一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种虾青素酯酶生产菌株及其在 游离虾青素制备中的应用。
【背景技术】
[0002] 虾青素（Astaxanthin，又称3, 3' -二羟基-4, 4' -二酮基-β，β -胡萝卜素）是 萜烯类不饱和化合物，是类胡萝卜素的一种，广泛存在于生物体内，特别是虾、蟹、藻类和鱼 类等水生生物。虾青素为紫红色，易氧化，氧化后为虾红素（Astacene)。虾青素不溶于水， 具有脂溶性，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳。
[0003] 大量研宄发现，虾青素具有良好的生物学功能，如抗衰老、抗氧化、增强机体免疫 力、抗肿瘤等。虾青素独特的分子结构，使其成为自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化能力是 其他类胡萝卜素的10倍，维生素 E的500倍，被誉为"超级抗氧化剂"或"超级维生素 Ε"。 目前，虾青素已凭借其良好的生物学功能，成为众多行业的"宠儿"，比如食品、水产养殖、医 药及化妆品等行业。
[0004] 目前，虾青素的生产主要分为两类，一类是化学合成法，另一类是生物法。与生物 法相比，化学合成法不仅工艺过程繁琐复杂，而且合成过程中可能被其它有害物质污染，产 品中还含有非天然的异构体，影响其安全性。不仅如此，化学合成的虾青素在结构、生理功 能、应用等方面与天然虾青素有着很大的区别，使得化学合成虾青素的应用受到进一步的 限制。在结构方面，化学合成的虾青素主要为顺式结构，而天然虾青素主要为反式结构。目 前，世界各国越来越重视对化学合成虾青素的管理，其中美国食品与药物管理局（FDA)已 明确禁止化学合成的虾青素进入保健食品市场，仅允许反式结构的虾青素作为水产养殖的 添加剂。因此，生物法将取代化学合成法，成为生产虾青素的主要方法。
[0005] 在生物法制备过程中，主要是从水生动物（如虾及蟹）的壳内以及培养的雨生红 球藻中提取虾青素。水生动物和雨生红球藻中的虾青素多以虾青素酯的形式存在，通过将 虾青素酯水解可获得游离虾青素。目前水解虾青素酯主要采用皂化的方法，该方法虽然具 有反应迅速的优点，但反应过程过于剧烈，难以对产物进行控制，高浓度的碱也会对虾青素 造成破坏，产生较多的副产物，如产生虾红素和半虾红素等。不仅如此，反应过程采用大量 的碱和有机溶剂，不仅破坏了环境，而且造成了极大的浪费，不符合国家发展的战略。另外 一种是采用脂肪酶酶解的方法，通过使用脂肪酶降解虾青素酯来制备游离虾青素，这为游 离虾青素的生产提供了一条新的思路，但酶解过程复杂，需预先水解甘油三酯，并移除游离 脂肪酸后，再利用脂肪酶水解虾青素酯，耗时长、成本高。而且由于虾青素酯的水不溶性和 成分复杂等特点，导致脂肪酶酶解效率较低，使其在大规模制备过程中会受到限制。利用发 酵法制备游离虾青素被认为是一个有效的方法，但目前存在的混菌发酵法并不能实现虾青 素酯的完全水解，游离虾青素生产的工业化进程依旧无法实现。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的应用， 即一种能高效降解虾青素酯的菌株，及该菌株在生产游离虾青素中的应用，从而弥补现有 技术的不足。
[0007] 本发明首先提供一种寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp. )OUC-LH15,该菌株于 2015年03月30日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄 所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏编号为 CGMCC NO. 10672。
[0008] 上述的寡养单胞菌用于发酵生产游离虾青素；
[0009] 本发明还提供一种生产游离虾青素的方法，是在添加有虾青素酯或提供虾青素酯 的原料的培养基中接种寡养单胞菌来发酵制备游离虾青素。
[0010] 作为优选，所述的含有虾青素酯的原料为雨生红球藻油和/或含有虾青素酯的水 生动物（如虾及蟹）的有机溶剂提取物。
[0011] 作为优选，发酵培养基的组成如下（g/mL质量体积比）：雨生红球藻油和/或含有 虾青素酯的水生动物（如虾及蟹）有机溶剂提取物、KH 2PO4 0· 025%、MgS04 ·7Η20 0· 025%、 FeSO4 · 7Η20 0· 001%、牛肉膏 0· 1%、蛋白胨 1%、ρΗ 7· 0，
[0012] 上述的培养基中优选添加 Tween-80,其添加量依据实施过程的发酵优化结果来 定；
[0013] 本发明提供了一株高效利用雨生红藻油和/或水生动物（如虾及蟹）有机溶剂 提取物生产游离虾青素的寡养单胞菌菌株，该菌株能够高效的降解虾青素酯制备游离虾青 素。而且，本发明通过实验，确定发酵液中吐温80添加量、接种量、发酵液初始pH、发酵时间 条件，从而提供了一种高效的制备游离虾青素的方法。
【附图说明】
[0014] 图I :Tween-80添加量对发酵的影响图；
[0015] 图2 :种龄对发酵的影响图；
[0016] 图3 :接种量对发酵的影响；
[0017] 图4 :发酵液初始pH对发酵的影响；
[0018] 图5 :菌株发酵曲线图；
[0019] 图6 :本发明微生物发酵法制备的游离虾青素 HPLC图谱
[0020] 图7 :皂化法制备的游离虾青素的HPLC图谱
[0021] 图8 :雨生红球藻油中虾青素酯的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0023] 一、降解虾青素酯菌株的筛选
[0024] 本发明所使用的培养基配方如下：
[0025] 1)富集培养基
[0026] NH4NO3 0· 1 %，KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0· 001 %，胆固 醇油酸酯〇. 1%，自来水配，pH 7. 0，115°C灭菌30min。
