一种角质酶及其制备方法与生产专用菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种角质酶及其制备方法与生产专用菌株。本发明所提供的角质酶生产专用菌株为太瑞斯梭孢壳（Thielavia?terrestris）CAU709，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC?No.6233。本发明提供的所述太瑞斯梭孢壳（Thielavia?terrestris）CAU709?CGMCC?No.6233具有高产角质酶的能力，通过硫酸铵沉淀、弱阳离子层析和强阴离子层析得到10%回收率的高纯度角质酶。热稳定性和pH稳定性分析表明：该角质酶在65℃以下具有很好的热稳定性并且在较宽范围的pH范围具有很好的稳定性，具有较好的工业应用前景。合成树脂的降解分析表明该酶可以降解PET、PBS和PCL，在治理生活垃圾的污染方面具有广阔应用前景。
【专利说明】一种角质酶及其制备方法与生产专用菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品生物【技术领域】，尤其涉及一种角质酶及其制备方法与生产专用菌株。
【背景技术】
[0002]角质酶[EC.3.1.1.74]是一种可以降解角质并释放脂肪酸单体的水解酶，是α / β水解酶家族中分子量较小的成员(Holmquist, Μ., 2000.Alpha/Beta-hydrolasefold enzymes:structures，functions and mechanisms.Curr.Protein.Pept.Sc1.1，209-235)。角质酶因其在制药、食品、肽合成等工业领域具有巨大的应用前景而受到广泛关注(Pio，T.F.，Macedo，G.A.，2007.0ptimiaing the productionof cutinase by Fusarium oxysporum using response surface methodology.Enzyme.Microb.Technol.41，613-619)。 自 Purdy 等人(Purdy，R.Ε.，Kolattukudy，P.E.，1975.Hydrolysis of plant cuticle by plant pathogens.Properties ofcutinase I，cutinase II，and a nonspecific esterase isolated from Fusariumsolani pis1.Biochemistry.14, 2832-2840)首次从 Fusarium solani pisi 分离出角质酶以来，目前已经发现有十多个属的真菌或细菌可以产角质酶，如高温单胞菌属(Chen, S.，Tong, X.，Woodard, R.W.，Duj G.，Wuj J.，Chen, J.，2008.1dentification andcharacterization of bacterial cutinase.J.Biol.Chem.283，25854-25862)、假单胞菌属(Sebastian,J.，Kolattukudy, P.E.，1988.Purification and characterization ofcutinase from a fluorescent Pseudomonas putida bacterial strain isolated fromphyllosphere.Arch.Biochem.Biophys.263，77-85)、链霉菌属(Lin, T.S.，Kolattukudy,P.E.，1980.Structural studies on cutinase, a glycoprotein containing novel aminoacids and glucuronic acid amide at the N terminus.Eur.J.Biochem.106，341-351)、炭疽菌属(Chen, Z.，Franco, C.F.，Baptistaj R.P.，2007.Purification and identificationof cutinases from Colletotrichum kahawae and Colletotrichum gloeosporioides.App1.Microbiol.Biotechnol.73，1306-1313)和德刀菌属(Purdy, R.E.，Kolattukudy,P.E., 1975.Hydrolysis of plant cuticle by plant pathogens.Properties of cutinaseI，cutinase II，and a nonspecific esterase isolated from Fusarium solani pis1.Biochemistry.14，2832-2840)等微生物中的角质酶也已经得到分离和鉴定。