cm处接种经活化培养的假单胞菌，置于
28。C恒温培养箱中避光培养48 h后，在培养皿的中心位置接种地黄专化型尖孢镰刀菌，置于28° C恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的有无及大小。对峙培养5天后，通过观察抑菌圈大小筛选出一株对地黄专化型尖孢镰刀菌具有强拮抗效应的假单胞菌，对该菌株进行了保藏，保藏编号为CGMCC 10966。将筛选到的强拮抗菌株进行纯化培养，并斜面保存备用。
[0025]2、地黄专化型尖孢镰刀菌的拮抗菌鉴定
2.1本发明所述的拮抗菌(保藏编号为:CGMCC 10966)经显微观察可以看到该菌为杆菌，具单鞭毛，革兰氏阴性菌(如图3所示)。在LB固体培养基上为扁平、湿润的菌落，菌落呈金属光泽。能产生荧光色素。同时，该拮抗菌的生理生化特性为:氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖，产酸不产气，同时能分解果糖、丙三醇、甘露醇、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸，但不分解蔗糖和肌醇。不能水解淀粉，能液化明胶，可分解尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾。
[0026]2.2 16s-23s rRNA 基因区间 PCR 鉴定
将筛选出的强拮抗菌株(保藏编号为:CGMCC 10966)转接至LB液体培养基进行扩大培养，提取基因组DNA，PCR扩增16s-23s rRNA基因区间，用于细菌分子鉴定。细菌基因组DNA提取方法如下:取I mL摇过夜的假单胞菌菌液(28° C，180 rpm)，10000 rpm离心5 min,去上清，往沉淀菌体中加入950 UL TE缓冲液悬浮沉淀，并加50 yL 10% SDS溶液和5 yL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，37° C水浴 I h，再加入 150 μ L 5 mol/mL NaCl 溶液和 150 μ LCTAB/NaCl溶液(10% CTAB，4.1% NaCl)，混匀，65° C水浴20 min，加等体积的酚:氯仿:异戊醇(体积比25: 24:1)溶液进行抽提，12000 rpm离心10 min，将上清液用等体积的氯仿/异戊醇(24/1)再抽提一次，上清液用等体积异丙醇室温沉淀30 min, 12000 rpm离心10 min,弃上清，DNA沉淀用70%乙醇进行清洗，自然风干后用50 μ L无菌水进行溶解。
[0027]采用16s-23s rRNA基因区间PCR扩增技术对分离筛选的假单胞菌进行分子鉴定，鉴定引物序列为:1405f (5，-TGYACACACCGCCCGT-3’)和 456r (5，-CCTTT CCCTCACGGTACTG-3’)。PCR 扩增体系(25 yL)为:12.5 μ L Taq PCR Master Mix (2X) (Sangon，上海)，1.0 yL上下游引物(10 μΜ)，20 ng DNA模板。PCR扩增程序为:94° C预变性5 min,94° C变性I min，61° C退火I min，72° C延伸90 sec，35个循环，继续72。C延伸10 min。扩增的16s-23s rRNA基因片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Universal DNAPurificat1n Kit胶回收试剂盒(TIANGEN，北京)纯化回收目的条带，并送上海生工测序部进行测序。测序序列采用BLAST工具与NCBI数据库(Nucleotide collect1n (nr/nt))进行比对分析。分子生物学鉴定该措抗菌为铜绿假单胞菌，命名为Pseudomorms aeruginosaLK-12ο
[0028]实施例2拮抗菌及其拮抗物质的抑菌效果检测
(I)拮抗菌对峙培养
配制PSA或PDA培养基，经121° C高温高压灭菌后迅速倒板，冷却凝固后制得PSA或PDA平板，在培养皿底部过圆心画十字架，在距离圆心2.5 cm处接种经活化培养的假单胞菌，置于28° C恒温培养箱中避光培养48 h后，在培养皿的中心位置接种病原真菌，置于28° C恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的形成。培养5天发现，铜绿假单胞菌(Aewt/offlmas aeruginosa LK-12)能够高效措抗地黄专化型尖孢镰刀菌、黄曲霉以及太子参专化型尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、踝节霉菌，抑制其菌丝生长(如图4所示)。
