专利名称：一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法
技术领域：
本发明属于农业生产科技领域，具体的说是一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂 的方法。
背景技术：
大豆根腐病是一种分布广、危害严重、病原菌种类繁多和防治较困难的世界性病 害。大豆根腐病在中国主要分布于北方春大豆和南方黄淮夏大豆生产区，其中尤其以黑龙 江东北部地区发生严重。大豆根腐病主要危害大豆根系、影响作物对水分和养分的吸收。此 病的发生可以使大豆植株的根重、根瘤重、固氮酶活性以及侧根数均受到不同程度的影响。 据调查该病一般减产10-30%，严重时可达60% -90%，甚至绝产，而且使大豆含油量明显 下降。大豆根腐病的病原菌种类繁多，主要为镰刀菌(Fusarium spp.)、立枯丝核菌 (Rhizoctonia Solani)、腐霄菌(Pythium spp.)禾口疫霄菌(Phytophthora spp.)等，其中 镰刀菌为优势菌，病害最为普遍，随种子发芽侵染率逐渐提高，危害大豆时，根部从根尖开 始变色，呈水浸状，主根下半部显现出褐色条纹，以后逐渐扩大，表皮及皮层变黑腐烂，严重 时主根下半部烂掉。叶片由下而上逐渐变黄，植株矮化，结瘤少，严重时植株死亡，危害非常 严重。当地快积水时，腐霉菌和疫霉菌病害较重。目前，对该病的防治，除了一些农耕措施(如与禾本科作物合理轮作，适时晚播、 浅播，选用和培育抗病种等)之外，主要是化学药剂的防治，如多菌灵、福美双、多克福、适 时乐等，药剂拌种虽然可推迟侵染期，但是一般的大豆药剂防治根腐病时间短，药效差，因 为根腐病一般会持续两个月左右，而一般的药剂有效期只有一个月左右，后期病原菌还会 侵染大豆，而且长期使用化学药剂，病原菌会产生抗性变种，使防治难度加大。利用生物制剂来防治根腐病是目前的研究热点，因为生物制剂的针对性强，无污 染，有效期长。利用对病原真菌的拮抗作用筛选生防细菌，是生防菌剂的有效出路，但是生 防菌剂一直存在定植难，活性低，对根部病原菌针对性不强等特点，限制了发展。目前用的 比较好的大豆根腐病生防菌剂，主要是生物制剂埃坶泌(一种放线菌颗粒剂)，防治镰刀菌 和紫青霉菌；还有淡紫拟青霉菌剂其分泌物对镰刀菌有抑制作用，但有效的生防细菌菌 剂还很少报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为取土壤菌悬液，其为田间大豆根际土 壤，分别利用King’ B培养基和80°C水浴IOmin后涂牛肉膏蛋白胨培养基的方法特异性筛 选假单胞菌(Pseudomonas spp.)和芽孢杆菌(Bacillus spp.)，待用；另采集大豆根腐病 病株根，利用马丁培养基分离病原真菌；采用PDA平板牛津杯对峙的方法，将上述特异性筛 选的假单胞菌和芽孢杆菌中复筛出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的菌株，分别发酵处理后复配即可得到防治大豆根腐病的复合菌剂。所述King’B培养基组分为示蛋白胨20g，磷酸二氢钾1. 2g，七水硫酸镁1. 5g，甘 油10ml，琼脂15g，蒸馏水1000ml, pH = 7. 4-7. 6，混合后灭菌，灭菌后加入0. 22um滤膜过 滤除菌的氨苄青霉素，氯霉素和放线菌酮。所述氨苄青霉素用无菌水溶解浓度为40ug/ml ； 氯霉素用95%乙醇溶解浓度为13ug/ml ；放线菌酮用丙酮溶解浓度为lOOug/ml。所述牛肉膏蛋白胨培养基组分为牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸 馏水1000ml，pH = 7. 0-7. 2。土壤悬液在80°C水浴锅中温浴10分钟，再稀释涂平板。土壤 悬液在80°C水浴锅中温浴10分钟，再稀释涂平板。所述的马丁培养基的配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.5g， 0.1 %孟加拉红溶液3. 3ml，琼脂20g，蒸馏水IOOOml，pH自然。灭菌后加入80 %的乳酸2ml。所述采用牛津杯平板对峙的方法中所用的固体PDA培养基配方如下削皮土豆 200g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml，pH自然。