与辣椒抗黄瓜花叶病毒病基因qcmv-2-1连锁的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子育种领域，设及与辣椒抗黄瓜花叶病毒病基因qcmv-2-l连锁的 分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 黄瓜花叶病毒（化州mber mosaic virus, CMV)为雀麦花叶病毒科度romoviridae) 黄瓜花叶病毒属（化cumovirus)的典型成员，可引起辣椒严重的系统症状，导致叶片黄化、 扭曲变形、严重花叶，损害果实的商品性状。黄瓜花叶病毒病一般能导致辣椒减产20%~ 30 %，严重时可达50 %~60 %，个别地区甚至绝收，是辣椒最严重的病害之一。我国辣椒生 产中CMV检出率最高，是辣椒抗病育种的主攻目标。
[0003] 传统育种方法中，选育抗病材料是通过接种鉴定，根据植株的表型进行筛选。该种 方法因为接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率，难W准确、快速的筛选出具有抗 病基因的个体植株。此外辣椒抗黄瓜花叶病毒病基因大部分来自野生辣椒，抗病基因常与 不良性状基因紧密连锁。利用传统育种方法打破不良连锁所需群体大、周期长、效率低，而 分子标记辅助选择（Mole州IarMarker-assistedSelection,MA巧育种可有效的克服传统 育种的缺陷，加速育种进程。
[0004] 插入/缺失多态性（insertion/deletion,InDel)是由于等位基因位点处的DNA 序列在不同个体间发生了核巧酸片段的插入/缺失而产生的长度多态性变异。根据目标位 点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记。在整 个基因组中，Indel标记的多态性频率仅次于SNP标记，远高于SSR标记。InDel标记多态 性可通过聚合酶链式反应（PCR)和琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙締酷胺凝胶电泳等简单 的步骤达到基因分型的目的。InDel标记为共显性标记，具有较好的稳定性和较为丰富的 多态性，广泛应用于高分辨率图谱构建、关联分析、基因定位和目标性状分子标记筛选等领 域。本发明采用QTkSeq方法和Indel标记技术，筛选与黄瓜花叶病毒病抗性基因qcmv-2-l 紧密连锁的标记，W实现黄瓜花叶病毒病抗性的分子标记辅助育种，加速我国辣椒抗黄瓜 花叶病毒病新品种的选育进程。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种与辣椒抗黄瓜花叶病毒病基 因qcmv-2-l连锁的分子标记。
[0006] 本发明的另一目的是提供与辣椒黄瓜花叶病毒病抗性基因qcmv-2-l连锁的分子 标记的引物对。
[0007] 本发明的又一目的是提供该分子标记及其引物对的应用。
[0008] 本发明的目的可通过W下技术方案实现：
[0009] -种与辣椒黄瓜花叶病毒病抗性基因qcmv-2-l连锁的分子标记，通过引物对 InDel-2-134F/InDe^2-134R扩增辣椒基因组DM,获得的230bp的扩增片段为所述的与辣 椒黄瓜花叶病毒病抗性基因qcmv-2-l连锁的分子标记；其中，InDel-2-134F序列如SEQID NO. 1 所示，InDel-2-134R序列如沈QIDNO. 2 所示。
[0010] 与辣椒黄瓜花叶病毒病抗性基因qcmv-2-l连锁的分子标记的引物对 InDe^2-134F/InDel-2-l：MR，InDe^2-134F序列如沈QIDNO. 1 所示，InDel-2-134R序列 如沈QIDNO. 2所示。
[0011] 辣椒黄瓜花叶病毒病抗性基因qcmv-2-l的分子标记方法，用本发明所述的引物 对InDe^2-134F/lnDel-2-134RPCR扩增待检辣椒基因组DNA，并检测扩增产物，如果扩增 出23化P的扩增片段，则标志着待检辣椒中存在辣椒抗黄瓜花叶病毒病基因qcmv-2-l，待 检辣椒为黄瓜花叶病毒病抗病植株。
