一株防治地黄根腐病的拮抗菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株防治地黄根腐病的拮抗细菌，可用于克服或缓解连作地黄土传病害问题，属于微生物和生物防治技术领域。
【背景技术】
[0002]对于连作障碍问题的认识由来已久，很多的粮食作物(如小麦、马铃薯)、经济作物(如烟草、棉花)、油料作物(如大豆、花生)、蔬菜(黄瓜、番茄)、园艺作物(如西瓜、草莓)、药用植物(如人参、地黄、三七)以及人工林(如杨树、杉木)都存在不同程度的连作障碍问题。但是，长期困扰我国农业生产的连作障碍问题，在中药材栽培生产中表现尤为严重，约70%的块根类药用植物都存在不同程度的连作障碍问题，如地黄、三七、当归、人参等药用植物均存在严重的连作障碍问题。
[0003]塊歲{Rehmannia glutinosa L.)为玄参科多年生草本植物，以块根入药，其用药历史悠久、临床疗效显著，是我国著名的道地药材。然而，地黄的连作障碍问题尤为严重，连作下地黄植株往往表现出生长发育不良的症状:地上部植株矮小弱化、叶片光合作用减弱、易枯萎倒伏；地下部块根无法正常膨大、根冠比失调；生育期缩短，药效成分无法有效积累，药用品质下降；病虫害发生猖獗，块根易腐烂，常发生大面积枯死现象(如图1所示)。通常，每茬地黄收获后须间隔8?10年方可在同一地块上再次种植。地黄连作不仅造成产量、品质急剧下降以及土传病害严重，更加令人担忧的是，在连作障碍成因及作用机理尚不明确的情况下，大部分农户试图通过增施肥料、滥用农药等措施来维持产量，可是效果往往不佳，不但提高了生产投入，还导致环境污染、中药材农残超标和农田生态系统功能退化等一系列问题，使中药资源的栽培生产陷入了恶性循环。因此，构建一种合理有效的措施用于克服或缓解连作障碍和土传病害问题成为药用植物资源生态学研宄的重要内容。课题组前期研宄发现，尖孢镰刀菌(如图2所示)是导致地黄连作障碍、土传病害猖獗的重要因素，其含量随地黄连作年限增加而不断增加。而利用拮抗菌进行植物病害的生物防治被认为是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本发明针对地黄专化型尖孢镰刀菌，分离筛选到一株高效措抗该病原真菌的措抗细菌，鉴定为铜绿假单胞菌，命名为Pseudotnoimsaeruginosa LK-120
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株防治地黄根腐病的拮抗细菌，用于生物防治地黄连续种植过程中常见的根腐病问题，为克服或缓解地黄连作障碍问题提供生防菌株。
[0005]本发明的技术方案如下:
本发明所提供的措抗细菌为铜绿假单胞菌{Pseudomorms aeruginosa LK-12)，该菌株已于2015年6月9日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院的中国科学院微生物研宄所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 10966。
[0006]本发明所述的铜绿假单胞菌aeruginosa LK-12)对地黄专化型病原菌一尖孢镰刀菌具有很强的拮抗作用。
[0007]本发明所述的有益拮抗菌具有以下几个优点:
(I)本发明所述的措抗菌一铜绿假单胞菌aeruginosa LK-12)是通过大量的筛选工作筛选到的，是从2946株土壤细菌中筛选得到的，对地黄专化型尖孢镰刀菌具有很强的拮抗效果。
[0008](2)本发明所述的措抗菌一铜绿假单胞菌(/kewt/offlmas aeruginosa LK-12)对筛选于地黄病变根部的黄曲霉和筛选于药用植物太子参连作土壤或病变部位的尖孢镰刀菌、裸节霉菌、串珠霉菌也具有很强的拮抗作用。
[0009](3)本发明所述的措抗菌一铜绿假单胞菌(/kewt/offlmas aeruginosa LK-12)来源于连作地黄根际土壤中，并非源自其他生境，根际定殖效果较好并且安全可靠，对地黄及其他常种作物(如小麦、玉米、水稻、大豆、花生等)均无致病侵染能力。
[0010](4)本发明所述的措抗菌一铜绿假单胞菌(/kewt/offlmas aeruginosa LK-12)的培养温度范围优选为25° C?45° C，pH范围为5?9.5，适合生长的温度和pH范围较广，适应性强。
【附图说明】
[0011]图1为不同连作年限的地黄地上部和地下部生长情况。
