一种抗人a组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种抗人A组轮状病毒鸡卵黄抗体及其制备方法和应用，该方法包括：体外表达纯化人A组轮状病毒结构蛋白VP7或VP8，并免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，分离纯化出VP7或VP8卵黄抗体。制备得到的鸡卵黄抗体可冻干制备成用作预防和治疗轮状病毒感染的抗体干粉。本发明的有益效果：采用基因工程技术体外大量表达重组VP7和VP8抗原，效益高，成本低，场地需求小、环保；避免了传统卵黄抗体制备过程中使用轮状病毒灭活或减毒疫苗所带来的潜在散毒风险，符合动物福利要求；采用本发明制备的卵黄抗体，经无菌检验后，制备成抗体干粉口服生物制剂，对治疗轮状病毒感染性腹泻具显著效果，预防率可达95%以上，见效快、成本低。
【专利说明】一种抗人A组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及卵黄抗体，尤其是一种高效价抗A组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和在预防和治疗轮状病毒感染中的应用。
【背景技术】
[0002]人A组轮状病毒(Rotavirus, RV)是引起婴幼儿感染性腹泻疾病的主要原因，其发病率高、危害严重，严重影响了婴幼儿的发育、营养要求和生存质量[Parashar UD等，2003 ;阳艳丽等，2011]。无论在发达国家还是发展中国家，轮状病毒所致的胃肠炎都是一个严重的公共卫生问题，该病毒所致的腹泻普遍流行，好发于秋冬季节，几乎所有5岁以下的儿童均发生过RV感染。据估计，每年因轮状病毒感染导致的门诊病例有2500多万人，住院病例200多万人[Tate JE等，2012]，就2004年轮状病毒致死人数据估计达到52.7万(47.5万-58.0万)，并且主要发生在低收入国家。
[0003]目前，仍然缺少抗轮状病毒的特效药物。临床上一方面纠正水电解质平衡，另一方面以微生态制剂为主要组分的妈咪爱和以蒙脱石为主要组分的思密达进行治疗，但均不能对轮状病毒引起的婴幼儿腹泻进行有效预防和治疗，甚至滥用抗生素加剧肠道菌群的紊舌L进一步引起药物较难控制的肠炎。目前使用的主要是轮状病毒活疫苗，由于该疫苗有增加肠套叠风险和免疫保护局限等问题，致使该疫苗对轮状病毒引起腹泻的预防在发展中国家推广受阻【Patel NC等，2010 ;Patel MM等，2011 ;Vesikari T等，2012】。因此研发一种高效安全，易于服用的抗体疫苗，是本病防治急需解决的问题。
[0004]卵黄抗体(immunoglobulin yolk, IgY),即产蛋鸡经特定抗原免疫后,产生相应特异性抗体，并转运、储存于卵黄中，形成卵黄抗体。卵黄抗体相当于人的IgG，抗体亲和力比较高。特异性IgY通过与病原的结合，抑制病原菌的生长、运动和粘附作用。卵黄技术近年获得快速发展，在医疗领域具有良好的应用前景[Dias da Silva W等，2010]。IgY已经显示出较好的抗细菌、真菌和病毒效果。口服IgY已被证明能有效替代抗生素治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽螺杆菌、轮状病毒等感染引起的胃肠道疾病。在我国，IgY在兽药领域获得生产批文的已达到10个，同时已有很多添加IgY的功能性保健食品和卫生消毒产品等上市销售，IgY技术在医疗诊断及治疗通过临床验证已显示出良好效果。
[0005]对于轮状病毒的卵黄抗体及相关产品，中国专利申请CN1201693A和CN1435260A均公开了采用野生型轮状病毒株，对其进行病毒细胞培养、病毒纯化和灭活，而制备成灭活病毒苗，通过免疫产蛋鸡获得相应的卵黄抗体。然而，灭活疫苗具有生产要求高、存在灭活不彻底和散毒的危险，同时，由于病毒残存等因素，这些都会对后期卵黄抗体的纯化带来困难。
【发明内容】
[0006]针对以上不足和缺陷，本发明的目的是提供一种抗A组轮状病毒鸡卵黄抗体制备方法。
[0007]本发明根据现代分子免疫学理论，分析并选择轮状病毒的主要抗原表位决定簇肽段VP7和VP8作为免疫原，采用基因工程技术实现在体外大量表达轮状病毒VP7和VP8抗原，将纯化的抗原与适宜的佐剂制备成疫苗免疫产蛋鸡，采用常规水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法提取高效价的轮状病毒VP7和VP8的卵黄抗体。
[0008]本发明的另一目的是提供抗人A组轮状病毒的鸡卵黄抗体在预防和治疗轮状病毒感染中的应用。[0009]本发明采用的技术方案为:
一种抗人A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括:体外表达纯化人A组轮状病毒结构蛋白VP7或VP8，并免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，分离纯化出VP7或VP8卵黄抗体。
