一种检测番茄斑萎病毒的方法

一种检测番茄斑萎病毒的方法
【专利摘要】本发明公开了一种焦磷酸测序技术检测番茄斑萎病毒的方法，先依据番茄斑萎病毒N基因设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的核糖核酸，然后分别以N基因的特异性引物进行聚合酶链式反应扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为143bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有番茄斑萎病毒。本发明适用于对番茄斑萎病毒进行快速检测确证，可广泛应用于农业生产及环境中的疫情监控及进出口贸易中该类病毒的确证，操作极为简便，所需样品量小。
【专利说明】一种检测番茄斑萎病毒的方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原的检测【技术领域】，具体涉及一种检测番茄斑萎病毒的方法。

【背景技术】
[0002] 近年来，番爺斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV)以其广泛的寄主范围 和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。TSWV是TosPovirus 属中最重要的一种病毒，广泛分布于世界各地的温带、亚热带及热带地区，侵染82科900多 种单、双子叶植物，危害蔬菜、花卉及多种粮食作物如番茄、辣椒、马铃薯、花生、葛芭、豌豆、 烟草、菊花、银莲花、百日草、大岩桐、大丽花及仙客来等，对许多经济作物及庭院植物造成 严重损失。据报道，该病曾造成80%的花生损失、50%-90%的葛芭死亡，而在法国和西班 牙等欧洲地区，随着介体西花蓟马的定殖与扩散，该病能够对番茄、辣椒及银莲花产生毁灭 性危害，损失可达100%。
[0003] 番茄斑萎病毒在寄主植物植株间的自然传播主要是通过蓟马媒介以持久性方式 传播，该病毒在媒介昆虫体内自行复制增殖，提高了病毒的传播效率。目前，番茄斑萎病毒 已在我国四川、广州、云南等多个地域存在，随着西花蓟马和番茄斑萎病毒交叉侵染越来越 频繁，番茄斑萎病毒株系与西花蓟马的快速变异性都会导致因两种有害物种相互作用而造 成严重经济损失。只有建立番茄斑萎病毒的快速确证方法，通过及时诊断和提前介入并快 速处理，才能有效地在传播源头上遏制病毒的进一步扩散，在最短的时间内切断传播链。
[0004] 目前，用于TSWV的检测及确证方法一般通过血清学、生物寄主、形态学试验判定 植株是否具有植物病毒，这些方法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要，同时显微镜 检分析多依赖于人员的经验和专业背景知识，主观性较大；应用PCR技术检测确证时，如果 引物特异性不强，可能出现检测假阳性；由于番茄斑萎病毒变异性较强，不同地理株系碱基 差异程度较大，已有报道的引物很容易因位点变异导致出现假阳性等问题，因此，需要保守 性更高、达到SNP级的检测引物或检测方法。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种检测番茄斑萎病毒的方法，从而克服现有技术在确证 TSWV上存在的缺点，寻求提供一种TSWV焦磷酸测序技术确证方法，以克服现有检测技术的 不足，为农业生产及生态环境监控提供一种快速、简便、高效、实用的TSWV确证检测方法。
[0006] 本发明首先提供一种用于检测番茄斑萎病毒的引物组，序列信息如下：
[0007] Sequencing-F :5' -TAAGGCTTCCCTGGTGTCATAC-3，（SEQ ID N0:l)，5，进行生物 素标记；
[0008] Sequencing-R :5，-CCATAATGCTGGGAGGTAGCT-3，（SEQ ID N0:2)，
[0009] Sequencing-测序引物：5，-GTTGATAGCTTTGAGATGA-3，（SEQ ID NO:3)。
[0010] 本发明还提供用上述的引物组检测样品中是否存在番茄斑萎病毒，具体方法如 下：
[0011] 1)将提取的待测样品RNA进行RT-PCR扩增，逆转录后，扩增溶液中加入2XPCR buffer 12. 5 μ L，lOpmol/ μ L上游引物和下游引物各0. 5 μ L，DEPC水补足体积至25 μ L， PCR循环条件为：94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共 循环50次；然后72°C再延伸lOmin ;
[0012] 2)将PCR扩增产物电泳检测：取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶 化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为〇. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面 刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒 压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
[0013] 3)制备焦磷酸测序单链模板：使用50 μ 1标记有生物素的PCR产物与200 μ g链 霉亲和素包被的磁珠，在室温25°C下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的 PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s ;denatureation buffer洗5s ;最后移到washing buffer中清洗10s ;然后将vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。 将样品放入80°C烘箱2分钟，再冷却到室温；
[0014] 焦磷酸测序反应：测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600毫巴 /8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着 核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。
