技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。
背景技术：
里氏木霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类，里氏木霉具有胞外表达酶量大等优点，是工业生产酶制剂中广泛应用的菌种。里氏木霉产生的纤维素酶酶系组成中，葡糖苷酶的活力相对较低。已有的提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法是通过基因工程的手段导入纤维素葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。目前这些方法中，每次只能剔除一个基因或增强一个基因的表达。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，以及通过该方法得到的里氏木霉菌株。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，为通过RNAi降低里氏木霉木聚糖酶基因、纤维素内切酶基因的表达，提高里氏木霉纤维素酶酶活。
优选的，所述的双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：
（1）将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQ ID NO.1所示序列的干扰片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到pSilent-1上。
（2）将步骤（1）构建的重组载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉纤维素酶酶活得到提高。
步骤（1）中所述的限制性内切酶优选为SnaBI和ApaI。
步骤（2）优选通过农杆菌将所构建的重组载体转化到里氏木霉中。
步骤（2）中所述的里氏木霉优选为里氏木霉ATCC24449。
一种里氏木霉菌株，为上述转化有重组载体的里氏木霉。
本发明具有如下优点和有益效果：本发明通过RNAi干扰序列的合理设计，不仅显著降低木聚糖酶的表达（不表达），而且还适度降低纤维素内切酶的表达、增强葡糖苷酶的表达，优化了纤维素酶酶系中三种酶的活性比例，提高了里氏木霉纤维素酶酶活。木聚糖酶表达的消失也有利于葡糖苷酶表达量的增加和纤维素酶的纯化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、材料
里氏木霉ATCC24449，质粒pSilent-1（Biovector），农杆菌EHA105，大肠杆菌DH5α，限制性内切酶（TakaRA）等。
合成的两端有SnaBI、ApaI酶切位点的干扰片段1（SEQ ID NO.1），序列组成为：GGTACGTA（SnaBI酶切位点序列）-木聚糖酶mRNA互补片段1序列（SEQ ID NO.2）-纤维素内切酶mRNA互补片段序列（SEQ ID NO.4）-内含子片段序列（SEQ ID NO.6）-纤维素内切酶mRNA互补片段的反义序列（SEQ ID NO.7）-木聚糖酶mRNA互补片段1的反义序列（SEQ ID NO.9）- GGGCCCGG（ApaI酶切位点序列）。
2、方法
一、重组质粒的构建
（1）质粒pSilent-1的提取
含有pSilent-1的大肠杆菌DH5α接种到含有氨苄霉素的LB培养基（LB培养基：氯化钠1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃灭菌20min，加入微孔过滤的氨苄霉素，氨苄霉素在LB中的终浓度为30µg/mL）中，35℃培养过夜。使用质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，DP103）按照说明书说明提取pSilent-1质粒，提取步骤如下：
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2）取2mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm（13400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm（13400×g）离心10min。
6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
7）可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。
8）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
9）重复操作步骤8）。
10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（13400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
（2）质粒pSilent-1、干扰片段1的酶切和电泳
往41μL pSilent-1质粒溶液或干扰片段1溶液中加入2μL SnaBI、2μL ApaI和5μL酶切缓冲液，总体积为50.0µL，在30℃酶切2h。使用琼脂糖凝胶电泳试剂盒（上海一基实业有限公司）进行电泳。
1）打开试剂盒，依照说明书清点各种试剂，并按实验需要量将50×电泳缓冲液稀释为1×电泳缓冲液待用；将核酸荧光染料与6×Loading Buffer按1:1比例混合备用。
2）把U型凝胶托盘放入制胶槽中，插好梳子，置于一水平面上。
3）将0.25g琼脂糖加到盛有适当体积1×电泳缓冲液的三角瓶或玻璃瓶中（常用凝胶浓度0.8-1.2%）。
4）将瓶口用封口膜轻轻盖住，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖完全熔化（熔化到没有小颗粒物为止）。
5）将温热的凝胶溶液倒入U型凝胶托盘中（超过二分之一处）。
