一株铵离子耐受型产丁二酸的大肠杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株铵离子耐受型产丁二酸大肠杆菌及其应用，属于工业微生物育种 及其发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微 生物中。丁二酸作为TCA循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢 过程中占有非常重要的地位。近年来的研宄结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合 成1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS)类生物 可降解聚酯。近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁 二酸备受瞩目，美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
[0003] 相对于化学合成法，生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成 丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发 酵生产丁二酸，相对于化学合成的方法，其一大优势是原材料为酸成为近年来研宄的热点。
[0004] 发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，多数细菌和真菌都能产生丁二 酸，但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸，丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生 产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前，丁二酸工业发酵菌株的研宄主要集中在 产丁二酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillumsucciniciproducens)，产丁二酸放线杆菌 (Actinobacillussuccinogenes)，谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum)和大肠杆 菌（Escherichiacoli)等。其中Escherichia coli由于遗传背景清楚，基因操作简单，生 长速度快，易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研宄热点。
[0005] 发酵法生产丁二酸的过程中需要加碱调节PH来维持菌体的最适生长产酸。目前 能实现的工艺要求的PH调节剂主要有钠盐、钙盐、镁盐以及浓氨水，前三者有试剂消耗量 大、价格昂贵、下游提取工艺复杂等缺点，而采用氨水调节PH发酵生产丁二酸工艺中，不需 要消耗大量的试剂，生产的副产物少，结晶的丁二酸是唯一产物，该工艺具有闭合、清洁、廉 价和尚效等优点。
[0006] 本申请以本实验室自主筛选并保藏的菌株BER208为出发菌株（保藏编号CCTCC NO :M2012351)，由于铵离子对该菌株的生长和产酸都有抑制作用，用氨水调pH发酵效果不 理想。为了实现氨水调节PH的廉洁工艺，选育可以耐受高浓度铵离子产丁二酸的菌株的工 作显得尤为必要。通过改良菌株，使其可以在厌氧条件下耐受高浓度铵离子并大量积累产 酸，在今后的丁二酸生长工业中具有举足轻重的作用。
【发明内容】
[0007] 本发明一个目的是提供一株在厌氧条件下高浓度铵离子耐受型的大肠杆菌，使其 可以积累丁二酸。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0009] -株铵根离子耐受型产丁二酸的大肠杆菌，其属于埃希氏菌属，命名为大肠埃希 氏菌BER528(Escherichia coli BER528)，已于2015年3月25日保存于中国典型微生物保 藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏登记号为CCTCC NO :M2015160。
[0010] 本发明所述的耐受高浓度铵离子、纯厌氧发酵产丁二酸的大肠埃希氏菌 Escherichia coli BER528的筛选方法：将大肠杆菌的出发菌株BER208经连续培养后，利 用高浓度铵离子合成培养基连续培养初筛和平板复筛得到能够在厌氧条件下生长的菌株， 在经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产产丁二酸的菌株为目标菌株。其具体步骤如下：
[0011] (1)连续培养：将大肠杆菌原始菌株BER208在试管中活化，37°C，200r/min，过夜 培养。将试管中活化过的菌株接入到摇瓶中，37°C，200r/min培养6个小时，作为二级种子。
[0012] ⑵连续培养装置初筛：将步骤⑴所述的二级种子以10%接种量接入到含有高 浓度铵离子合成培养基的连续培养装置中，对菌株进行连续培养；当装置中的菌体密度上 升并达到稳定时，则提高稀释速率，并根据反应器中菌体密度和糖浓度的变化，不断调节稀 释速率。当装置中菌体密度和耗糖保持3个保留时间不变时，则表示突变菌株可能出现，从 反应器中取样检测并涂布到含有高浓度铵离子合成培养基的固体平板上；