角质酶既可以水解水溶性酯又可以水解水不溶性的甘油三酯，因此被认为是介于羧酸酯酶和脂肪酶的—种酶(Sulaiman，S.，Yamatoj S.，Kanayaj E.，Jaekimj J.，Kogaj Y.，Takanoj K.，Kanayaj S.，2012.1solation of a novel cutinase homolog with polyethylene terephthalatedegrading activity from leaf-branch compost using a metagenomic approach.Appl Environ.Microb 78，1556-1562)。正是由于角质酶这一广泛的底物特性，它可广泛应用于食品、制药以及化学工业中，并且在某些领域中比羧酸酯酶和脂肪酶更具有优势。比如在奶制品工业中角质酶可以用来水解脂肪以生产低脂奶制品；传统加酶洗衣粉中添加脂肪酶可以提高去油污能力，而角质酶在水解酯类物质时不像脂肪酶需要钙离子的参与(Carvalho, C.M.L., Aries-Barros, M.R., and Cabral, J.M.S., 1999.Curinases: frommolecular level to bioprocess development.Biotechnol.Bioeng.26, 442-458),所以角质酶在生产加酶洗衣粉中更具有优势；在食品工业的香料生产中，角质酶可以被用来催化合成短链脂肪酸酯；利用动物或植物油脂与甲醇反应可以制备生物柴油，角质酶可以水解水溶性和乳化的甘油三酯所以它在生产生物柴油方面具有很大的应用前 景(Dutta, K., Sen, S., Veeranki, V.D., 2009.Production, characterization andopplications of microbial cutinases.Process.Biochem.44, 127-134)；在生物降解方面，角质酶可以降解一些有毒物质比如杀虫剂马拉松，也可以降解生活及工业垃圾比如聚合树月旨 PET (Polyethylene terephthalat)、PCL (polycaprolactone)> PAN(Polyacrylonitrile)> PBS (Poly-(butylenes succinate))和尼龙 6.6 等。因此角质酶在现代食品工业以及医药工业等领域中占有重要的地位，具有广阔的应用前景。
[0003]目前，世界各国都致力于开发多功能角质酶，日本在角质酶降解合成树脂以治理生活垃圾污染方面研究的较为深入。我国人口众多，能源紧缺和生活垃圾处理问题无疑重大且亟待解决。利用角质酶来制备生物柴油以开发新能源可以有效缓解能源紧缺的现状，通过角质酶降解生活垃圾中的塑料有望成为治理生活垃圾污染的重要途径。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一种生产角质酶的专用菌株。
[0005]本发明所提供的生产角质酶的专用菌株具体为太瑞斯梭孢壳(Thielaviaterrestris) CAU709。该菌已于2012年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06 110:，地址为:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC N0.6233。
[0006]所述太瑞斯梭抱壳(Thielaviaterrestris) CAU709 CGMCC N0.6233 菌落铺展生长，白色，最后菌落中央变成粉红色，菌落背面有红棕色色素产生(图1A)。采用显微镜观察，发现菌丝透明，从顶端到基部依次形成紧密、规则的隔膜，有分化的分生孢子梗，分生孢子梗有隔膜，分生孢子相互连接呈链状或聚成球状，分生孢子无色至淡黄色，呈鸭梨状(图1B)。该菌最适生长温度为45°C。其18S rDNA序列如序列表中序列I所示。
[0007]所述太瑞斯梭抱壳(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233在制备角质酶中的应用也属于本发明的保护范围。
[0008]本发明的再一个目的是提供一种利用所述太瑞斯梭孢壳(Thielaviaterrestris) CAU709 CGMCC N0.6233 制备角质酶的方法。
[0009]该方法具体包括如下步骤:发酵培养所述太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)CAU709 CGMCC N0.6233，收集发酵产物，即获得角质酶。
[0010]在上述方法中，所述发酵培养的温度可为35°C -55°C，所述发酵培养的时间可为2-6天，所述发酵培养的方式可为旋转震荡培养。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的温度具体为50°C，所述发酵培养的时间具体为3天。
