10% (体积)胎牛血清(Gibco)和2mM/mL谷氨酰胺 (Sigma),培养后进行MSC细胞的免疫抑制活性检测。
2、MSC进行混合淋巴细胞反应检测免疫抑制率取新鲜外周血50mL。利用淋巴细胞分离液(Ficoll，天津灏洋)分离获得MNC IXlO8, 将细胞重悬于50mL含10%胎牛血清，2mM/mL谷氨酰胺的DMEM/F12 (Hyclone)培养基中，加入抗⑶3单抗、抗⑶28单抗各100ng/mL，于37°C，5%C02培养箱中培养5天。此时淋巴形成大量细胞团。
培养的MSC细胞弃培养基后用PBS洗两遍，用溶有O. 25%胰酶(Sigma)的PBS消化贴壁的MSC细胞，400g离心10分钟后取细胞沉淀用含10%胎牛血清(Gibco)，2mM/mL谷氨酰胺(Sigma)的DMEM/F12培养基(Hyclone)重悬。调整MSC细胞悬液浓度为2X105/mL，加入到96孔细胞培养板(Corning)中IOOul/孔。与细胞因子共培养后的MSC细胞实验组和不加因子的MSC细胞对照组各取3个复孔。待孔内MSC细胞贴壁后，加入IOOul培养好的浓度为2 X 106/mL的淋巴细胞悬液，使MSC细胞与淋巴细胞终浓度的比值为1:10.另取3个复孔加入200ul浓度为I X IOVmL的淋巴细胞悬液作为对照组。将96孔培养板置于37°C， 5%C02培养箱中培养4-6天后，用CCK-8染色淋巴细胞，于450nm波长下测量OD值确定增殖后的淋巴细胞数量。利用公式抑制率=(对照组_实验组)/对照组计算MSC细胞对淋巴细胞增殖的抑制率。
( I)细胞因子激活后的MSC与外周血淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应取新鲜外周血50mL。利用淋巴细胞分离液(Ficoll，天津灏洋)分离获得MNC IXlO8, 细胞重悬于50mL含10%胎牛血清，2mM/mL谷氨酰胺的DMEM/F12 (Hyclone)培养基中，加入抗⑶3单抗、抗⑶28单抗(Sigma)各100ng/mL，于37°C，5%C02培养箱中培养5天。此时淋巴细胞开始增殖，出现大量细胞团。
调整MSC细胞悬液浓度为2X 105/mL，加入到96孔细胞培养板中IOOul/孔。与 IFN- Y、IL-I β和黄体酮共培养后的MSC细胞实验组和不加因子的MSC细胞对照组各取3 个复孔。待孔内MSC细胞贴壁后，加入IOOul培养好的浓度为2X 106/mL的淋巴细胞悬液， 使MSC细胞与淋巴细胞终浓度的比值为1:10.另取3个复孔加入200ul浓度为lX106/mL 的淋巴细胞悬液作为对照组。将96孔培养板置于37 °C，5%C02培养箱中培养4_6天后，用 CCK-8 (上海贝博)染色淋巴细胞，于450nm波长下测量细胞悬液OD值确定增殖后淋巴细胞数量。利用公式抑制率=(对照组_实验组)/对照组计算MSC细胞对淋巴细胞增殖的抑制率。另调整淋巴细胞悬液的浓度使MSC细胞与淋巴细胞终浓度的比值为1:40，重复实验测定淋巴细胞增殖抑制率。IFN- Y ,IL-I β和黄体酮激活后的MSC与MSC对照组对淋巴细胞增殖抑制率的结果如图I所示，MSC细胞对淋巴细胞增殖的抑制率提高了 2-7倍。
(2)因子激活后的MSC用定量PCR测定免疫抑制蛋白的表达细胞因子与MSC细胞共培养72小时后取5Χ IO5细胞，用总RNA小量制备试剂盒 (Axygen)提取细胞内总RNA,然后用反转录cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific)反转录 mRNA为cDNA模板,再利用Cyber-green法定量PCR反应试剂盒(Promega)配制定量PCR反应体系，于实时荧光定量PCR仪(mx3000p，Agilent)上测定MSC细胞内HLA-G、ID01、IL10、 C0X-2、HGF、TGFbl、H0-l、iN0s等免疫抑制蛋白的表达情况。检测表明因子激活后的MSC对比对照组，免疫抑制蛋白有不同程度的上调，如图2所示，MSC细胞内免疫抑制蛋白的表达提高了 2-12倍。
(3)因子激活后的MSC用酶联免疫试剂盒测定抗炎因子和促炎因子的分泌在75cm2培养瓶中加入因子激活培养MSC细胞72小时后，更换培养基为不含细胞因子，含10%胎牛血清，2mM/mL谷氨酰胺的DMEM/F12常规培养基15mL，培养3_6天。取该条件培养基在500g离心10分钟后取上清液用ELISA试剂盒(R&D)测定犬尿氨酸、PGE2、sHLA-G、 IL10、TGF β、HGF, IL4、TNF α、IL6 和 IL12 的含量。未加 IFN- y、IL-I β 和黄体酮培养的 MSC细胞条件培养基作为对照组。因子激活后MSC细胞分泌抗炎因子和促炎因子的变化如图3所示，细胞分泌抗炎因子的能力提高了 5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了 10%-30%。
综上所述，经过IFN- Y ,IL-I β和黄体酮共培养激活后，MSC细胞对淋巴细胞增殖的抑制率提高了 2-7倍，MSC细胞内免疫抑制蛋白的表达提高了 2-12倍，细胞分泌抗炎因子的能力提高了 5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了 10-30%，MSC细胞的免疫抑制活性大为增加。