6）将凝胶室温放置15-30min完全冷却至凝固，小心拔除梳子，将凝胶托盘移入电泳槽，梳井（点样孔）一端朝负极方向，加入1×电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没。
7）将样品与6×Loading Buffer和核酸荧光染料充分混合（20μL样品+1μL 6×Loading Buffer+1μL核酸荧光染料），用微量移液器将以上混合物缓慢加入梳井内，注意避免引入气泡。
8）盖上电泳槽盖，样品应向阳极（红色插头）泳动，提供5-10V/cm的电压。
9）当样品与染料在凝胶中迁移到足够距离时，关上电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖，在DNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带。
（3）胶回收
使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收质粒pSilent-1、干扰片段1的酶切、电泳产物。
1）从琼脂糖凝胶中割下含目的条带的胶块，称重。
2）加入胶块重量3-6倍的Buffer B2，50℃水浴5-10分钟溶胶。
3）选做，对于<500bp的片段，加入1/3 Buffer B2体积的异丙醇。
4）将溶胶液移入吸附柱中，8000×g离心30秒。倒掉收集管中液体。
5）加入500μL Wash Solution，9000×g离心30秒，倒掉收集管中液体。
6）重复步骤5）一次。
7）空吸附柱于9000×g离心1分钟。
8）将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入15-40μL Elution Buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。
（4）质粒pSilent-1和干扰片段1的连接
使用DNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara）进行连接。
1）将酶切的质粒pSilent-1与酶切的干扰片段1混合制备成体积为10μL的DNA溶液，质粒和干扰片段的体积比为1:3。
2）向上述DNA溶液中加入等体积的 Solution I，充分混匀。
3）16℃反应12h。
（5）大肠杆菌的转化和筛选
1）从-80℃冰箱中取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，冰上溶解10分钟。
2）取10μL上述连接产物加入感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
3）42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。
4）加入890μL LB 液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。
5）将上述菌液摇匀后取100μL 涂布于含Amp的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
大肠杆菌转化子长出后挑取部分转化子接种于LB液体培养基，37℃、200rpm培养12-16-小时后，提质粒验证，验证正确的重组质粒命名为pSilent-RNAi-1。
二、农杆菌介导转化里氏木霉及里氏木霉转化子的发酵
（1）农杆菌感受态细胞的制备
1）在新活化的农杆菌EHA105的LB平板（LB液体培养基添加5%琼脂）上，挑取单克隆于LB液体培养基。
2）28℃、220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7。
3）取1.5mL无菌离心管，每管分装1mL菌液，6000r/min离心10min。
4）去除上清，用1mL 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基。
5）洗好的菌体用100μL 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。
（2）农杆菌的转化
1）将100µL农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上，加入10µL重组质粒pSilent-RNAi-1，充分混匀，冰上放置30min。
2）置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化。
3）加1mL无抗生素的YM 液体培养基（酵母膏0.3%，胰蛋白胨0.5%，麦芽糖0.5%，自然pH）于28℃、230r/min培养2-4h。
4）3000r/min离心2min收集菌体，将上清吸去500µL，剩余液体重悬培养菌后直接涂布含氨苄霉素30µg/mL的YM平板，在28℃、230r/min培养36h。
5）挑取单菌落接种到含氨苄霉素的YM液体培养基中，28℃、250r/min 培养48h，将菌液用于保存-20℃，得到含有重组质粒pSilent-RNAi-1的农杆菌。
（3）里氏木霉菌丝的制备
1）从-80℃冰箱取出甘油管保藏的里氏木霉ATCC24449菌株，置于室温下，快速解冻。
2）吸取适量菌液加到淀粉培养基平板上，用涂布棒将菌液涂布均匀（或者用无菌接种环蘸取适量菌液作平板划线分离），34℃恒温培养5天。
3）待平板上长出单菌落后，用无菌牙签挑取单菌落移至装有察氏培养基的三角瓶中，34℃培养5天。
4）将三角瓶中菌液全部转移至50mL离心管，8000rpm离心5min，弃去上清。
5）加入20mL生理盐水，反复吹打混匀，8000rpm离心洗涤 5min，弃上清，再加入适量生理盐水重悬使菌体浓度OD600值达到1.5左右，留待转化用。
（4）农杆菌转化里氏木霉
1）试剂的配制
无机盐液：将2.61g KCl、7.48g KH2PO4和29.8g NaNO3溶于80mL水中，再加水定容至100mL，用5M KOH调pH至5.5，高压灭菌，4℃保存。