土豆切成小块儿，加入蒸馏水煮沸20min，过滤，滤 液加入蔗糖，定容到1000ml，加入20g琼脂，115°C高压灭菌30min。PDA平板牛津杯对峙的方法，在土豆汁固体平板中央接种直径8mm的病原真菌菌 丝块，在距菌丝块3cm的位置放置火焰上灼烧后的牛津杯，或者菌丝块培养1天后，再放置 牛津杯，牛津杯中加入各待用假单胞菌或芽孢杆菌的培养产物，培养2-3天后，检测各菌的 抑菌率。将经复筛出的假单胞菌和芽孢杆菌分别混合发酵，假单胞菌属的混合菌株在未 加抗生素的上述King’ B培养基中发酵培养；芽孢杆菌属的混合菌株在牛肉膏蛋白胨培 养基中进行发酵培养基；待两个属的菌体数量都达到10亿个/ml以上，分别用质量比 2:8-1: 9麦麸和草炭土在40-50°C下吸附风干并粉碎，然后以质量比3 7-5 5的比 例混合，制成固体菌剂；或分别将两个属的发酵菌液都浓缩为原体积的1/2，然后按体积比 3:7-5: 5的比例混合，无菌包装制成液体菌剂。假单胞菌发酵罐的条件为；无菌空气的通气量为1 0.8-1，搅拌速度为180-200 转/min，培养温度为28-30°C，培养时间为20_30h ；而芽孢杆菌的发酵条件为无菌空气 的通气量为1 0.8-1，搅拌速度为180-200转/min，培养温度为28-30°C，培养时间为 40-60h，有利于形成芽孢。本发明所具有的优点1.本发明从原位根际筛选以大豆根际为底物的防治大豆根腐病的降解菌，其在大 豆根际的定植能力较强，能有效保护大豆根际免受病原真菌的侵染。2.本发明根据微生物拮抗的原理，利用抗性微生物来控制根腐病的病原真菌，针 对性强，抗病周期长，而且绿色环保。3.本发明筛选的方法其利用大豆根际生防混合细菌，有效提高生物活性和防治范 围，并且其来源为健康大豆根际，多为大豆益生菌，而且能够在大豆根际有效定殖，增强了 菌剂的利用率。5.假单胞菌能够分泌2，4_ 二乙酰基间苯三酚，吩嗪羧酸，硝吡咯菌素，藤黄绿浓 菌素等抗生素类或其他活性物质，在防治土传真菌病害方面有重要贡献。芽孢杆菌能够分 泌双效菌素等活性物质能有效抑制镰刀菌等病害真菌，所以本发明筛选这两类细菌作为复 合菌剂的菌种，这样既能防治大豆根腐病，又能解决定植问题。以期达到很好的生防根腐病病害的效果。
具体实施例方式实施例1采集田间健康大豆根际土壤(黑龙江省佳木斯市抚远县大豆田)，IOg 土加入90ml 蒸馏水稀释成菌悬液，利用King’B固体培养基，培养基灭菌后加入0. 22um滤膜过滤除菌的 氨苄青霉素(40ug/ml，无菌水溶解)，氯霉素(13ug/ml 95%乙醇溶解)，放线菌酮(IOOug/ ml丙酮溶解)，特异性筛选假单胞菌(Pseudomonas spp.)；上述土样稀释后的菌悬液在80°C水浴锅内温浴lOmin，然后利用牛肉膏蛋白胨固 体培养基筛选芽孢杆菌(Bacillus spp.)。采集田间大豆根腐病病株根(黑龙江省佳木斯市抚远县大豆田)，实验室破碎组 织，用马丁培养基(灭菌后加入2ml乳酸，抑制细菌和放线菌的生长)分离病原真菌主要为 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)禾口立枯丝核菌 (RhizoctoniaSolani)，待用。采用土豆汁(PDA)平板牛津杯对峙的方法，即将上述筛选的病原真菌分别在PDA 固体培养基上接种培养3天后，用灭菌的打孔器在菌丝边缘打出直径8mm的菌丝块，备用； 在新的PDA固体平板中央分别接种菌丝块，培养1天后，在距菌丝块3cm的位置放置牛津杯 (在火焰上灼烧5s左右，再放置)，牛津杯中分别加入各假单胞菌或芽孢杆菌的培养产物， 培养2天后，检测各菌的抑菌率。拟阳性对照的抑菌率为100 %，阴性对照的抑菌率为O，