[0012]图2为地黄植株病害根部分离到的病原菌一尖孢镰刀菌的菌落形态.A:表示菌落正面:表示菌落反面。
[0013]图3为措抗菌铜绿假单胞菌(Aewt/offlmas aeruginosa LK-12)的革兰氏染色及显微形态观察。
[0014]图4为铜绿假单胞菌(/kewt/offlmas aeruginosa LK-12)与病原真菌的对峙培养照片.平板中心接种各类病原真菌，其中A:尖孢镰刀菌(来源地黄);B:黄曲霉(来源地黄)；C:尖孢镰刀菌(来源太子参);D:踝节霉菌(来源太子参);E:串珠镰刀菌(来源太子参).B为马铃薯蔗糖培养基(PSA)平板，其余均为马铃薯葡萄糖(PDA)培养基。
[0015]图5为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa LK-12)的代谢产物抑制尖孢镰刀菌生长.A:添加LK-12发酵液；B:未添加LK-12发酵液。
[0016]图6为铜绿假单胞菌(Aewt/offlmas aeruginosa LK-12)防控尖孢镰刀菌侵染地黄组培苗.A:表示仅接种尖孢镰刀菌(左)及接种尖孢镰刀菌和假单胞菌(右)的组培苗生长情况俯视图:表示仅接种尖孢镰刀菌(左)及接种尖孢镰刀菌和假单胞菌(右)的组培苗生长情况侧面图。
[0017]图7为铜绿假单胞菌(Aewt/offlmas aeruginosa LK-12)防控尖孢镰刀菌侵染地黄脱毒移栽苗.左三盆表示仅接种尖孢镰刀菌；右三盆表示接种假单胞菌(距根部2 cm接种一圈)和尖孢镰刀菌(距根部4 cm接种一圈)。
【具体实施方式】
[0018]以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
[0019]实施例1措抗菌铜绿假单胞菌(AeWtZofflmas aeruginosa LK-12)的筛选及其鉴定
1、地黄专化型尖孢镰刀菌措抗菌Pseudomonasaeruginosa LK-12的筛选
本发明所述的措抗菌铜绿假单胞菌aeruginosa LK-12)从连作地黄根际土壤中筛选得到。
[0020]1.1假单胞菌选择性培养基配制
假单胞菌选择性培养基(pseudomonas selective isolat1n agar，PSIA)配制方法如下:称取20 g大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基(soybean casein digest agar，SO)) (BD,USA)，加495.5 mL双蒸水加热搅拌，充分溶解后，再加入I mL 0.l%(wt/vol)结晶紫储备液，121° C高温高压灭菌15 min，冷却至大约50° C时，往培养基中再添加3.5 mL 5% (wt/vol)呋喃咀啶储备液，充分混匀后，迅速倒板，冷却凝固后即制得假单胞菌选择性培养基平板。
[0021]其中，0.1% (wt/vol)结晶紫储备液的配制方法为:称取0.1 g结晶紫(Sangon，上海)，溶于100 mL双蒸水中，室温保存备用；呋喃咀啶储备液的配制方法为:称取5 g呋喃妥因(Sangon，上海)，加入到90 mL N, N-二甲基甲酰胺(Sangon，上海)中充分溶解，再定容至100 mL，室温避光保存备用。
[0022]1.2根际土壤中假单胞菌分离筛选
称取5 g的新鲜根际土壤，溶于45 mL冷却的无菌水中，充分振荡摇勾，得KT1稀释液，取5 mL KT1稀释度的土壤悬浮液至另一瓶45 mL冷却的无菌水中，充分振荡摇勾，得10 _2稀释液，再次稀释得10_3稀释液，吸取60 μ L的土壤稀释液，均匀涂布到制好的假单胞菌选择性培养基平板上，每个稀释度均涂3个平板，置于32° C恒温培养箱中避光培养30 h。挑选单菌落清晰可辨且生长均匀的平板，转接至新的选择性培养基平板上32° C继续培养，待菌落清晰可见时，置于4° C冰箱中短暂保存备用。
[0023]1.3地黄专化型尖孢镰刀菌的拮抗菌筛选
配制马铃薯蔗糖培养基(PSA)或马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，配制如下:称取洗净去皮的马铃薯200 g，切成小块，加适量水煮沸后计时25 min，用四层纱布过滤，往滤液中加入鹿糖30 g (或葡萄糖30 g)、琼脂15 g，继续加热搅拌混勾，稍加冷却后再加水定容至1000mL,分装，高压灭菌后倒板或保存备用。
[0024]经121° C高温高压灭菌的PSA或PDA培养基，迅速倒板，冷却凝固后制得平板，在培养皿底部过圆心画十字架，在距离圆心2.5