一种单宁酶高产菌株及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种单宁酶高产菌株及其制备方法。在以单宁酸为唯一碳源的培养基中对接入的五倍子中的微生物进行筛选，共分离到15株产单宁酶的纯种菌株，经摇瓶培养，最终确定一株产单宁酶活力最高的菌株N5，酶活力为45.56U/mL。经菌种鉴定，确定菌株N5为黑曲霉( Aspergilluse niger )。该菌株保藏号为CCTCC NO：M2014051。CCTCC NO:M20140512014.02.28
【专利说明】一种单宁酶高产菌株及其制备方法
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明涉及微生物【技术领域】，具体涉及微生物筛选、菌种鉴定及发酵产酶相关领 域，特别是提供了一种单宁酶高产菌株及其制备方法。
【背景技术】
[0003] 单宁酶（Tannase，E.C. 3. 1. 1.20)，是一种广泛存在于微生物及植物中的诱导 酶，尤其是在丝状真菌中，以单宁酸、五倍子等作为诱导物时可大量产生，属于细胞膜结合 酶，可分泌到胞外。单宁酶可专一性水解水解型单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸、 葡萄糖及相应的醇类等物质。
[0004] 单宁酶目前已应用于饮料、酿酒、食品、医药、化工、制革及化妆品等多个领域，尤 其在制备没食子酸、没食子酸丙酯及处理茶汁"冷后浑"和啤酒沉淀等方面应用广泛。但目 前单宁酶生产效率不高，且市场价格非常昂贵，这阻碍了单宁酶的进一步应用。
[0005] 经文献查新得知，目前生产单宁酶的主要方法还是通过微生物发酵制备，尤其对 曲霉属、青霉属、根霉属的真菌及乳杆菌等细菌发酵生产单宁酶的报道较多。但目前存在着 这些微生物大多产酶不高，尤其是国内对单宁酶高产菌株缺乏自主知识产权等问题。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是针对以上存在的问题，提供一种单宁酶高产菌株及其制备方法，从 而提高单宁酶发酵产量，解决当前单宁酶生产效率不高的问题。
[0007] 本发明筛选出的一株单宁酶高产菌株命名为N5,经菌种鉴定为黑曲霉 /?i职r)，保藏号：CCTCCNO:M2014051，保藏时间：2014年2月28日，保藏 单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC)。
[0008] 本发明菌株的制备方法包括以下步骤： (1) 用10mL无菌水冲洗5g五倍子，将冲洗液加入到含90mL无菌水的锥形瓶中，摇 匀，即为KT1的菌溶液，梯度稀释至KTltl,各梯度于筛选培养基上涂平板3个，30 °C培养48 h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落（共15个，编号N1-N15)分别接于PDA(马铃薯 琼脂培养基）斜面活化72h。所述筛选培养基由以下组份配制而成：磷酸二氢钾4.38g， 硫酸铵8.76g，硫酸镁0.88g，氯化钙0.088g，氯化锰0.018g，钥酸钠0.0088g，硫酸铁 0. 12g，琼脂30g，单宁酸10g，用蒸馏水水溶解后定容至IL; (2) 活化72h后的PDA(马铃薯琼脂培养基）斜面上的孢子，用蒸馏水配制成IO6个/ mL的孢子悬浮液，然后接种ImL于30mL发酵培养基中，30 °C，120r/min振荡培养72h， 提取单宁酶并测其活力，通过酶活力比较确定最优产酶菌株。结果表明，菌株N5产单宁酶 活力最高，为45.56U/mL。所述发酵培养基由以下组份配制而成：单宁酸20g，蔗糖1(^，硝 酸钠3g，磷酸氢二钾Ig,氯化钾0. 5g，硫酸铁0.Olg,硫酸镁0. 5g，用蒸馈水溶解后定容至1 L〇
[0009]步骤（2)中，所述单宁酶提取酶活力测定方法，包括以下步骤： a、发酵悬浮液经抽滤后得到菌丝体，蒸馏水洗至pH值中性，于冰箱中4°C预冷，将菌 丝体、石英砂、柠檬酸缓冲液按体积比1:1:4混合，在冰浴下研磨成浆，4 °C下10000r/min 离心30min，取上清液，用柠檬酸缓冲液定容至10mL，即得单宁酶酶液。
[0010] 所述柠檬酸缓冲液配制方法为：准确称取柠檬酸21.01g，加水定容至1000mL，作 为A液；准确称取柠檬酸钠29. 41g，定容至1000mL，作为B液，将A液与B液按1:2比例混 合，再用A液和B液调混合液的pH值至5. 0,即得柠檬酸缓冲液。
[0011] b、准备1支对照管、1支空白管和3支平行测定管，先在每支试管中各加入ImL单 宁酶酶液，45 °C水浴预热10min，然后在测定管中各加入ImL没食子酸丙酯溶液，在空白 管中加入ImL柠檬酸缓冲液，在对照管中加入0.6mL乙醇，反应20min后，分别在测定管 和空白管中加入4mL乙醇终止反应，在对照管中加入ImL没食子酸丙酯溶液。待反应液 冷却后，用柠檬酸缓冲液稀释9倍，测定270nm下吸光值。