膨腦的抑菌率、二的菌二 χ蘭筛选出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的36株假单胞菌和21株芽孢杆 菌，假单胞菌和芽孢杆菌分别混合发酵，假单胞菌发酵罐的条件为无菌空气的通气量为 1 0.8，搅拌速度为180转/min，培养温度为28°C，培养时间为30h;而芽孢杆菌的发酵条 件为无菌空气的通气量为1 0.8，搅拌速度为180转/min，培养温度为28°C，培养时间 为60h，显微镜下观察大部分形成芽孢。发酵结束后，两个属的菌体数量都达到10亿个/ml 以上，分别用麦麸和草炭土(质量比2 8)在45°C下吸附风干并粉碎，然后两个属以质量 比3 7的比例混合，制成固体菌剂；或分别将两个属的发酵菌液浓缩为原体积的1/2，然 后按体积比3 7的比例混合，无菌包装制成液体菌剂。实施例2采集田间健康大豆根际土壤(黑龙江省佳木斯市抚远县大豆田)，IOg 土加入90ml 蒸馏水稀释成菌悬液，利用King’B固体培养基，培养基灭菌后加入0. 22um滤膜过滤除菌的 氨苄青霉素(40ug/ml，无菌水溶解)，氯霉素(13ug/ml 95%乙醇溶解)，放线菌酮(IOOug/ ml丙酮溶解)，特异性筛选假单胞菌(Pseudomonas spp)；上述土样稀释后的菌悬液在80°C水浴 锅内温浴lOmin，然后利用牛肉膏蛋白胨固 体培养基筛选芽孢杆菌(Bacillus spp.)。采集田间大豆根腐病病株根(黑龙江省佳木斯市抚远县大豆田)，实验室破碎组织，用马丁培养基(灭菌后加入2ml乳酸，抑制细菌和放线菌的生长)分离病原真菌主要为 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)禾口立枯丝核菌 (RhizoctoniaSolani)，待用。采用土豆汁(PDA)平板牛津杯对峙的方法，即将上述筛选的病原真菌分别在PDA 固体培养基上接种培养3天后，用灭菌的打孔器在菌丝边缘打出直径8mm的菌丝块，备用； 在新的PDA固体平板中央分别接种菌丝块，在距菌丝块3cm的位置放置牛津杯(在火焰上 灼烧5s左右，再放置)，牛津杯中分别加入各假单胞菌或芽孢杆菌的培养产物，培养3天后， 检测各菌的抑菌率。拟阳性对照的抑菌率为100 %，阴性对照的抑菌率为0，
#得抗性菌的抑菌率=二二二纏筛选出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的36株假单胞菌和21株芽孢杆 菌，假单胞菌和芽孢杆菌分别混合发酵，假单胞菌发酵罐的条件为无菌空气的通气量为 1 0.8，搅拌速度为180转/min，培养温度为28°C，培养时间为30h;而芽孢杆菌的发酵条 件为无菌空气的通气量为1 0.8，搅拌速度为180转/min，培养温度为28°C，培养时间为 60h，显微镜小观察大部分形成芽孢。发酵结束后，两个属的菌体数量都达到10亿个/ml以 上，分别用麦麸和草炭土(质量比1 9)在50°C下吸附风干并粉碎，然后以质量比5 5 的比例混合，制成固体菌剂；或分别将两个属的发酵菌液浓缩为原体积的1/2，然后按体积 比5 5的比例混合，无菌包装制成液体菌剂。实施例3采集田间健康大豆根际土壤(黑龙江省佳木斯市抚远县大豆田)，10g土加入90ml 蒸馏水稀释成菌悬液，利用King’B固体培养基，培养基灭菌后加入0. 22um滤膜过滤除菌的 氨苄青霉素(40ug/ml，无菌水溶解)，氯霉素(13ug/ml 95%乙醇溶解)，放线菌酮(lOOug/ ml丙酮溶解)，特异性筛选假单胞菌(Pseudomonas spp.)；上述土样稀释后的菌悬液在80°C水浴锅内温浴lOmin，然后利用牛肉膏蛋白胨固 体培养基筛选芽孢杆菌(Bacillus spp.)。采集田间大豆根腐病病株根(黑龙江省佳木斯市抚远县大豆田)，实验室破碎组 织，用马丁培养基(灭菌后加入2ml乳酸，抑制细菌和放线菌的生长)分离病原真菌主要为 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)禾口立枯丝核菌 (RhizoctoniaSolani)，待用。采用土豆汁(PDA)平板牛津杯对峙的方法，即将上述筛选的病原真菌分别在PDA 固体培养基上接种培养3天后，用灭菌的打孔器在菌丝边缘打出直径8mm的菌丝块，备用； 在新的PDA固体平板中央分别接种菌丝块，培养1天后，在距菌丝块3cm的位置放置牛津杯 (在火焰上灼烧5s左右，再放置)，牛津杯中分别加入各假单胞菌或芽孢杆菌的培养产物， 培养2天后，检测各菌的抑菌率。 拟阳性对照的抑菌率为100 %，阴性对照的抑菌率为0，