50%葡萄糖（w/v）：50g葡萄糖溶于90mL蒸馏水中，定容至100mL，高压灭菌。
1M MgSO4：24.7g MgSO4溶于90mL蒸馏水中，定容至100mL，高压灭菌。
MM微量元素溶液：将1.1g H3BO3、2.1g ZnSO4·7H2O、0.16g CuSO4·5H2O、0.5g MnC12·4H2O、0.5g FeSO4·7H2O、0.17g CoC12·6H2O、0.15g Na2MoO4·2H2O和0.1g EDTA溶于90mL蒸馏水中，定容至100mL，高压灭菌，4℃保存。
MM选择培养平板：取20mL无机盐溶液、20mL 50%葡萄糖溶液、2mL 1M MgSO4溶液、1mL MM微量元素溶液加入到957mL经高压灭菌含有20g琼脂粉的蒸馏水中使总体积至1L，充分混匀（即琼脂浓度2%）。当温度降至60℃，加入1mL 100mg/mL潮霉素B（终浓度100μg/mL）和1mL 0.2M头孢噻肟（终浓度0.2mM），加入1mL 200mM乙酰丁香酮（终浓度0.2mM)，混合均匀后制成MM选择培养平板。
PDA培养基：①称量和熬煮：按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000mL，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。②加热溶解：把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15-20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所1000mL。
2）农杆菌转化里氏木霉
在含有200μM乙酰丁香酮的IM培养基平板上贴一层玻璃纸滤膜（尽量不要产生气泡），将100μL里氏木霉菌丝悬液与100μL转化有重组质粒pSilent-RNAi-1的农杆菌培养液等体积混合均匀后涂布于滤膜上，22.5℃避光培养3天。将滤膜转移至含有200μM头孢噻肟（目的杀死农杆菌细胞）和100μg/mL潮霉素的MM选择培养基平板，30℃培养4-6天，筛选转化成功的转化子命名为里氏木霉-RNAi-1。
（5）里氏木霉转化子发酵
转化子选育：将里氏木霉-RNAi-1接种到PDA平板上，30℃培养 6d，得到孢子。挑取的孢子用无菌水稀释到孢子浓度为1×107/mL，涂布PDA平板，30℃培养72h得到单菌落，单菌落接种到PDA斜面，30℃培养108h左右，得到里氏木霉-RNAi-1选育的孢子。同时以出发菌株里氏木霉ATCC24449作为对照。
接种发酵：选育的孢子接种于装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，孢子最终浓度为1×108孢子/mL发酵培养液，30℃、130r/m培养96h。其中，发酵培养基组成：MM微量元素液5mL，麸皮20g，甘蔗渣（粉碎过20目筛）15g，玉米芯12g，葡萄糖5g，蛋白胨2g，自来水定容至1L。
发酵结束后，用滤纸过滤发酵液，测定滤液的纤维素酶、木聚糖酶酶活，纤维素酶酶活测定方法依据文献（魏艳红等，纤维素酶产生菌HS-F9的筛选鉴定和产酶条件优化。应用与环境生物学报，2010，16 (2 ): 274-278），木聚糖酶酶活测定方法依据文献（刘超刚等，里氏木霉诱导合成木聚糖酶的调控。南京林业大学学报(自然科学版)，1999，23(3):29-32）。测定的里氏木霉-RNAi-1发酵液的滤纸酶活为4.3U/mL，葡糖苷酶酶活为8.68U/mL，纤维素内切酶酶活为15.9U/mL，外切酶酶活为1.84U/mL，木聚糖酶酶活为0U/mL。里氏木霉ATCC24449发酵液的滤纸酶活为3.6U/mL，葡糖苷酶酶活为6.9U/mL，纤维素内切酶酶活为20.1U/mL，外切酶酶活为1.85U/mL，木聚糖酶酶活为2.9U/mL。从结果可以看出，里氏木霉-RNAi-1的纤维素酶酶活显著增加，葡糖苷酶的酶活增加，内切酶的酶活下降，木聚糖酶的酶活下降到零。通过RNAi干扰技术，实现了葡糖苷酶酶活的适度上升，纤维素内切酶酶活适度下降，酶活性比例的改变更适宜于纤维素酶复合酶系降解纤维素；同时木聚糖酶表达的消失也有利于纤维素酶的纯化和葡糖苷酶表达量的增加。
对比试验1
按照实施例1的操作，将干扰片段1替换为干扰片段2，其余操作同实施例1。合成两端有SnaBI、ApaI酶切位点的干扰片段2的序列组成为：GGTACGTA（SnaBI酶切位点序列）-木聚糖酶mRNA 互补片段2序列（SEQ ID NO.3）-纤维素内切酶mRNA互补片段序列（SEQ ID NO.4）-内含子片段序列（SEQ ID NO.6）-纤维素内切酶mRNA互补片段的反义序列（SEQ ID NO.7）-木聚糖酶mRNA 互补片段2的反义序列（SEQ ID NO.10）- GGGCCCGG（ApaI酶切位点序列）。
最后筛选得到的里氏木霉转化子发酵液的滤纸酶活为3.9U/mL，葡糖苷酶酶活为8.32U/mL，纤维素内切酶酶活为16.2U/mL，外切酶酶活为1.85U/mL，木聚糖酶酶活为1.3U/mL。
对比试验2
按照实施例1的操作，将干扰片段1替换为干扰片段3，其余操作同实施例1。合成两端有SnaBI、ApaI酶切位点的干扰片段3的序列组成为：GGTACGTA（SnaBI酶切位点序列）-木聚糖酶mRNA互补片段1序列（SEQ ID NO.2）-纤维素内切酶mRNA互补候选片段序列（SEQ ID NO.5）-内含子片段序列（SEQ ID NO.6）-纤维素内切酶mRNA互补候选片段的反义序列（SEQ ID NO.8）-木聚糖酶mRNA互补片段1的反义序列（SEQ ID NO.9）- GGGCCCGG（ApaI酶切位点序列）。
最后筛选得到的里氏木霉转化子发酵液的滤纸酶活为2.9U/mL，葡糖苷酶酶活为8.36U/mL，纤维素内切酶酶活为12.1U/mL，外切酶酶活为1.85U/mL，木聚糖酶为0.2U/mL。从对比试验看出，纤维素内切酶mRNA互补序列的选取对纤维素酶活的提升要重要影响，不适当选取的纤维素内切酶的反义序列反而会过度抑制纤维素内切酶的表达，从而降低纤维素酶的活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北工业大学