实施例2:在实施例I的基础上，改变培养基中三种培养因子的浓度为IFN-Y (Sigma) Ing/mL、 IL-I β (Sigma) Ing/mL、黄体酮(Sigma) I μ g/mL,其他操作同实施例I完全一致。细胞因子激活后的MSC与外周血淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应的效果如图4，得到的MSC对淋巴细胞增殖的抑制率提高了 30%。用定量PCR测定免疫抑制蛋白的表达效果如图5，得到的 MSC细胞内免疫抑制蛋白的表达提高了 2%-200%。得到的MSC用酶联免疫试剂盒测定抗炎因子和促炎因子的分泌效果如图6，细胞分泌抗炎因子的能力提高了 10%-50%，分泌促炎因子的能力无显著变化。
实施例3 在实施例I的基础上，改变培养基中三种培养因子的浓度为IFN-Y (Sigma) 600ng/ mL、IL-I β (Sigma) 200ng/mL、黄体酮(Sigma) 100 μ g/mL,其他操作同实施例 I 完全一致。 细胞因子激活后的MSC与外周血淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应的效果如图7，得到的MSC 对淋巴细胞增殖的抑制率提高了 25%。用定量PCR测定免疫抑制蛋白的表达效果如图8，得到的MSC细胞内免疫抑制蛋白的表达提高了 5%-80%。得到的MSC用酶联免疫试剂盒测定抗炎因子和促炎因子的分泌效果如图9，细胞分泌抗炎因子的能力提高了 15%-50%，分泌促炎因子的能力略微降低。
上述实施例中使用的DMEM/F12 (Hyclone)培养基，可以替换为其他具有相同功能作用的基础培养基，如a -MEM, DMEM-LG, DMEM-HG, L-DMEM, IMDM, RPMI-1640等含有平衡盐溶液、氨基酸、维生素和必要营养物质的培养基，因此在本发明的方案中，并不仅仅限于 DMEM/F12 (Hyclone)培养基。
权利要求
1.一种增强间充质干细胞免疫抑制功能的方法，其特征是将分离的间充质干细胞传代培养，用含有培养因子的培养基培养至细胞70%汇合，再更换溶有IFN-Y、IL-I β和黄体酮的培养基培养。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于溶有IFN-Y、IL-1β和黄体酮的培养基中含有 l-600ng/mL 的 IFN- Y、l_200ng/mL 的 IL-1 β 和 1-100 μ g/mL 的黄体酮。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于溶有IFN-Y、IL-1β和黄体酮的培养基中含有 50ng/mL 的 IFN- y、20ng/mL 的 IL-1 β 和 10 μ g/mL 的黄体酮。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于含有培养因子的培养基中含有EGFl-50ng/mL、FGF l_50ng/mL、VEGF l_50ng/mL 和 PDGF l_50ng/mL。
5.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于含有培养因子的培养基中含有EGF 2ng/mL、FGF 2ng/mL、VEGF 2ng/mL 和 PDGF 2ng/mL。
6.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于含有培养因子的培养基和溶有 IFN-y ,IL-I β和黄体酮的培养基中均含10% (体积比)的胎牛血清和2mM/mL的谷氨酰胺。
7.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于含有培养因子的培养基和溶有 IFN- Y、IL-I β和黄体酮的培养基的基础培养基均为DMEM/F12。
8.根据权利要求1、2、4、6、7中任一项所述的方法，其特征在于取传代2-5代的间充质干细胞，培养24-48小时，使其达到70%汇合。
9.根据权利要求1、2、4、6、7中任一项所述的方法，其特征在于间充质干细胞在溶有 IFN- Y、IL-1 β和黄体酮的培养基中培养2-5天后，弃培养基，收获免疫抑制功能增强的间充质干细胞。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于所述间充质干细胞为人类新生儿脐带间充质干细胞。
全文摘要
本发明涉及细胞治疗技术领域间充质干细胞技术领域，特别涉及一种增强间充质干细胞免疫抑制功能的方法，将分离的间充质干细胞传代培养后，用含有IFN-γ、IL-1β和黄体酮的培养基培养。经过IFN-γ、IL-1β和黄体酮共培养激活后，MSC细胞对淋巴细胞增殖的抑制率提高了2-7倍，MSC细胞内免疫抑制蛋白的表达提高了2-12倍，细胞分泌抗炎因子的能力提高了5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了10%-30%，MSC细胞的免疫抑制活性大为增加。
文档编号C12N1/38GK102936578SQ201210449608
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者刘小盾, 李栋 申请人:山东省齐鲁干细胞工程有限公司