[0011]所述旋转震荡培养的转速可为150-250转/分钟，具体如200转/分钟；旋转半径可为20-30mm,具体如26mm。[0012]在上述方法中，所述发酵培养的培养基中含有小麦麸皮、橄榄油、胰蛋白胨、KH2PO4' MgSO4.H20、CaCl2' FeSO4.H2O 和吐温 80 ；
[0013]所述小麦麸皮在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有2_3g所述小麦麸皮，所述橄榄油在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.5-1.5g所述橄榄油，所述胰蛋白胨在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.5-1.5g所述胰蛋白胨，所述KH2PO4在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.1-0.2g所述KH2PO4，所述MgSO4.Η20在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.01-0.1g所述MgSO4.Η20，所述CaCl2在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.01-0.05g所述CaCl2，所述FeSO4.Η20在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0-0.005g所述FeSO4.Η20，所述吐温80在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0-0.5g所述吐温80，所述培养基的pH为6.0-7.0。 [0014]在本发明的一个实施例中，所述培养基的配方具体如下:小麦麸皮25g，橄榄油10g，胰蛋白胨 10g, KH2PO4 1.5g，MgSO4.H2O 0.5g，CaCl2 0.2g，FeSO4.H2O 0.01g，吐温 80
1.0g,定容至 1L, pH6.5。IX IO5Pa 下湿热灭菌 20min。
[0015]本发明的另一个目的是提供一种角质酶。
[0016]本发明所提供的角质酶具有序列表中序列2-序列6所示的氨基酸序列。
[0017]所述角质酶可由所述太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris) CAU709CGMCCN0.6233分泌得到。
[0018]所述太瑞斯梭抱壳(Thielaviaterrestris) CAU709CGMCC N0.6233 在如下 a)和
b)中的应用也属于本发明的保护范围:
[0019]a)降解角质；
[0020]b)降解树脂，特别是合成树脂。
[0021]在上述应用中，所述树脂具体可为合成树脂中的聚己内酯(PCL)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚丁二酸丁二醇酯(PBS)中的至少一种。
[0022]在本发明中，所述角质具体为角质纤维。
[0023]本发明提供的所述太瑞斯梭抱壳(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233具有高产角质酶的能力，通过硫酸铵沉淀、弱阳离子层析和强阴离子层析得到10%回收率的高纯度角质酶。有机溶剂稳定性分析表明该角质酶在多种有机溶剂中非常稳定，可以用于非水反应体系中制备生物柴油，具有较好的工业应用前景。合成树脂的降解分析表明该酶可以降解PET、PBS和PCL，在治理生活垃圾的污染方面具有广阔应用前景。
[0024]保藏说明
[0025]菌种名称:太瑞斯梭孢壳
[0026]拉丁名:(Thielaviaterrestris)
[0027]菌株编号:CAU709
[0028]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0029]保藏机构简称:CGMCC
[0030]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0031]保藏日期:2012年6月18日
[0032]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.6233【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为菌株CAU709菌落形态及光学显微镜下产孢形态图。其中，A为菌株CAU709菌落形态图为菌株CAU709光学显微镜下产孢形态图。
[0034]图2 为太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)CAU709CGMCC N0.6233 产角质酶的
产酶历程。
[0035]图3 为太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)CAU709CGMCC N0.6233 产角质酶的电泳图及酶谱。其中，泳道M为低分子量标准蛋白质Marker，泳道I为纯化产物，泳道标记