[0012] 本发明所述的分子标记在鉴定辣椒种质资源中黄瓜花叶病毒病抗性基因 qcmv-2-l中的应用。
[0013] 本发明所述的分子标记在筛选抗黄瓜花叶病毒病的辣椒中的应用。
[0014] 本发明所述的分子标记在培育抗黄瓜花叶病毒病辣椒的分子育种中的应用。
[0015] 本发明所述的引物对InDe^2-134F/lnDel-2-134R在鉴定辣椒种质资源中黄瓜 花叶病毒病抗性基因qcmv-2-l中的应用。
[0016] 本发明所述的引物对InDe^2-134F/lnDel-2-134R在筛选抗黄瓜花叶病毒病辣 椒中的应用。
[0017] 本发明所述的引物对InDe^2-134F/lnDel-2-134R在培育抗黄瓜花叶病毒病辣 椒的分子育种中的应用。
[001引一种筛选抗黄瓜花叶病毒病辣椒的方法，用所述的引物对InDe^2-134F/InDel-2-134RPCR扩增待检辣椒基因组DNA，并检测扩增产物，如果能够扩增出23化P的扩 增片段，则标志着待检辣椒为存在辣椒抗黄瓜花叶病毒病基因qcmv-2-l的辣椒植株。
[0019] 有益效果：
[0020] 黄瓜花叶病毒病是我国辣椒检出率最高的病毒病之一，是我国辣椒抗病育种的 主攻目标。
[002。本文发明利用Indel标记和QTkSeq法筛选得到的与qcmv-2-l抗性基因连锁的Indel分子标记及对应的引物，标记带型简单，可直接用于标记辅助选择。
[0022] 该标记是一个基于PCR技术的共显性标记，与RFLPXAPS等标记相比，可显著降低 成本，节省劳力。该标记应用于苗期选择，不仅可W减少工作量，而且能够避免因接种不充 分难W筛选出具有抗病基因的个体植株，从而加速育种进程。
【附图说明】
[0023] 图1InDel标记InDe^2-134在亲本间和抗感池间的扩增情况
[0024] M:100bpMarker1 ;P1 :抗病亲本PBC688 ;P2 :感病亲本G29 ;1-5 :F2 抗病单株； 6-10 :F2感病单株
[00巧]图2InDel标记InDe^2-134在Fz群体中的验证
[0026] M:IOObpmarker; 1-10 &代抗病单株；11-20:F2代感病单株
[0027] 图3 Indel标记在23份F2抗感单株中的验证
[0028] M:100bpmarker;l-20:20 份F2抗病单株；21-23:3份F2感病单株
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030] 1.供试材料
[0031] 应用抗病自交系PBC688为母本（利用QTkSeq技术定位辣椒抗黄瓜花叶病毒病 基因，园艺学报，2015,doi:10. 16420/j.issn. 0513-353X)，感病系G29为父本配制杂交组 合（利用的'L-Seq技术定位辣椒抗黄瓜花叶病毒病基因，园艺学报，2015,doi:10. 16420/ j.issn. 0513-353X)，得到Fi后，再次自交得到F2分离群体，利用苗期人工摩擦接种黄瓜花 叶病毒化y株系接种鉴定（辣椒抗黄瓜花叶病毒病研究进展。华北农学报，2014,29(增 刊）：77-84)。
[0032] 具体做法是：挑选饱满的种子播种于营养鉢中，每鉢1粒种子，待4叶1屯、时，进行 人工摩擦接种。接种4周后调查群体发病情况，病情调查分级为0级-无任何症状；1级-屯、 叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级-系统花叶或茎上产生坏死斑点；5级-系统重花叶、崎 形或茎上产生坏死条斑；7级-多数叶片崎形、藤叶、植株矮化或茎、枝和叶脉系统坏死；9 级-植株严重矮化，停止生长或严重系统坏死，至全株死亡（见参考文献：中国作物及其野 生近缘植物：蔬菜作物卷[M].北京：中国农业出版社，2008:719-720)。
[003引 2.基因组DNA的提取
[0034] 辣椒叶片放入1. 5ml离屯、管中，液氮速冻研磨至粉末，立即加入700y1预