一株能防治枇杷根腐病的木霉的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株能防治枇杷根腐病的木霉，属于微生物【技术领域】。本发明能防治枇杷根腐病的LY1木霉，其保藏编号为CGMCC No.9390。该木霉对枇杷根腐病病菌具有很强的拮抗效果，可用于防治枇杷根腐病，室内抑制率达88％。使用该木霉防治枇杷根腐病的方法为：将该木霉在固体培养基上培养，用打孔器打取菌饼备用，同时用同一规格的打孔器将枇杷苗主干韧皮部打出孔，去除韧皮部；将上述菌饼放置于除去韧皮部的枇杷主干孔中，用保鲜膜密封保湿；或将该木霉在液体培养基中培养，用无菌水将菌液稀释，每株枇杷灌根500mL稀释液。本发明的木霉能有效防治枇杷根腐病，防治方法简单、不污染环境，同时还能促进枇杷植株生长。
CGMCC No.9390
2014.06.27
【专利说明】一株能防治枇杷根腐病的木霉
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，涉及一株能防治枇杷根腐病的木霉。
【背景技术】
[0002]枇杷(Er1botrya japonica)在中国分布于长江以南地区，是中国南方主要果树之一。其花、果、叶、根及树皮等均可入药。果实果肉柔软多汁，甜酸适度，营养丰富。中国枇杷产量占世界总产量的70%以上，栽种枇杷正成为南方山区脱贫致富的门路。
[0003]不幸的是，云南、福建、台湾等省市枇杷受到根腐病危害，仅云南省蒙自市，枇杷根腐病发病率高达40%，每年损失800万元以上。红河学院生命科学与技术学院多年调查发现枇杷根腐病田间症状初期表现出树势衰退，叶片变黄脱落，偶尔下大雨时，植株发病相当快，只留下褐色干枯的叶片挂在死树枝上，茎基部皮层变暗色，流胶。中期茎干颜色呈暗褐色，基部腐烂，韧皮部呈鱼鳞状，地上部维管组织呈红褐色。病株根环腐，不长新根，有白色菌丝。后期植株萎蔫、树皮脱落、最后整株枯死。田间发病枇杷出现症状到整株死亡，快的I个月，慢的也不超过2年，而且发病后的植株不挂果，造成严重经济损失。高温高湿有利于此病害发生，因此7、8月份雨量充沛年份，发病尤其严重。其病原菌的种类各地区报道不一致，台湾报道的根腐病由寄生疫霉(Phytophthora parasitica)引起,福建报道的为帚梗柱孢属(Cylindrocladium sp.)引起。而红河学院生命科学与技术学院初步鉴定云南蒙自枇杷根腐病由拟盘多毛孢属Pestalot1psis sp.引起。经多次分离，未发现Phytophthoraparasitica和Cylindrocladium sp.两种病菌侵染蒙自枇杷。不管枇杷根腐病是哪种真菌引起，其共同点都是土传病害，属于毁灭性病害，制约着枇杷产业发展。
[0004]目前除了氟菌.霜霉威(银法利)有一定控制效果之外，其它任何农药都没有控制效果。另外，由于此病发展迅速，往往来不及防治，植株就死亡；加之此药药价过高(净含量25mL的I袋银法利市场售价为100元)，因此此农药没有得到有效推广应用。可见，化学防治未能有效控制枇杷根腐病。在枇杷中寻找抗其根腐病的基因，成功培育出抗枇杷根腐病的抗性品种，在短期内难以实现。目前看来，生物防治是一种经济有效地控制枇杷根腐病的方法。木霉是公认的生防因子之一，它在植物中以内生菌的形式广泛存在，能有效防治植物真菌病害。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株能防治枇杷根腐病的木霉。本发明的目的还在于提供一种使用该木霉防治枇杷根腐病的方法。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0007]—株能防治枇杷根腐病的木霉，编号为LY1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2014年6月27日，分类命名为深绿木霉Trichoderma atroviride,保藏号为CGMCC N0.9390。
[0008]该木霉菌落丝状，环形产孢；分生孢子梗大多单侧分枝，分枝角度近似90° ;瓶梗直或弯曲，2-3个呈漩涡状排列，中部膨大，顶端和基部缢缩，7.0?11.0X 3.0?4.0ym;分生孢子绿色、近球形或卵圆形，光滑，2.5?4.0X 2.0?3.0 μ m。菌丝生长适合的培养基为PDA，D-果糖或葡萄糖为碳源，磷酸二氢铵为氮源，温度15?30°C，酸碱度pH3?pH1，光照及湿度不影响其菌丝生长；促进产孢的培养条件为光照，28°C，pH1 ;孢子致死温度为52。。。