腿維菌的抑菌率、二二二 ―。筛选出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的36株假单胞菌和21株芽孢杆 菌，假单胞菌和芽孢杆菌分别混合发酵，假单胞菌发酵罐的条件为无菌空气的通气量为 1 1，搅拌速度为200转/min，培养温度为30°C，培养时间为20h;而芽孢杆菌的发酵条件 为无菌空气的通气量为1 1，搅拌速度为200转/min，培养温度为30°C，培养时间为40h， 显微镜小观察大部分形成芽孢。发酵结束后，两个属的菌体数量达到10亿个/ml以上，分 别用麦麸和草炭土(质量比2 8)在45°C下吸附风干并粉碎，然后以质量比3 7的比例 混合，制成固体菌剂；或分别将两个属的发酵菌液分别浓缩为原体积的1/2，然后按体积比 3 7的比例混合，无菌包装制成液体菌剂。实施例4采集田间健康大豆根际土壤(黑龙江省佳木斯市抚远县大豆田)，10g 土加入90ml 蒸馏水稀释成菌悬液，利用King’B固体培养基，培养基灭菌后加入0. 22um滤膜过滤除菌的 氨苄青霉素(40ug/ml，无菌水溶解)，氯霉素(13ug/ml 95%乙醇溶解)，放线菌酮(lOOug/ ml丙酮溶解)，特异性筛选假单胞菌(Pseudomonas spp.)；上述土样稀释后的菌悬液在80°C水浴锅内温浴lOmin，然后利用牛肉膏蛋白胨固 体培养基筛选芽孢杆菌(Bacillus spp.)。采集田间大豆根腐病病株根(黑龙江省佳木斯市抚远县大豆田)，实验室破碎组 织，用马丁培养基(灭菌后加入2ml乳酸，抑制细菌和放线菌的生长)分离病原真菌主要为 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)禾口立枯丝核菌 (RhizoctoniaSolani)，待用。采用土豆汁(PDA)平板牛津杯对峙的方法，即将上述筛选的病原真菌分别在PDA 固体培养基上接种培养3天后，用灭菌的打孔器在菌丝边缘打出直径8mm的菌丝块，备用； 在新的PDA固体平板中央分别接种菌丝块，在距菌丝块3cm的位置放置牛津杯(在火焰上 灼烧5s左右，再放置)，牛津杯中分别加入各假单胞菌或芽孢杆菌的培养产物，培养3天后， 检测各菌的抑菌率。拟阳性对照的抑菌率为100 %，阴性对照的抑菌率为0，
羅性菌的抑菌率=二二二筛选出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的36株假单胞菌和21株芽孢杆 菌，假单胞菌和芽孢杆菌分别混合发酵，假单胞菌发酵罐的条件为无菌空气的通气量为 1 1，搅拌速度为200转/min，培养温度为30°C，培养时间为20h;而芽孢杆菌的发酵条件 为无菌空气的通气量为1 1，搅拌速度为200转/min，培养温度为30°C，培养时间为40h， 显微镜下观察大部分形成芽孢。发酵结束后，两个属的菌体数量都达到10亿个/ml以上， 分别用麦麸和草炭土(质量比1 9)在50°C下吸附风干并粉碎，然后以质量比5 5的 比例混合，制成固体菌剂；或分别将两个属的发酵菌液浓缩为原体积的1/2，然后按体积比 5 5的比例混合，无菌包装制成液体菌剂。
权利要求
一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于取土壤菌悬液，分别利用King’B培养基和80℃水浴10min后涂牛肉膏蛋白胨培养基的方法特异性筛选假单胞菌(Pseudomonas spp.)和芽孢杆菌(Bacillus spp.)，待用；另采集大豆根腐病病株根，利用马丁培养基分离病原真菌；采用PDA平板牛津杯对峙的方法，将上述特异性筛选的假单胞菌和芽孢杆菌中复筛出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的菌株，分别发酵处理后复配即可得到防治大豆根腐病的复合菌剂。
2.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于所述 King’ B培养基组分为示蛋白胨20g，磷酸二氢钾1. 2g，七水硫酸镁1. 5g，甘油10ml，琼脂 15g，蒸馏水1000ml，pH = 7. 4-7. 6，混合后灭菌，灭菌后加入0. 22um滤膜过滤除菌的氨苄 青霉素，氯霉素和放线菌酮。
3.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于所述氨 苄青霉素用无菌水溶解浓度为40ug/ml ；氯霉素用95%乙醇溶解浓度为13ug/ml ；放线菌酮 用丙酮溶解浓度为100ug/ml。