[0010]优选一种抗人A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括:PCR扩增人A组轮状病毒的结构蛋白VP7或VP8 DNA序列，将得到的VP7或VP8 DNA序列克隆到原核表达载体pET28a(+)上并转化大肠杆菌表达菌株BL21，诱导表达和纯化VP7或VP8重组蛋白，将VP7或VP8重组蛋白按照体积比1:1与弗氏佐剂混合乳化，肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，每隔一个月加强免疫一次，共2次，第3次免疫后一周开始收集鸡蛋，从蛋黄中分离纯化出抗轮状病毒结构蛋白VP7或VP8的特异性卵黄抗体。
[0011]更优选的一种抗A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤:
(1)PCR扩增:设计引物，以包含G4P8血清型全长VP7或VP8的质粒DNA为模板，PCR扩增VP7或VP8 DNA序列；包含G4P8血清型全长VP7或VP8模板DNA序列可以从G4P8血清型人A组轮状病毒T114株(中国科学院微生物研究所购得)中提取；
(2)蛋白表达纯化:将PCR扩增得到的VP7或VP8DNA序列克隆到原核表达载体pET28a(+)上，并转化到大肠杆菌表达菌株BL21中，通过0.1-0.7 mM IPTG诱导VP7或VP8重组抗原蛋白的大量表达，诱导表达温度为25-37°C，时间8-12h，离心收集诱导表达后的菌体，按照体积比0.01M PBS:菌体=10:1，用0.01M PBS悬浮菌体，采用3_6次反复冻融和溶菌酶(终浓度l-10mg/ml)裂解菌体，离心收集沉淀，用含有质量百分比0.8-1.2 %的Triton和1.5-2.5 M尿素的0.01M PBS洗涤去除细胞碎片，获得粗制的包涵体，再用0.01MPBS洗涤包涵体2-4次，最后按照含有6-8 M尿素的0.01 M PBS缓冲液:包涵体=50:1的体积比溶解包涵体，采用梯度透析的方法复性包涵体得到VP7或VP8重组抗原蛋白；
(3)免疫:将2-10mg/mlVP7或VP8重组抗原蛋白按照体积比1:1与完全弗氏佐剂乳化，2-3点肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，初免剂量为250-500 μ g/只，每隔一个月加强免疫一次(加强免疫采用不完全弗氏佐剂)，共2次，免疫剂量为100-200 μ g/只，第3次免疫一周以后开始收集鸡蛋，加强免疫后，当抗体滴度低于1:1O4时，再给予强化免疫，免疫剂量为100-200 μ g/ 只即可；
(4)分离纯化卵黄抗体:用水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法从蛋黄中分离纯化轮状病毒特异性的VP7卵黄抗体或VP8卵黄抗体。
[0012]其中，0.01MPBS由以下组分组成:氯化钠(NaCl)，8g ;磷酸氢二钠(Na2HP04)，1.16g ;磷酸二氢钾(KH2P04)，0.24g,加 800ml ddH20,并用 IM 的 HCI 或 NaOH 调 pH 至 7.4，
定容1L，高压蒸汽灭菌，室温保存。
[0013]其中，VP7结构蛋白的氨基酸序列如下:SEQ ID N0.1:
【权利要求】
1.一种抗人A组轮状病毒的鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，体外表达纯化人A组轮状病毒结构蛋白VP7或VP8，并免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，分离纯化出VP7或VP8卵黄抗体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增人A组轮状病毒的结构蛋白VP7或VP8 DNA序列，将其克隆到原核表达载体pET28a(+)上并转化大肠杆菌表达菌株BL21，诱导表达和纯化VP7或VP8重组蛋白，将VP7或VP8重组蛋白溶液按照体积比1:1与弗氏佐剂混合乳化，肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，每隔一个月加强免疫一次，共2次，第3次免疫后一周开始收集鸡蛋，从蛋黄中分离纯化出抗轮状病毒结构蛋白VP7或VP8的特异性卵黄抗体。