DT1蛋白在调控植物气孔密度和提高植物抗旱性中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及DT1蛋白在调控植物气孔密度和提高植物抗旱性中的应用。

背景技术：

干旱是影响作物产量的一个重要原因。当植物根系所吸收的水分不够蒸腾所需时，就会使得植物缺水。植物缺水会降低细胞膨压，限制细胞膨大，减小叶面积和光合源，因此降低生物量和产量。

降低植物的蒸腾速率可以减少土壤水分的消耗，是一种有效的提高植物抗旱性的方法。

气孔开度和气孔密度都可以调控水分的蒸腾和利用。降低气孔密度能提高水分利用效率和植物抗旱性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供DT1蛋白在调控植物气孔密度和提高植物抗旱性中的应用。

本发明提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码DT1蛋白的基因导入出发植物，得到抗旱能力高于所述出发植物的转基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码DT1蛋白的基因导入出发植物，得到叶片气孔密度低于所述出发植物的转基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码DT1蛋白的基因导入出发植物，得到叶片蒸腾速率低于所述出发植物的转基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

以上任一所述“编码DT1蛋白的基因”具体可为如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：

(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第5至1162位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗旱相关蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且编码植物抗旱相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述严格条件也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

所述“编码DT1蛋白的基因”可通过重组表达载体导入所述出发植物。所述重组表达载体可为将所述“编码DT1蛋白的基因”插入表达载体得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将所述“编码DT1蛋白的基因”插入质粒pMDC32的AttR位点得到的重组质粒。

本发明还保护一种提高植物抗旱性的方法，是通过提高所述植物中编码DT1蛋白的基因的表达来提高所述植物的抗旱性。

本发明还保护一种降低植物叶片气孔密度的方法，是通过提高所述植物中编码DT1蛋白的基因的表达来降低所述植物的叶片气孔密度。

本发明还保护一种降低植物叶片蒸腾速率的方法，是通过提高所述植物中编码DT1蛋白的基因的表达来降低植物叶片的蒸腾速率。

本发明还保护DT1蛋白的应用，为如下(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)：(Ⅰ)降低植物叶片的气孔密度；(Ⅱ)降低植物叶片的蒸腾速率；(Ⅲ)提高植物的抗旱能力。

本发明还保护编码DT1蛋白的基因的应用，为如下(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)：(Ⅰ)降低植物叶片的气孔密度；(Ⅱ)降低植物叶片的蒸腾速率；(Ⅲ)提高植物的抗旱能力。

以上任一所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

以上任一所述“编码DT1蛋白的基因”具体可为如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：

(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第5至1162位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗旱相关蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且编码植物抗旱相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述严格条件也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

以上任一所述植物可为如下①、②或③：①单子叶植物；②双子叶植物；③拟南芥。

所述气孔密度减少具体体现为叶片气孔数目减少。

所述气孔具体为所述植物叶片表皮的气孔。

本发明的发明人发现在拟南芥中提高DT1基因的表达水平能够有效的降低叶片表皮的气孔密度，从而降低转基因植株的蒸腾速率，进而提高了植物的抗旱性。本发明对于控制植物叶片的气孔密度及提高植物抗旱能力有重要作用。

附图说明

图1为部分T1代抗性植株的PCR鉴定结果。

图2为部分T3代植株中DT1基因和eIF4a基因的表达量。

图3为提高DT1基因表达能降低拟南芥子叶气孔密度。

图4为提高DT1基因表达能降低拟南芥真叶气孔密度。

图5为提高DT1基因表达能降低拟南芥离体叶片失水速率。

图6为提高DT1基因表达能降低拟南芥蒸腾速率。

图7为提高DT1基因表达能提高拟南芥抗旱能力。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

质粒pMDC32：参考文献：Zhang,M.,Henquet,M.,Chen,Z.,Zhang,H.,Zhang,Y.,Ren,X.,van der Krol,S.,Gonneau,M.,Bosch,D.,and Gong,Z.(2009).LEW3,encoding a putative alpha-1,2-mannosyltransferase(ALG11)in N-linked glycoprotein,plays vital roles in cell-wall biosynthesis and the abiotic stress response in Arabidopsis thaliana.Plant J 60,983-999.。

哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0，在附图中用Col表示)：参考文献：Wang,L.,Hua,D.,He,J.,Duan,Y.,Chen,Z.,Hong,X.,and Gong,Z.(2011).Auxin Response Factor2(ARF2)and its regulated homeodomain gene HB33mediate abscisic acid response in Arabidopsis.PLoS genetics 7,e1002172.；在文献中的名称为“Arabidopsis thaliana，Columbia ecotype”。

根癌农杆菌C58：参考文献：Steven J.Clough and Andrew F.Bent(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal 16(6),735–743.。

Gateway克隆入门试剂盒(pENTR^TM/TEV/D-Cloning Kit)：Life Technologies公司，产品目录号为k2525-20。

Gateway克隆表达试剂盒(LRII Enzyme mix)：Life Technologies公司，产品目录号为11791-020。

DT1蛋白如序列表的序列1所示，其编码序列如序列表的序列2自5’末端第5位至第1162位核苷酸所示。

实施例1、重组质粒的构建

一、引物的设计和合成

F1：5'-CACCATGATACATTACGAACAAAACA-3'；

R1：5'-TCACTCGCATTCTCCTTCAGT-3'。

1、提取哥伦比亚生态型拟南芥的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(经测序，PCR扩增产物如序列表的序列2所示)。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，采用Gateway克隆入门试剂盒并按试剂盒说明书操作，得到入门克隆(将所述PCR扩增产物导入了所述试剂盒中的pENTR/TEV/D-vector，得到入门克隆)。

4、取入门克隆，采用Gateway克隆表达试剂盒并按试剂盒说明书操作，将序列2所示的DNA分子插入质粒pMDC32的attR1位点和attR2位点之间，得到表达克隆，将其命名为重组质粒pMDC32-DT1。

实施例2、DT1基因过表达植株的获得

一、DT1基因过表达植株的获得

1、将重组质粒pMDC32-DT1导入根癌农杆菌C58，得到重组农杆菌。

2、取步骤1得到的重组农杆菌，采用花序浸泡法将重组质粒pMDC32-DT1导入哥伦比亚生态型拟南芥，收获种子。

3、将步骤2得到的种子播种于含60mg/L潮霉素的MS固体培养基，筛选抗性植株(T1代植株)。

4、提取T1代植物的基因组DNA，进行PCR鉴定。

PCR鉴定的引物对如下(F2对应载体骨架，R1对应DT1基因)：

F2：5'-AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACC-3'；

R1：5'-TCACTCGCATTCTCCTTCAGT-3'。

如果PCR鉴定为阳性(PCR扩增得到约1266bp的扩增产物)，该植株即为转基因植株。部分T1代植物的PCR鉴定结果见图1。每个植株的后代即为一个株系。

5、将步骤4中PCR鉴定为阳性的植株自交并收获种子(T2代种子)。

6、将步骤5得到的种子培育为植株(T2代植株)并单株收种子(T3代种子)。

7、将T3代种子播种到含60mg/L潮霉素的MS固体培养基，筛选抗性不分离的纯合单株(即筛选其T3代种子不发生抗性分离的T2代植株，该植株为纯合的转基因植株)，将其种子(T3代种子)进行实施例3的各项检测和鉴定。

二、转空载体植株的获得

用质粒pMDC32代替重组质粒pMDC32-DT1进行步骤一，得到转空载体植株。

实施例3、DT1基因过表达植株的鉴定

一、DT1基因表达水平检测

待测种子如下：L4株系(30粒T3代种子)、L6株系(30粒T3代种子)、L9株系(30粒T3代种子)、L10株系(30粒T3代种子)、L11株系(30粒T3代种子)、L13株系(30粒T3代种子)、L14株系(30粒T3代种子)，L15株系(30粒T3代种子)、L16株系(30粒T3代种子)和哥伦比亚生态型拟南芥(30粒种子)。

在MS固体培养基上播种待测种子并培养，种子萌发8天后提取RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，检测DT1基因的表达量。采用eIF4a基因为内参基因。

DT1基因和eIF4a基因的表达量如图2所示。结果表明，哥伦比亚生态型拟南芥中，DT1基因的本底表达非常低。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转基因株系L4、L6、L9、L11、L13和L15中DT1基因的表达量都显著增高。