[0013] (3)高浓度铵离子合成培养基平板复筛：将步骤2)中筛选到的菌株在平板上反复 转点培养，37°C厌氧培养24h，挑选生长较大，较为饱满的菌落；
[0014] (4)厌氧摇瓶发酵筛选：将步骤3)中筛选出的菌株接种到种子培养基中扩大培 养，37°C，200r/min，培养48h，然后在发酵培养基中发酵，接种量为2% (v/v)，37°C，200r/ min，培养72h ;考察步骤3)中筛选出的菌落中筛选出生长速度快，产酸量高的菌株。
[0015] 在上述筛选方法中，步骤2)中所述的连续培养装置中，水浴加热维持装置37°C， 200r/min磁力搅拌，0· 5L/min通入无菌二氧化碳气体，20% Na2CO3控制pH为6. 8。通过懦 动泵不断泵入新鲜培养基，当反应器中菌液体积超出200mL时，将自动被气体压出。
[0016] 在上述筛选方法中：
[0017] 种子培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC15g/L。
[0018] 发酵培养基为：柠檬酸 3g/L，Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P048g/L，MgSO4 · 7H201g/ L，CaCl2 · 2Η2010· Omg/L，ZnSO4 · 7Η200· 5mg/L，CuCl2 · 2Η200· 25mg/L，MnSO4 · Η202· 5mg/L， CoCl2 · 6H20L 75mg/L，H3BO3O. 12mg/L，Al2 (S04) 31· 77mg/L，Na2MoO4 · 2Η200· 5mg/L，柠檬酸铁 16. lmg/L，维生素 BjOmg/L，生物素2mg/L，葡萄糖30~40g/L，以（NH4) 2即04提供按离子并 使NH4+浓度为0· 6mol/L，添加量为40g/L〇
[0019] 固体平板培养基为：发酵培养基中添加2%琼脂，葡萄糖10g/L。
[0020] 本发明还提供上述的铵离子耐受型产丁二酸的大肠杆菌在发酵生产丁二酸的应 用。
[0021] 该应用的具体步骤为：
[0022] (1)平板培养：将大肠埃希氏菌（Eshcherichia coli)BER528接种在平板培养基 上厌氧培养，培养温度为37°C，培养时间为24h ;
[0023] (2)种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌（Escherichia coli)BER528接种到种 子培养基中，培养温度为37°C，200r/min，培养时间为48h ;
[0024] (3)发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量2% (v/v)， IOOmL厌氧摇瓶装液量为30mL，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳2min ;培养温度为 37°C，200r/min，培养时间为 72h。
[0025]所述平板培养基配方为：柠檬酸 3g/L，Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P048g/L， MgSO4 · 7H201g/L，CaCl2 · 2Η2010· Omg/L，ZnSO4 · 7Η200· 5mg/L，CuCl2 · 2Η200· 25mg/ L，MnSO4 · Η202· 5mg/L，CoCl2 · 6Η201· 75mg/L，H3BO3O. 12mg/L，Al2(SCM) 31· 77mg/L， Na2MoO4 ·2Η200· 5mg/L，柠檬酸铁 16. lmg/L，琼脂 20g/L，葡萄糖 10g/L，以（NH4)2HPO4提供铵 离子并使NH 4+浓度为0· 6mol/L，添加量为40g/L〇
[0026] 所述种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC15g/L。
[0027] 所述发酵培养基的配方为：柠檬酸3g/L，Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P048g/L， MgSO4 · 7H201g/L，CaCl2 · 2Η2010· Omg/L，ZnSO4 · 7Η200· 5mg/L，CuCl2 · 2Η200· 25mg/ L，MnSO4 · Η202· 5mg/L，CoCl2 · 6Η201· 75mg/L，H3BO3O. 12mg/L，Al2(SCM) 31· 77mg/L， Na2MoO4 ·2Η200· 5mg/L，梓檬酸铁16. lmg/L，碱式碳酸镁24~42g/L，葡萄糖30~40g/L，以 (順4)2即0 4提供铵离子并使NH 4+浓度为0. 6mol/L，添加量为40g/L。
[0028] 本发明的有益效果在于：
[0029] 本发明采用连续培养方式培养大肠杆菌，利用含有高浓度铵离子的合成培养基平 板，筛选出在厌氧条件下能够耐受高浓度铵离子，并高产丁二酸的菌株。本发明的菌株可以 在厌氧条件下，耐受高浓度的铵离子，并积累丁二酸。在外源添加〇. 53mol/LNH4+的厌氧摇 瓶发酵中，72h菌体DCW为I. 82g/L，丁二酸产量为11. 72g/L，而原始出发菌株在该条件生长 极其缓慢，72h菌体DCW仅为I. 14g/L，丁二酸产量为2.56g/L。相对于出发菌株，丁二酸产 量提高4. 57倍。在5L发酵罐中利用氨水调节pH，