[0027] 2)筛选平板固体培养基（固体筛选平板）
[0028] NH4NO3 0· 1 %，KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0· 001 %，胆固 醇油酸酯（L〇%Triton X-100助溶）0· 1%，琼脂2%，自来水配，pH 7.0，115°C灭菌30min。
[0029] 3)发酵培养基
[0030] 雨生红球藻油发酵培养基：KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0. 001 %，牛肉膏0.1 %，蛋白胨I %，雨生红球藻油（0. 4% Tween80助溶）0. 5%，自来水配， pH 7. 0,115°C灭菌 30min。
[0031] 胆固醇油酸酯发酵培养基：KH2PO4 (λ 025%，MgSO4 · 7Η20 (λ 025%，FeSO4 · 7H20 0.001%，牛肉膏 0.1%，蛋白胨 L0%，胆固醇油酸酯 0.1%，Tween 80 0.4%，pH 7.0， 115°C高压灭菌30min。
[0032] 4)种子培养基
[0033] 牛肉膏0.3%，蛋白胨l%，NaCl 0.3%，自来水配，pH 7.0，115°C高压灭菌30min。
[0034] 1、菌株的筛选过程
[0035] I. 1富集培养
[0036] 将配制的富集培养基IOOmL于250mL三角瓶中，灭菌备用。将3g取自屠宰场的土 样加入到三角瓶中，混合均匀后，在37°C 180rpm下培养24h。
[0037] I. 2平板初筛
[0038] 取富集培养的菌液进行100倍的适度稀释，涂布于固体筛选平板上；置于37°C培 养箱中，静置培养48h。
[0039] L 3发酵复筛
[0040] (1)菌株富集挑选平板初筛得到的阳性菌株于灭菌的种子培养基中，在 37°C 180rpm下富集培养24h。
[0041] (2)发酵培养取富集培养后的菌液lmL，接种至灭菌的含雨生红球藻油发酵培养 基的三角瓶（100mL/250mL)中，然后将三角瓶置于恒温培养箱内，于37°C 180rpm下震荡培 养48h，取发酵液进行产物检测。
[0042] A、薄层层析法检测
[0043] 发酵结束后，取ImL发酵液用二氯甲烷反复萃取，直至水相为无色。用毛细管吸取 萃取液，点样于硅胶板上，置于用层析液（正己烷/丙酮=4/1)平衡后的层析缸中，以虾青 素标准品作为对照，根据R f值判断是否有虾青素单体产生。
[0044] B、HPLC 法检测
[0045] 取ImL发酵液，加 ImL二氯甲烧，反复震荡萃取，静置分层，弃上层水相，下层有机 相用氮气吹干，并加 ImL有机溶剂（甲醇：甲基叔丁基醚=1:1)进行溶解，过0. 22 μ m有机 膜，上柱分析。为了避免萃取不充分而导致的误差，发酵效果以液相谱图中虾青素与虾青素 酯的面积比作为因变量进行考察，面积比数值大，说明发酵效果好，面积比数值小，说明发 酵效果欠佳。
[0046] 色谱柱：Develosil C30-UG-5 ;
[0047] 流动相：A为甲醇；B为甲基叔丁基醚；C为超纯水；
[0048] 流速：lmL/min;
[0049] 检测器：DAD ;
[0050] 检测波长：476nm ;
[0051] 温度：25 °C;
[0052] 进样量：20 μ L。
[0053] 采用梯度洗脱程序，洗脱条件如表1所示。
[0054] 表1 :虾青素分离梯度洗脱程序
【主权项】
1. 一种寡养单胞菌，其特征在于，所述的寡养单胞菌的保藏编号为CGMCC NO. 10672。
2. 权利要求1所述的寡养单胞菌用于发酵生产游离虾青素。
3. -种生产游离虾青素的方法，其特征在于，所述的方法是在添加有虾青素酯或提供 虾青素酯的原料的培养基中接种权利要求1所述的寡养单胞菌来发酵制备游离虾青素。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的含有虾青素酯的原料为雨生红球藻 油和/或水生动物的有机溶剂提取物。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的水生动物为含有虾青素酯的水生动 物。
6. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的水生动物为虾类或蟹类。
7. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养基的组成如下：雨生红球藻油 和/或含有虾青素酯的水生动物有机溶剂提取物、KH 2PO4 0? 025%、MgSO4 ? 7H20 0? 025%、 FeSO4 ? 7H20 0? 001%、牛肉膏 0? 1%、蛋白胨 1%，pH 7. 0。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的培养基中添加有Tween-80。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的应用，本发明的生产脂肪酶和酯酶的菌株为寡养单胞菌，保藏编号为CGMCC NO.10672。本发明提供了一株高效利用雨生红藻油和/或水生动物(如虾及蟹)有机溶剂提取物生产游离虾青素的寡养单胞菌菌株，该菌株能够高效的降解虾青素酯制备游离虾青素。而且，本发明通过实验，确定发酵液中吐温80添加量、接种量、发酵液初始pH、发酵时间条件，从而提供了一种高效的制备游离虾青素的方法。CGMCC NO.1067220150330
【IPC分类】C12N1-20, C12P23-00, C12R1-01
【公开号】CN104877944
【申请号】CN201510323743
【发明人】毛相朝, 董浩, 薛长湖
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月14日