二、DT1基因对植物气孔密度的影响

1、DT1过表达植株的子叶气孔密度统计

待测种子如下：L4株系(30粒T3代种子)、L6株系(30粒T3代种子)、L9株系 (30粒T3代种子)、L10株系(30粒T3代种子)、L11株系(30粒T3代种子)、L13株系(30粒T3代种子)、L14株系(30粒T3代种子)，L15株系(30粒T3代种子)、L16株系(30粒T3代种子)、转空载体植株(30粒T3代种子)和哥伦比亚生态型拟南芥(30粒种子)。

在MS固体培养基上播种待测种子并培养，种子萌发8天后测量子叶下表皮的气孔密度。结果见图3。结果表明，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，L4株系、L6株系、L9株系、L11株系、L13株系、L15株系植株的子叶下表皮的气孔密度均显著降低。转空载植株与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。

2、DT1过表达植株的真叶气孔密度统计

待测种子如下：L4株系(30粒T3代种子)、L15株系(30粒T3代种子)、转空载体植株(30粒T3代种子)和哥伦比亚生态型拟南芥(30粒种子)。

在MS固体培养基上播种待测种子并培养，种子萌发30天后，测量第六片莲座叶上表皮的气孔密度和下表皮的气孔密度。

结果见图4。结果表明，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，L4株系和L15株系真叶上表皮及真叶下表皮气孔密度均显著降低。转空载植株与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。

三、DT1基因过表达对植物叶片蒸腾速率及抗旱性的影响

1、DT1基因过表达对植物叶片失水速率的影响

待测种子如下：L4株系(30粒T3代种子)、L15株系(30粒T3代种子)、转空载体植株(30粒T3代种子)和哥伦比亚生态型拟南芥(30粒种子)。

在装有土的花盆中播种待测种子并培养，种子萌发35天后，取莲座叶并测定离体叶片失水速率(检测叶片失水速率的参考文献：Xiao Feng Zhou,Yin Hua Jin,Chan Yul Yoo,Xiao-Li Lin,Woe-Yeon Kim,Dae-Jin Yun,Ray A.Bressan,Paul M.Hasegawa,and Jing Bo Jin(2009).CYCLIN H；1Regulates Drought Stress Responses and Blue Light-Induced Stomatal Opening by Inhibiting Reactive Oxygen Species Accumulationin Arabidopsis.Plant PhysiolVol162,1030-41.)。

结果见图5。结果表明，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，L4株系和L15株系的失水速率均显著降低。转空载植株与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。

2、DT1基因过表达对植物蒸腾速率的影响

待测种子如下：L15株系(30粒T3代种子)、转空载体植株(30粒T3代种子)和哥伦比亚生态型拟南芥(30粒种子)。

在装有土的花盆中播种待测种子并培养，种子萌发35天后，用保鲜膜包裹花盆，在天平上连续测定蒸腾速率(将所有花盆放到天平上连续记录72小时，每五分钟记录 一次重量，减少的重量即为蒸腾失水量)。检测植物蒸腾速率的参考文献：Chan Yul Yoo,Heather E.Pence,Jing Bo Jin,Kenji Miura,Michael J.Gosney,Paul M.Hasegawa and Michael V.Mickelbart(2010).The Arabidopsis GTL1Transcription Factor Regulates Water Use Efficiency and Drought Tolerance by Modulating Stomatal Density via Transrepression of SDD1.Plant Cell 2010；22；4128-4141.)。

结果见图6(纵坐标中的cm^-2指的是每平方厘米叶片)。结果表明，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，L15株系的蒸腾速率显著降低。转空载植株与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。

3、DT1基因过表达对植物抗旱性的影响

待测种子如下：L4株系(100粒T3代种子)、L15株系(100粒T3代种子)、转空载体植株(100粒T3代种子)和哥伦比亚生态型拟南芥(100粒种子)。

在装有相同重量土的花盆中播种待测种子并培养，从播种开始计时，第1至14天正常管理，第15至25天干旱处理(干旱处理即持续不浇水)，第26天开始正常管理(恢复浇水，简称复水)。分别于第24天结束时、第25天结束时、第26天结束时(复水1天后)、第28天结束时(复水3天后)拍照，第28天结束时(复水3天后)统计存活率。

照片见图7。

哥伦比亚生态型拟南芥的存活率为5％，转空载植株的存活率为6％，L4株系的存活率为100％，L15株系的存活率为100％。结果表明，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，L4株系和L15株系的抗旱性显著增加。