[0015] 本发明所述的关于根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有 TSWV :PCR反应为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与N基因目标片段完全相同的，确 定为TSWV ;PCR反应为阳性的，测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非TSWV ; PCR反应为阴性的判定为非TSWV。
[0016] 本发明适用于对TSWV进行快速检测确证，可广泛应用于生产和环境中的病害监 控、进出口贸易中该病毒的确证。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0018] 第一，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短核酸序列分析，便于构建标 准化操作流程；
[0019] 第二，具有高通量、低成本的特点，PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化 等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
[0020] 第三，灵敏度及精确度较高，在与RT-PCR相同的灵敏度下，可直接读取核酸序列， 其检测精度可达到单碱基的水平，实现对SNP (单核苷酸多态性）位点检测与识别。
[0021] 第四，将PCR和产物测序二者合并，改变了传统的有害生物分子检测及送往生物 公司测序的模式，将检测流程由4?7天缩短至2?4个小时。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1 :为本发明对病株样品中N基因的扩增图谱，其中M:DL2000，1，2:病株样 品，3、4 :健康植株样品；
[0023] 图2 :为本发明对病株样品中N基因焦磷酸测序结果。

【具体实施方式】
[0024] 本发明通过测序引物和聚合酶链式反应扩增单链脱氧核糖核酸模板杂交，与脱氧 核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP)硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底 物（APS)、荧光素孵育，逐一加入四种三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs):(三磷酸腺嘌呤脱氧 核苷酸dATP ;三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP ;三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP ;三磷酸鸟 嘌呤脱氧核苷酸dGTP)，如与模板配对，此三磷酸碱基脱氧核苷酸与引物的末端形成共价 键，释放焦磷酸基团（PPi);腺嘌呤核苷三磷酸（ATP)硫酸化酶在底物（APS)存在的情况下 催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷酸，腺嘌呤核苷三磷酸驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化 荧光素转化，氧化荧光素发出与腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可见光信号；光信号由电荷 耦合器件（CCD)收集并由软件转化为峰；每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成 正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未掺入的三磷酸碱基脱氧核苷酸由三磷酸腺苷双磷酸酶降解， 淬灭光信号，并再生反应体系，利用光信号转化得到的峰图，对样品中的番茄斑萎病毒进行 准确的检测。
[0025] 下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。
[0026] 实施例1 :检测田间样品中是否含有TSWV
[0027] 1、设计特异性引物序列
[0028] 通过Internet登陆美国国立生物信息技术中心（NCBI)，查询检索已公布的TSWV 的N基因核苷酸序列，不包含不明碱基成分序列，对同源性较近的同年份同地点的病株，用 DNAStar 7. 1软件包中的Editseq和MegAlign软件对所选样本的N基因核苷酸序列进行编 辑，逐一比对，用Clustal W Method(软件）默认参数对所选的N核苷酸序列进行同源性比 较，找到表征该病毒的特异核苷酸序列（目标检测序列）。
[0029] PCR扩增引物设计和测序引物设计均可以通过Assay Design SW软件来进行，使用 得分较高的一组引物进行实验，根据DNASTAR的同源性分析结果，选取样本基因中较保守 的序列区域，设计扩增引物，以便于扩增出特异性单一条带，为后续测序奠定基础。同时为 各个扩增区域中包含的特异核苷酸序列（目标序列）设计测序引物，N基因扩增片段长度 为 143bp。
[0030] TSWV PCR及测序引物为：
[0031] Sequencing_F:5，-TAAGGCTTCCCTGGTGTCATAC-3'，5' 进行生物素标记
[0032] Sequencing-R ：5/ -CCATAATGCTGGGAGGTAGCT-3;,
[0033] Sequencing 测序引物：5，-GTTGATAGCTTTGAGATGA-3，。
[0034] 2、提取待测番茄样品的RNA
[0035] 利用田间发病的病株，用酚-氯仿法抽提而得；亦可用商业化的RNA提取试剂盒提 取。
[0036] 3、以TSWV N基因引物进行RT-PCR扩增
[0037] 扩增溶液中加入2XRT-PCR buffer(10倍聚合酶链式Mix反应 液）12. 5 μ L，lOpmol/ μ L上游引物和下游引物各0. 5 μ L，将提取的待测样品RNA加入反应 体系中，DEPC水补足体积至25 μ L，PCR循环条件为：48°C 30min，94°C预变性5min后，进入 94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸lOmin.
[0038] 4、进行琼脂糖凝胶电泳
[0039] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分 溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为〇. 5 μ g/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液 面刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果，待检田间样品 能够扩增出特异性条带，扩增条带为143bp，电泳结果见图1。
[0040] 5、制备焦磷酸测序单链模板
[0041] 使用50 μ 1标记有生物素的PCR产物与200 μ g链霉亲和素包被的磁珠，在室温 25°C下孵育20分钟，用vacuum pr印tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙 醇中清洗 5s ;denatureation buffer 洗 5s ;最后移到 washing buffer 中清洗 10s ;vaccum prep tool放入含有N基因测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80°C烘箱2分钟， 再冷却到室温。
[0042] 6、焦磷酸测序
[0043] 在焦磷酸测序仪（PYROMARK ID)上进行反应，室温条件下，加样使用600毫巴/8 毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸；随着核 酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，N基因焦磷酸测序结果见图2,读取的序列为 TCAGTGTTGT CTTGGCTATA T。
[0044] 7、结果判定
[0045] 田间样品的N基因扩增片段长度为143bp，与预期一致；经过焦磷酸测序，测定的N 序列与TSWV目标序列一致，因此判定样品中含有TSWV。
[0046] 实施例2 :检测进口番茄种子中是否含有TSWV
[0047] 1、设计特异性引物序列
[0048] 同实施例1。
[0049] 2、提取待测样品的RNA :
[0050] 同实施例1。
[0051] 3、以TSWV N引物进行RT-PCR扩增
[0052] 同实施例1。
[0053] 4、进行琼脂糖凝胶电泳：
[0054] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分 溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为〇. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液 面刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果。
[0055] 待检样品PCR扩增未扩增出特异性条带，因此判定进口番茄种子的样品中不含有 TSWV。
[0056] 实施例3 :检测不同病毒样品中是否含有TSWV基因
[0057] 用本发明的焦磷酸测序确证技术，按检测步骤对分离自进口日本甜叶菊的烟草环 斑病毒（TRSV)、分离于意大利黄瓜种子的番茄黑环病毒（TBRV)、分离于智利西瓜种子的黄 瓜花叶病毒（CMV)与番爺花叶病毒（ToMV)、分尚于青岛番爺种植区的番爺黄化曲叶病毒 (ToYCLV)及番茄斑萎病毒属病毒--凤仙花坏死斑病毒（INSV)和鸢尾花黄斑病毒（IYSV) 等8种与TSWV遗传背景相近的毒株进行检测，没有检测到TSWV-N基因特有的扩增片段及 相应序列。从而证明对非TSWV的病毒进行检测的时候不会出现假阳性结果。
[0058] 实施例4 :检测不同浓度的TSWV病毒核酸标准品
[0059] 1、设计特异性引物序列
[0060] 同实施例1。
[0061] 2、RNA标准品的制备：
[0062] 按照常规分子克隆操作方法，首先PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用 Tiangen公司的凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体4°C过夜连接，转化感受态细胞，转 化产物涂平板培养，挑取白斑PCR产物鉴定阳性后送华大基因公司测序，根据测序结果将 筛选的阳性克隆接种到含氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，制备质粒DNA纯化后，经过 Eco I酶切后，利用T7启动子体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀后于紫外核酸分析仪测定 〇D26Q值，定量测定浓度为5X 106拷贝/ μ L。