<120> 一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
<130> 1
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1454
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 干扰片段1
<400> 1
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taacattgac ggcgcctttt ctccgcttgc cacttggctc cgacagaaca atcgccaggc 360
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<210> 2
<211> 277
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 木聚糖酶mRNA 互补片段1
<400> 2
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 木聚糖酶mRNA互补片段 2
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 内含子片段
<400> 6
gtaggaggac tcctcatcat tctgcacttt gaaagcatct tctgaccaaa agcttctctt 60
<210> 7
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 纤维素内切酶mRNA互补片段反义序列
<400> 7
actgtttgat gaaactatat aaagctgaaa tcgagaacag acagcctcat agagtagcta 60
ctatgtttga tagcgagata caaacgttgg cgaggcttct gcattcagct cagagtgcta 120
ctttcttgcg agacacgagc tgaccaagga tgtgtccgtc catgagttac cactgccagt 180
cggtgtttcc gtcaggacat acgtgctatc aaatgatccg gcaccccaac caacatagcc 240
aagatagaca tctgagttct ggttgagata ttggatttgc tggcacatgt cttgtatgca 300
ggactgaacg ttgccaccac cggtttctgt caggatagcc tggcgattgt tctgtcggag 360
ccaagtggca agcggagaaa aggcgccgtc aatgttattt gtagtacatt cggcgtgagt 420
<210> 8
<211> 410
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 纤维素内切酶mRNA互补候选片段反义序列
<400> 8
ggaccggcgg tgttcttgca gtccgcatcg ctgtataccc gcccaacttt tcagccagca 60
acaccaggaa acaagggtac tcactctgtg gtacagccaa agtcaaaacc cgcgatgtta 120
acgccggcaa atcggacccc agagctcgtg ggtggagttg atgagcttgt tgaggtagcc 180
ctggtggtgg tggttggacc ggatggtggc cgggtcgaag tggtgatagt agtggctccc 240
ggaatacatt gcgcataata aggattgagg gtcgaacaag ctgagccagg agcacaattc 300
gtaggtccgc tccaaccaat acctccacac tggccccaga cagtctgctg tgcagcggcg 360
ccgccatata gtatggacgc tgcaagcagc aatggagcca cggacttgtt 410
<210> 9
<211> 277
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 木聚糖酶mRNA互补片段1的反义序列
<400> 9
cagtcgtcca accaacgccc acaacaaagt catcttgagt gttccagttc actgagaagc 60
cagtgttgga aggcgaatag ctgacttgtc cgccagtttg gtagttttgg tcgtagttga 120
tgctagcacg acggcgatga tcattgtgag ctccaagaac aaagtcgtac atgccacgct 180
ctgtgacgtt gacactgctc tcaggctcga ggcctgtggg catcgccaga gtactggcga 240
tgctggtgag agcgcagatg aggctggaaa aggcaac 277
<210> 10
<211> 170
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 木聚糖酶mRNA互补片段2的反义序列
<400> 10
cagtcgtcca accaacgccc acaacaaagt catcttgagt gttccagttc actgagaagc 60
cagtgttgga aggcgaatag ctgacttgtc cgccagtttg gtagttttgg tcgtagttga 120
tgctagcacg acggcgatga tcattgtgag ctccaagaac aaagtcgtac 170