[0029](2)拮抗物质的抑菌效果检测
将保存的拮抗菌接种于LB液体培养基中振荡培养48h，高速离心后，上清用0.22 μπι微孔滤膜过滤除菌，将滤液采用代谢物平板添加法进行抑菌效果评价。结果显示，添加了代谢产物的试验组，病原菌尖孢镰刀菌菌丝生长受抑制，而未添加代谢产物的对照组，病原菌菌丝生长正常。通过测量发现添加代谢产物的试验组尖孢镰刀菌的菌丝半径比对照组小了I cm (如图5所示)。
[0030]其中代谢物平板添加法的实验步骤为:将已灭菌的PDA培养基加热到完全融化，冷却到45°C左右加入已超滤除菌的拮抗菌发酵液(2.5%)，混匀后倒入培养皿内，待其凝固。之后接入已活化的地黄专化型尖孢镰刀菌，置于28° C恒温培养箱中避光培养数天，实时观察尖孢镰刀菌生长。
[0031]实施例3拮抗菌防控尖孢镰刀菌侵害地黄组培苗效果评价
配制地黄组培苗MS培养基(MS + 0.2 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂)，每个组培瓶添加30 mL培养基，经高温高压灭菌，待冷却凝固后，用镊子在培养基表面烫出一条小沟，在小沟一侧接种地黄幼苗2株，置于25° C恒温组培室中培养45天后，在小沟中添加培养过夜的假单胞菌LK-12菌液300 μ L，对照组添加等量LB培养基代替，在小沟的另一侧(即远离地黄组培苗一侧)接种地黄专化型尖孢镰刀菌，期间持续往小沟内添加假单胞菌LK-12菌液，动态观察尖孢镰刀菌生长及其对地黄组培苗的侵染情况。结果显示，病原菌与组培苗间添加有拮抗菌的试验组中，尖孢镰刀菌生长被抑制，仅在小沟外侧范围内生长，而添加等量LB培养基的对照组中，尖孢镰刀菌生长快速，能够越过小沟，侵染地黄组培苗植株，造成组培苗茎腐烂，最终死亡(如图6所示)。
[0032]实施例4拮抗菌防控尖孢镰刀菌侵害地黄脱毒移栽苗效果评价
将培养45天的地黄组培苗移栽至经高温高压灭菌处理的培养基质中，每盆种植I株，驯化培养两周，挑选长势一致的地黄移栽苗进行后续试验。在地黄移栽苗根部周围2 cm处接种一圈培养过夜的假单胞菌LK-12菌液，2天后，在根部周围4 cm处(即假单胞菌LK-12外圈)接种地黄专化型尖孢镰刀菌，25。C恒温组培室中继续培养，期间每3天添加一次假单胞菌LK-12菌液，对照组以添加等量LB培养基代替，动态观察尖孢镰刀菌对地黄移栽苗的侵染情况。结果显示:仅添加病原菌的对照组中，地黄移栽苗很快出现病变症状，在第10天时开始出现枯萎现象，到15天时已基本腐烂死亡，挑菌再测序验证发现对照组土壤表面和死亡植株上有大量尖孢镰刀菌菌丝生长，而试验组的地黄脱毒苗生长良好，整个试验期间都没有病变现象(如图7所示)。
[0033]综上可见，本发明筛选出的一株拮抗菌(保藏号为CGMCC 10966)对地黄专化型病原菌具有很强的拮抗作用，能够有效防控尖孢镰刀菌病原菌对地黄的侵害，在该领域具有广阔的应用前景。
[0034]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一株防治地黄根腐病的拮抗菌，其特征在于:所述的拮抗菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) LK-12，已于2015年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC 10966。
2.—种如权利要求1所述的防治地黄根腐病的拮抗菌在防治地黄、太子参药用植物再植病害和土传病害上的应用。
【专利摘要】本发明提供一株防治地黄根腐病的拮抗细菌，该菌经鉴定为铜绿假单胞菌，命名为Pseudomonas aeruginosa LK-12，保藏号为CGMCC 10966。本发明公开的铜绿假单胞菌LK-12是经平板对峙培养方法从地黄连作根际土壤中筛选获得，对分离至地黄病变部位的尖孢镰刀菌、黄曲霉病原菌具有强拮抗作用，同时对分离至太子参发病部位的尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、踝节霉菌等病原菌也有明显的抑制作用，可以有效防治包括地黄在内的药用植物的根腐病病害，为克服或缓解药用植物的再植病害提供菌种，是一种生防效果好、无污染、安全生态的生物防治潜力菌株，开发应用前景广阔。CGMCC 1096620150609
【IPC分类】C12R1-385, A01P3-00, C12N1-20
【公开号】CN104877943
【申请号】CN201510317863
【发明人】吴林坤, 王娟英, 林文雄, 吴红淼, 陈军
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月11日