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)PCR扩增:设计引物，以包含G4P8血清型全长VP7或VP8的质粒DNA为模板，PCR扩增VP7或VP8 DNA序列； (2)蛋白表达纯化:将PCR扩增得到的VP7或VP8DNA序列克隆到原核表达载体pET28a(+)上，并转化到大肠杆菌表达菌株BL21中，通过0.1-0.7mM IPTG诱导VP7或VP8重组抗原蛋白的大量表达，诱导表达温度为25-37°C，时间8-12 h，离心收集诱导表达后的菌体，按照体积比0.01M PBS:菌体=10:1，用0.01M PBS悬浮菌体，采用3_6次反复冻融和溶菌酶裂解的方法裂解菌体，溶菌酶的终浓度为l-10mg/ml ;离心收集沉淀，用含质量百分比0.8-1.2%的Triton和1.5-2.5M尿素的0.01M PBS洗涤去除细胞碎片，获得粗制的包涵体，再用0.01 MPBS洗涤包涵体2-4次，最后按照体积比含有6-8 M尿素的0.01 M PBS缓冲液:包涵体=50:1加入0.01 M PBS缓冲液溶解包涵体，将溶解的包涵体加入到透析袋内，采用梯度透析的方法复性包涵体得到VP7或VP8重组抗原蛋白； (3)免疫:取2-10mg/ml VP7或VP8重组抗原蛋白按照与完全弗氏佐剂1:1体积比混匀乳化，2-3点肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，初免剂量为250-500 μ g/只，每隔一个月加强免疫一次，共2次，免疫剂量为100 -200 μ g/只，加强免疫采用不完全弗氏佐剂，第3次免疫一周以后开始收集鸡蛋，抗体滴度低于1:1O4时，再给予强化免疫，免疫剂量为100-200 μ g/只即可； (4)分离纯化卵黄抗体:用水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法从蛋黄中分离纯化轮状病毒特异性VP7或VP8卵黄抗体。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的VP7上游引物为 5’ -CCGGAATTCTTGCCAATTACTGGATCTAT-3’，VP7 下游引物为 5’-CCGCTCGAGCATTCGTTCTGTTTGTGGA-3’，所述步骤(1)的 VP8 上游引物为 5’-CCGGMTTCATGGCTTCACTCATTTAT-3 ’ 和下游引物为 5 ’ - CCGCTCGAGAACTTGTGCCCTCTTATA-3，，所述PCR的退火温度为53-57°C ;所述步骤(2)的梯度透析的方法复性包涵体包括:按照体积比为透析缓冲液:袋内透析液=10:1，将透析袋置于包含5-6 M尿素的透析缓冲液中，进行梯度透析复性，透析4-5 h ;弃1/4-1/6体积原透析缓冲液，补充新的所弃体积的透析缓冲液，透析4-5 h，共透析6-9次；最后用0.01M PBS透析3_4 h，重复1_3次；收集透析液，4°C下12000rpm离心15分钟,上清即为复性的VP7或VP8重组抗原,所述透析缓冲液组分为:50 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCl，5%体积比甘油，1%重量比Gly，其余为超纯水，pH8.1，最后利用Bradford法对纯化的VP7或VP8蛋白进行定量分析，调整蛋白浓度至3mg/ml ο
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)得到的VP7或VP8重组抗原蛋白经SDS-PAGE电泳确认有一条分子量大小为33KD或35KD的电泳带，其中VP7复性蛋白分子量大小为33KD或VP8复性蛋白分子量大小为35KD，灰度扫描纯度在90%以上则满足进入下一步骤要求。
6.如权利要求3-5中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，用ELISA法检测步骤(3)中收集的鸡蛋的蛋黄中的抗体滴度，滴度达到1:20000以上即满足进入下一步骤的要求，利用水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法从蛋黄中分离纯化轮状病毒特异性的卵黄抗体包括:按照蒸馏水:卵黄=8:1稀释卵黄，用稀HCl调节pH至5.2，4°C静置6-8 h，离心去脂，收集上清液，再用质量百分比40%和25% (NH4)2SO4分步沉淀卵黄抗体，终浓度分别为10%和30%质量百分比，收集沉淀用0.01M PBS溶解后超滤即得卵黄抗体VP7或VP8卵黄抗体，超滤的截留分子量为100kD。
7.—种卵黄抗体,其特征在于,所述卵黄抗体通过权利要求1-6中任一权利要求的方法制备得到卵黄抗体。
8.如权利要求7所述的一种卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体的纯度为90%以上，抗体滴度为2 X IO4。
9.如权利要求7-8中任一权利要求所述的卵黄抗体的应用，其特征在于，所述卵黄抗体冻干制备成用作预防和治疗轮状病毒感染的抗体干粉。
10.如权利要求9所述的卵黄抗体的应用，其特征在于，所述抗体干粉为口服生物制剂原料。`
【文档编号】A61P31/14GK103554254SQ201310542421
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】李再新, 张智, 胡卫东, 李丙超, 李天有, 邹晓阳, 唐文才 申请人:四川理工学院