[0012] 所述没食子酸丙酯溶液配制方法为：准确称取0. 2122g没食子酸丙酯，先加3滴 无水乙醇促溶,再用柠檬酸缓冲液定容至500mL。
[0013] C、用柠檬酸缓冲液分别配制20、40、60、80、100μ--οΙ/L的没食子酸丙酯溶液，测 定其270nm下的吸光值，绘制回归曲线，根据该曲线的回归方程，对照管没食子酸丙酯浓度 应为93. 343As-l. 6626,测定管没食子酸丙酯浓度则为93. 343AM -1. 6626,按下列公式计 算酶活力：
【权利要求】
1. 一种单宁酶高产菌株，命名为N5,经菌种鉴定为黑曲霉，保藏号：CCTCC NO:M 2014051，保藏时间：2014年2月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
2. -种单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 用10 mL无菌水冲洗5 g五倍子，将冲洗液加入到含90 mL无菌水的锥形瓶中，摇 匀，即为KT1的菌溶液，梯度稀释至KTltl,各梯度于筛选培养基上涂平板3个，30 °C培养48 h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落，分别接于马铃薯琼脂培养基斜面活化72 h，所 述筛选培养基由以下组份配制而成：磷酸二氢钾4.38 g，硫酸铵8.76 g，硫酸镁0.88 g，氯 化钙0.088 g，氯化锰0.018g，钥酸钠0.0088 g，硫酸铁0.12 g，琼脂30 g和单宁酸10 g， 用蒸馈水水溶解后定容至I L ; (2) 活化72 h后的马铃薯琼脂培养基斜面上的孢子，用蒸馏水配制成IO6个/mL的孢 子悬浮液，然后接种I mL于30 mL发酵培养基中，30 °C，120 r/min振荡培养72 h，提取单 宁酶并测其活力，通过酶活力比较确定最优产酶菌株，所述发酵培养基由以下组份配制而 成：单宁酸20g，蔗糖10g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾lg，氯化钾0. 5g，硫酸铁0. Olg和硫酸镁 〇. 5g，用蒸馏水溶解后定容至I L。
3. 根据权利要求2所述的单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，所述 单宁酶提取酶活力测定方法，包括以下步骤： a、 发酵悬浮液经抽滤后得到菌丝体，蒸馏水洗至pH值中性，于冰箱中4 °C预冷，将菌 丝体、石英砂、柠檬酸缓冲液按体积比1:1:4混合，在冰浴下研磨成浆，4 °C下10000 r/min 离心30 min，取上清液，用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，即得单宁酶酶液； b、 准备1支对照管、1支空白管和3支平行测定管，先在每支试管中各加入I mL单宁 酶酶液，45 °C水浴预热10 min，然后在测定管中各加入I mL没食子酸丙酯溶液，在空白管 中加入I mL柠檬酸缓冲液，在对照管中加入0.6 mL乙醇，反应20 min后，分别在测定管和 空白管中加入4 mL乙醇终止反应，在对照管中加入I mL没食子酸丙酯溶液，待反应液冷却 后，用柠檬酸缓冲液稀释9倍，测定270 nm下吸光值； c、 用柠檬酸缓冲液分别配制20、40、60、80、100 μπιοΙ/L的没食子酸丙酯溶液，测定其
270 nm下的吸光值，绘制回归曲线，根据该曲线回归方程，对照管没食子酸丙酯浓度应为 93. 343六#-1_阳州J丨丨帘替沿含罕酿而酿浓麼抓丨为H 描：下功KA=Ff计算酶 活力： 注：式中，4?和七《分别表示酶活力测定时对照管和测定管溶液的吸光度值。
4. 根据权利要求3所述的单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述柠 檬酸缓冲液配制方法为：准确称取柠檬酸21. 01 g，加水定容至1000 mL，作为A液；准确称 取柠檬酸钠29. 41g，定容至1000 mL，作为B液，将A液与B液按1:2比例混合，再用A液和 B液调混合液的pH值至5. 0,即得柠檬酸缓冲液。
5. 根据权利要求3所述的单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述没 食子酸丙酯溶液配制方法为：准确称取0.2122 g没食子酸丙酯，先加3滴无水乙醇促溶，再 用柠檬酸缓冲液定容至500 mL。
【文档编号】C12N9/18GK104263650SQ201410121620
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2013年4月28日
【发明者】曹庸, 张帅, 林健辉, 朱华伟, 农嘉仪 申请人:曹庸