一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体avctc及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC及其制备方法和应用。所述多基因嵌合体AVCTC的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；所述多基因嵌合体AVCTC为番茄TMV病毒复制酶基因片段ORF400-700、番茄CMV病毒复制酶基因片段ORF45-345、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段ORF420-720、烟草TMV病毒复制酶基因ORF2964-3264和黄瓜CMV复制酶基因ORF2057-2357的嵌合基因，是利用基因合成方法制备而成。将该多基因嵌合体AVCTC转化番茄，进而提高了转基因番茄的抵抗番茄黄化曲叶病毒的能力，为植物抵抗病毒提供有益的帮助。
【专利说明】—种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]长期以来，番茄病毒病一直是生产上的巨大威胁，特别是从六十年代起，随着番茄在全国各地极为普遍地种植，该病迅速传播，广为流行，日益严重。自1909年美国发现第一种番茄病毒_TMV(烟草花叶病毒)以来，世界各地共相继报道了近30种可侵染番茄的病毒。病毒病传播广、危害重，又几乎无药可治，这就使得抗病毒病育种成为消除番茄病毒病威胁的主要策略。然而传统的育种艰苦费时，从而大大限制了育种工作的进展。与之相t匕，基因工程育种具有明显的优越性:①育种周期短；②适用范围广，尤其适用于传统育种因缺乏抗原而难以进行的抗CMV育种；③在育种过程中不会带入其他不良农艺性状的基因等。因此，基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用日益受到人们的重视[孙神敏等，自然杂志，2002，25 (3):136-139]。
[0003]番爺黄化曲叶病毒(TYLCV)属于双生病毒科(Gemin1-viridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus),该病毒属于双生病毒亚组III,是一类粉風传播的双生病毒，主要通过烟粉虱或红薯白粉虱传播，可以侵染茄科、豆科等多种植物，超过20种植物易受TYLCV的影响。
[0004]针对TYLCV的抗病育种工作开始于20世纪60年代，主要措施是利用杂交将野生番茄中的抗病或耐病基因转育到栽培品种中。1988年，世界上第一个抗TYLCV的商品化品种TY-20出现了，它表现为虽然感染病毒，但症状延迟出现，而且产量还相当好。除TY-20之外，另2个来自野生抗原Lycopersicon peruuianum的杂交Fl品种也开发成功。植物基因工程在番茄抗病虫育种材料的创新中取得了重要成果。自从Powell等率先获得烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因转化植物以来，在番茄中已有许多类似成功的研究报道。
[0005]利用基因工程获得抗番茄黄化曲叶病毒材料的研究目前得到很大进展。通过在寄主中表达病毒衣壳蛋白基因、表达病毒复制蛋白mRNA的反义RNA、均可获得对该病害的不同程度的抗性。RNA沉默机制的发现为抗病毒基因工程提供了新的途径，该方面的研究在国际上已经在广泛进行。早在1994年，以色列农业研究组织遗传系的Kunik等就开展了番茄抗黄花曲叶病毒(TYLCV)的转基因技术研究，他们将TYLCV病毒的外壳蛋白Vl基因转化番茄，显著提高了转基因番茄对TYLCV病毒的抗性。2007年，巴基斯坦国家生物技术和遗传工程研究所的Mubin等将TYLCV病毒AV2的反义基因导入烟草，并提高了转基因烟草对TYLCV病毒的抗性。
[0006]然而，RNAi技术抗单个植物病毒也有其局限性，Canizares等研究报道，植物病毒存在抑制植物转录后基因沉默的机制，意味着利用RNAi技术抗一种植物病毒存在巨大风险。只要转基因植物发生了另一种病毒危害， 则该植物病毒启动的转录后基因沉默抑制作用将使转基因植物RNAi抗病毒技术失去了作用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种抗番爺黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC及其制备方法和应用，并将该多基因嵌合体AVCTC转化番茄，进而提高转基因番茄的抵抗番茄黄化曲叶病毒的能力，可以为植物抵抗病毒提供有益的帮助。
[0008]本发明利用基因工程技术培育抵抗番茄黄化曲叶病毒的植物，具体是将来自番茄TMV, CMV和TYLCV三种病毒复制酶基因片段，及烟草TMV复制酶和黄瓜CMV复制酶基因的嵌合基因AVCTC (AVI/AV2/ACI/TMVREP/CMVREP)转化到番茄中，从而大大提高番茄对番茄黄化曲叶病毒的抵抗能力。本发明必将更好弥补传统育种方法的不足，促进番茄品种改良事业的进步和发展。
[0009]因此，本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC。
[0010]本发明所要解决的技术问题之二，在于提供一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC的制备方法。
[0011]本发明所要解决的技术问题之三，在于提供一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC在提高番茄抗番茄黄化曲叶病毒中的应用。
[0012]为了达到上述目的，本发明的技术方案如下:
[0013]一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所
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[0014]所述的抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC是来自番茄TMV病毒复制酶基因片段AVl (0RF400-700)、番茄CMV病毒复制酶基因片段AV2 (0RF45-345)、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段ACl (0RF420-720)、烟草TMV病毒复制酶基因TMVREP (0RF2964-3264和黄瓜CMV复制酶基因CMVREP (0RF2057-2357)的嵌合基因。
[0015]一种抗番爺黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC的制备方法，具体是由来自番茄TMV病毒复制酶基因片段AVl (0RF400-700)、番茄CMV病毒复制酶基因片段AV2 (0RF45-345)、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段ACl (0RF420-720)、烟草TMV病毒复制酶基因TMVREP (0RF2964-3264)和黄瓜CMV病毒复制酶基因CMVREP (0RF2057-2357)通过基因合成法制备而成本发明的多基因嵌合体AVCTC基因，其所用的引物如下:
[0016]
【权利要求】
1.一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根据权利要求1所述的抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC，其特征在于，所述多基因嵌合体AVCTC是番茄TMV病毒复制酶基因片段0RF400-700、番茄CMV病毒复制酶基因片段0RF45-345、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段0RF420-720、烟草TMV病毒复制酶基因0RF2964-3264和黄瓜CMV复制酶基因0RF2057-2357的嵌合基因。
3.如权利要求1所述的抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC的制备方法，具体是由来自番茄TMV病毒复制酶基因片段0RF400-700、番茄CMV病毒复制酶基因片段0RF45-345、番茄TYLCV病毒复制酶基因片段0RF420-720、烟草TMV病毒复制酶基因0RF2964-3264和黄瓜CMV病毒复制酶基因0RF2057-2357通过基因合成法制备而成，其所用的引物如下:
4.如权利要求1或2或3所述的抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体AVCTC在提高番茄抗番茄黄化曲叶病毒中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK103667322SQ201310593843
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】朱波, 姚泉洪, 彭日荷, 韩红娟, 付晓燕, 赵伟, 田永生, 许晶, 薛永, 高建杰, 韩静, 王波, 王丽娟, 李振军 申请人:上海市农业科学院