4.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于所述牛 肉膏蛋白胨培养基组分为牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH =7. 0-7. 2。土壤悬液在80°C水浴锅中温浴10分钟，再稀释涂平板。
5.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于所述的 马丁培养基的配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. 5g，0. 孟加拉红 溶液3. 3ml，琼脂20g,蒸馏水IOOOml，pH自然。灭菌后加入80 %的乳酸2ml。
6.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于所述采 用牛津杯平板对峙的方法中所用的固体PDA培养基配方如下削皮土豆200g，蔗糖20g，蒸 馏水1000ml，pH自然。土豆切成小块儿，加入蒸馏水煮沸20min，过滤，滤液加入蔗糖，定容 到1000ml，加入20g琼脂，115°C高压灭菌30min。
7.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于PDA平板 牛津杯对峙的方法，在土豆汁固体平板中央接种直径8mm的病原真菌菌丝块，在距菌丝块 3cm的位置放置火焰上灼烧后的牛津杯，或者菌丝块培养1天后，再放置牛津杯，牛津杯中 加入各待用假单胞菌或芽孢杆菌的培养产物，培养2-3天后，检测各菌的抑菌率。
8.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于将经复 筛出的假单胞菌和芽孢杆菌分别混合发酵，假单胞菌属的混合菌株在未加抗生素的上述 King’ B培养基中发酵培养；芽孢杆菌属的混合菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中进行发酵培 养基；待两个属的菌体数量都达到10亿个/ml以上，分别用质量比2 8-1 9麦麸和草 炭土在40-50°C下吸附风干并粉碎，然后以质量比3 7-5 5的比例混合，制成固体菌剂； 或分别将两个属的发酵菌液都浓缩为原体积的1/2，然后按体积比3 7-5 5的比例混 合，无菌包装制成液体菌剂。
9.根据权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于假单 胞菌发酵罐的条件为；无菌空气的通气量为1 0.8-1，搅拌速度为180-200转/min，培 养温度为28-30°C，培养时间为20-30h ；而芽孢杆菌的发酵条件为无菌空气的通气量为 1 0. 8-1，搅拌速度为180-200转/min，培养温度为28_30°C，培养时间为40_60h，有利于 形成芽孢。
全文摘要
本发明属于农业生产科技领域，具体地说是一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法。采集田间健康大豆根际土壤，分别利用King’B培养基和80℃水浴10min后涂牛肉膏蛋白胨培养基的方法特异性筛选假单胞菌和芽孢杆菌，待用；采集田间大豆根腐病病株根，利用马丁培养基分离病原真菌；采用PDA平板牛津杯对峙的方法，从待用的假单胞菌和芽孢杆菌中复筛出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的菌株，分别发酵处理后按比例复配，即可得到防治大豆根腐病的复合菌剂。本发明的筛选方法，利用大豆根际生防混合细菌，能够有效提高生物活性和防治范围，并且其来源为健康大豆根际，多为大豆益生菌，且能够在大豆根际有效定殖，增强了菌剂的利用率。
文档编号A01N63/04GK101843260SQ20091001087
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者张惠文, 张晓黎, 李新宇, 李旭, 苏振成, 阮晓东 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所