[0009]上述木霉对枇杷根腐病病菌具有很强的拮抗效果，可用于防治枇杷根腐病，室内抑制率达88%，并能促进枇杷植株生长。将LYl木霉接种到健康枇杷植株上，对枇杷植株无伤害，相反，能促进枇杷植株生长，即，接种LYl木霉的枇杷植株比未接种的对照叶色浓绿，叶面积明显增大。接种木霉I个月后，能再次从枇杷植株中分离到此木霉菌株。说明此木霉菌株能成功定殖于枇杷植株中，为其有效控制枇杷根腐病提供保障。
[0010]一种使用LYl木霉防治枇杷根腐病的方法，为苗期防治或成株期防治；其中，苗期防治为主，成株期防治为辅。
[0011]苗期防治的方法包括如下步骤:将LYl木霉菌株在固体培养基上培养，用打孔器打取菌饼备用，同时用同一规格的打孔器将枇杷苗主干韧皮部打出孔，去除韧皮部；将上述菌饼放置于除去韧皮部的枇杷主干孔中，用保鲜膜密封保湿。
[0012]成株期防治的方法包括如下步骤:将LYl木霉菌株在液体培养基中培养，用无菌水将菌液稀释，每株枇杷灌根500mL稀释液。
[0013]优选的，所述的苗期防治的方法包括如下步骤:将LYl木霉菌株在PDA培养基上28°C培养5d，用5mm直径的打孔器打取菌饼备用，同时用同一规格的打孔器将枇杷苗主干韧皮部打出孔，去除韧皮部，每株枇杷苗主干打10个孔。将上述菌饼放置于除去韧皮部的枇杷主干孔中，用保鲜膜密封保湿。
[0014]所述的成株期防治的方法包括如下步骤:将LYl木霉菌株在H)培养液中28°C、摇床280r/min培养7d，用无菌水将菌液稀释为75% (含菌液75% )，每株枇杷灌根500mL稀释液。
[0015]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0016]本发明的LYl木霉对枇杷根腐病病菌具有很强的拮抗效果，室内抑制率达88% ；该木霉对枇杷植株无害，能促进枇杷植株生长。
[0017]本发明的LYl木霉能有效防治枇杷根腐病，防治方法简单、不污染环境，为果农挽回经济损失的同时，获得最大的生态效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是接种PDA营养饼和LYl木霉菌饼30d枇杷韧皮部组织上分离的菌株图；a:PDA营养饼；b:LY1木霉菌饼，T是分离出的LYl木霉菌株。
[0019]图2是接种PDA营养饼和LYl木霉菌饼第180d时枇杷植株生长状况图；A (左图):PDA营养饼，B(右图):LY1木霉菌饼。
[0020]图3是LYl木霉菌饼与枇杷根腐病菌饼对峙培养及枇杷根腐病菌饼单独培养生长状况图；A:LY1木霉菌饼与枇杷根腐病菌饼对峙培养生长状况，a是LYl木霉菌株重寄生区域；B:枇杷根腐病菌饼单独培养生长状况。
[0021 ]图4是接种根腐病菌菌饼和同时接种病菌菌饼和LYl木霉菌饼第12d时枇杷植株生长状况图；A:只接种病菌菌饼；B:同时接种病菌菌饼和LYl木霉菌饼。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0023]本发明的LYl木霉在分离枇杷根腐病病原菌的过程中得到，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2014年6月27日，分类命名为深绿木霉Trichoderma atroviride，保藏号为CGMCCN0.9390。
[0024]实施例1
[0025]将LYl木霉菌株接种于预先倒有PDA培养基的直径为90mm的培养皿中央，28°C培养5d，用5_直径的打孔器打取菌饼备用，同时用同一规格的打孔器将枇杷苗主干韧皮部打出孔，去除韧皮部；将上述菌饼放置于除去韧皮部的枇杷主干孔中，用保鲜膜密封保湿。设接种相同直径的PDA营养饼做对照。试验期间做常规肥水管理。接种第30d，用5mm直径的打孔器在接种LYl木霉菌饼的两个接种点之间，取其韧皮部，每株取3块备用。用74%的酒精消毒lmin，0.1 %升汞消毒lmin，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分，接种到PDA平板上，每皿接3块韧皮部。置于培养箱中28°C培养3?5d，观察菌落生长情况。接种PDA营养饼的枇杷植株菌株分离观察方法与之相同。继续培养到第180d，测量叶片长、宽及总叶绿素含量。
[0026]图1是接种PDA营养饼和LYl木霉菌饼30d枇杷韧皮部组织上分离的菌株图，接种PDA营养饼的对照组3块韧皮部中未分离到木霉菌株(图1a)，而接种LYl木霉菌饼的两个接种点之间，其3块韧皮部中2块分离到木霉菌株(图1b)。图2是接种PDA营养饼和LYl木霉菌饼第180d时枇杷植株生长状况图，第180d未接种木霉的植株叶面积和叶绿素含量分别为125.0cm2、0.4191854mg/g.FW，接种木霉的植株叶面积和叶绿素含量分别为163.9cm2,0.4291414mg/g.FW。上述结果说明LYl木霉能促进枇杷植株生长。