[0063] 3、以TSWV Ν引物进行RT-PCR扩增
[0064] 将标准品进行系列稀释，分别得到浓度为5Χ 106、5Χ 105、5Χ 104、5Χ 103、5Χ 102、 5Χ 10\25拷贝/ μ L、20拷贝/ μ L、10拷贝/ μ L、5拷贝/ μ L的标准品，以不同浓度梯度的 标准品为模板，每个浓度设重复，进行RT-PCR及焦磷酸测序反应，反应体系和反应程序同 实施例1。
[0065] 4、进行琼脂糖凝胶电泳：
[0066] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分 溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为〇. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液 面刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果。
[0067] 当核酸标准品的浓度下降到10拷贝/μ L时，无法检测到TSWV特有的扩增片段， 焦磷酸测序也无法读取相应序列。从而证明该方法对TSWV的病毒进行检测的时候，灵敏度 可以达到20拷贝/ μ L。这表明焦磷酸测序技术的灵敏度及精确度较高，在具有与RT-PCR 相同的灵敏度的情况下，可读取病毒核酸序列，其精确度更高，可达到单碱基的水平。该发 明能够实现对病毒SNP(单核苷酸多态性）位点的检测与识别。
【权利要求】
1. 一种用于检测番茄斑萎病毒的引物组，其特征在于，所述的引物组中引物的序列信 息如下： Sequencing-Fl :5' -TAAGGCTTCCCTGGTGTCATAC-3，， Sequencing-Rl ：5/ -CCATAATGCTGGGAGGTAGCT-3;, Sequencing-测序引物：5' -GirGATAGCTirGAGATGA-S'。
2. 如权利要求1所述的引物组，其特征在于所述的Sequencing-Fl的5'进行生物素 记。
3. 权利要求1所述的引物组在制备检测番茄斑萎病毒的制品中的应用。
4. 一种用于检测番茄斑萎病毒的制品，其特征在于，所述的制备为试剂盒，包含有权利 要求1所述的引物组。
5. -种应用权利要求1所述的引物组检测测番茄斑萎病毒的方法，其特征在于，所述 的方法包括如下的步骤： 1) 将提取的待测样品RNA进行RT-PCR扩增，逆转录后，扩增溶液中加入2XPCR buffer 12. 5 μ L，lOpmol/μ L上游引物和下游引物各0. 5 μ L，DEPC水补足体积至25 μ L，PCR循环条 件为：941：预变性51^11后，进入941：变性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8，共循环50次 ； 然后72°C再延伸lOmin ; 2) 将PCR扩增产物电泳检测：取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加 入溴化乙锭贮存液至终浓度为〇. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚 没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电 泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录； 3) 制备焦磷酸测序单链模板：使用50 μ 1标记有生物素的PCR产物与200 μ g链霉亲 和素包被的磁珠，在室温25°C下孵育20分钟，用vacuum pr印tool将与磁珠结合后的PCR 产物吸起，然后在70 %乙醇中清洗5s ;denatureation buffer洗5s ;最后移到washing buffer中清洗10s ;然后将vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。 将样品放入80°C烘箱2分钟，再冷却到室温； 其中焦磷酸测序反应具体如下：测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用 600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延 伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。
【文档编号】C12Q1/70GK104195269SQ201410465241
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】吴兴海, 陈长法, 封立平, 魏晓棠, 冯黎霞, 张京宣, 王简 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心