[0027]实施例2
[0028]将LYl木霉菌和枇杷根腐病菌菌株(拟盘多毛孢属Pestalot1psis sp.)接种于预先倒有PDA培养基的直径为90mm的培养皿中央，28°C培养5d，用5mm直径的打孔器分别打取同一半径的菌饼，同时接种于预先倒有PDA培养基的直径为90mm培养皿上，两接种点相距45mm，设单独接种枇杷根腐病菌菌饼为对照，28°C培养7d，测量枇杷根腐病菌菌落直径。抑制率计算公式为:
[0029]抑制率/ % = [ (dCK-dB) /dCK] X 100
[0030]式中，dCK表示对照病原菌菌落直径，dB表示处理病原菌菌落直径。
[0031]测量结果dCK = 90mm, dB = 10.8mm,因此抑制率=88% ;同时发现LYl重寄生于枇杷根腐病菌落上(图3)。
[0032]实施例3苗期防治枇杷根腐病的方法
[0033]将LYl木霉菌株和枇杷根腐病菌株接种于预先倒有PDA培养基的直径为90mm的培养皿中央，28°C培养5d,用5mm直径的打孔器打取菌饼备用，同时用同一规格的打孔器将枇杷苗主干韧皮部打出孔，去除韧皮部；将上述菌饼放置于除去韧皮部的枇杷主干孔中，每株接种5个菌饼，在两个接种点之间，用相同的方法接种4块枇杷根腐病菌菌饼，用保鲜膜密封保湿。设只接种5块枇杷根腐病菌菌饼的植株为对照，接种方法均相同。试验期间做常规肥水管理。接种第12d观察发现对照叶片发黄或脱落(图4A)，接种木霉的植株叶片完好无损(图4B)。
[0034]实施例4成株期防治枇杷根腐病的方法
[0035]将LYl木霉菌株接种于预先倒有PDA培养基的直径为90mm的培养皿中央，28°C培养5d，用5mm直径的打孔器打取同一半径的菌饼，共I个菌饼，同时接种于预先装有250mLPD营养液，规格为500mL的锥形瓶中，28°C、摇床280r/min培养7d，用无菌水将菌液稀释为75% (含菌液75% )，每株枇杷灌根500mL稀释液。成株期间做常规肥水管理。
【权利要求】
1.一株能防治枇杷根腐病的木霉，其特征在于:保藏号为CGMCC N0.9390。
2.根据权利要求1所述的木霉，其特征在于:所述的木霉菌丝生长适合的培养基为PDA ;生长条件为温度15?30°C，酸碱度pH3?pH1。
3.根据权利要求1所述的木霉，其特征在于:所述的木霉以D-果糖或葡萄糖为碳源，磷酸二氢铵为氮源。
4.根据权利要求1所述的木霉，其特征在于:所述的木霉促进产孢的培养条件为光照，28°C, ρΗΙΟο
5.权利要求1所述的木霉在防治枇杷根腐病中的应用。
6.权利要求1所述的木霉在促进枇杷植株生长中的应用。
7.一种使用权利要求1所述的木霉防治枇杷根腐病的方法，其特征在于:为苗期防治或成株期防治； 所述的苗期防治的方法包括如下步骤:将权利要求1所述的木霉在固体培养基上培养，用打孔器打取菌饼备用，同时用同一规格的打孔器将枇杷苗主干韧皮部打出孔，去除韧皮部；将上述菌饼放置于除去韧皮部的枇杷主干孔中，用保鲜膜密封保湿； 所述的成株期防治的方法包括如下步骤:将权利要求1所述的木霉在液体培养基中培养，用无菌水将菌液稀释，每株枇杷灌根500mL稀释液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述的固体培养基为PDA培养基；所述的液体培养基为H)培养液。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述的苗期防治的方法包括如下步骤:将权利要求1所述的木霉在PDA培养基上28°C培养5d，用5mm直径的打孔器打取菌饼备用，同时用同一规格的打孔器将枇杷苗主干韧皮部打出孔，去除韧皮部，每株枇杷苗主干打10个孔；将上述菌饼放置于除去韧皮部的枇杷主干孔中，用保鲜膜密封保湿。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述的成株期防治的方法包括如下步骤:将权利要求1所述的木霉在ro培养液中28°C、摇床280r/min培养7d，用无菌水将菌液稀释为75%，每株枇杷灌根500mL稀释液。
【文档编号】A01P3/00GK104293682SQ201410468098
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】鲁海菊, 刘艳红, 陶红征, 沈云玫, 杨建 , 洪亮, 王栋 申请人:红河学院