2、3分别为脂肪酶酶谱和羧酸酯酶酶谱。
[0036]图4为所纯化角质酶的最适pH。其中，?表示甘氨酸/盐酸(pH 2.5-3.5);□表示柠檬酸/柠檬酸钠(pH 3.0-6.0) ;●表示MES缓冲液(pH 5.5-6.5) ;实心方块表示磷酸氢二钠/磷酸二氢钠(pH 6.0-8.0);〇表不Tris-HCl (pH 7.5-9.0) ;▲表不甘氨酸/氢氧化钠(pH8.6-10.6)。
[0037]图5为所纯化角质酶的pH稳定性。其中，?表示甘氨酸/盐酸(pH 2.5-3.5);口表不柠檬酸/柠檬酸钠(pH 3.0-6.0) ;●表不MES缓冲液(pH 5.5-6.5) ;实心方块表不磷酸氢二钠/磷酸二氢钠(pH 6.0-8.0);〇表不Tris-HCl (pH 7.5-9.0);▲表不甘氨酸/氢氧化钠(pH8.6-10.6)。
[0038]图6为所纯化角质酶的最适温度。
[0039]图7为所纯化角质酶的温度稳定性。
[0040]图8为所纯化角质酶在0_24h内降解PET、PBS和PCL的进程图。其中，实心方块表示PCL ；▲ PET ; ?表示 PBS。
[0041]图9为所纯化角质酶在0_36h内降解PBS颗粒的进程图。其中，标号1_8的试管分别为角质酶降解IOOmg PBS颗粒0h，6h，12h，18h，24h，30h, 36h，48h后的情况，标号为9的试管为没有添加角质酶的PBS颗粒保温48h的情况。
[0042]图10为所纯化角质酶降解PBS后，材料表面形状的变化。其中，A为PBS颗粒降解前放大25倍的扫描电镜结果，B为PBS颗粒降解前放大500倍的扫描电镜结果，C为PBS颗粒降解前放大1000倍的扫描电镜结果，D为PBS颗粒降解前放大5000倍的扫描电镜结果，E为PBS颗粒降解后放大25倍的扫描电镜结果，F为PBS颗粒降解后放大500倍的扫描电镜结果，G为PBS颗粒降解后放大1000倍的扫描电镜结果，H为PBS颗粒降解后放大5000倍的扫描电镜结果。
【具体实施方式】
[0043]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]下述实施例所述引物的合成及测序工作均由上海生工生物工程有限公司(北京公司)完成。
[0046]下述实施例的主要原料及试剂:对硝基苯丁酸酯、丁酸-4-甲基伞形酮、乙酸-1-萘酯、快红染料和罗丹明B均购自Sigma公司；胰蛋白胨购自英国Oxoid公司；琼脂购自北京康明威培养基技术有限责任公司；K2HP04和MgSO4.7H20购自北京化工厂；PBS由安徽安庆和兴化工有限责任公司馈赠；PET购自于天津顶津饮品有限公司。
[0047]下述实施例中所涉及的50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0)的配方如下:分别配制50mM的柠檬酸三钠溶液和50mM的柠檬酸氢二钠溶液，然后将这两种溶液以合适的体积比混合至混合溶液的pH为4.0。
[0048]实施例1、菌株的分离和鉴定
[0049]一、菌株的分离
[0050]富集培养基:橄榄油20g, (NH4)2SO4 3.0g, K2HPO4 1.0g, MgSO4.7H20 0.5g，琼脂20g,卡那霉素50mg,青霉素G钠盐50mg,定容至1L,调节pH至7.0。IX IO5Pa下湿热灭菌20min。 [0051]分离培养基:200g新鲜土豆沸水煮15min，纱布过滤取土豆汁，加入15g琼脂和20g葡萄糖,定容至1L。
[0052]初筛培养基:橄榄油20g，胰蛋白胨 10g，K2HPO4 1.0g，MgSO4.7Η20 0.5g，琼脂 20g，定容至1L，调节pH至7.0。1\10午&下湿热灭菌2011^11。灭菌后冷却至60°C，往培养基中加入事先用无菌过滤膜(0.22 μ m)除菌的IOmL浓度为1% (w/v)罗丹明B水溶液。
[0053]发酵培养基:小麦麸皮25g，橄榄油10g，胰蛋白胨10g, KH2PO4 1.5g，MgSO4.H2O0.5g, CaCl2 0.2g，FeSO4.H2O 0.01g，吐温 80 1.0g，定容至 1L。I X IO5Pa 下湿热灭菌 20min，pH 6.5。
[0054]取采自中国北京市区生活垃圾中的新鲜土样0.5g至IOmL富集培养基中富集。富集条件为:50°C，200rpm，培养72h。富集三次后将富集培养基中的菌丝体挑至分离培养基平板上划线分离，在50°C恒温培养箱中培养。待分离培养基中有菌落长出，将菌株接种到初筛培养基中。初筛平板中，将在302nm紫外灯照射下菌落周围有黄色荧光圈的菌株，接种到发酵培养基中培养。培养条件为:50°C，200rpm旋转震荡培养，培养72h。发酵结束后取ImL发酵液于1.5mL离心管中，离心(10000 X g，IOmin)，取离心后的上清液按照如下方法测定角质酶酶活力，将其中酶活力较高的一株菌编号为CAU709。
[0055]酶活力测定方法:角质酶活力测定方法参照Sumby等人(Sumby,K.M.，Matthessj A.H.，Grbinj P.R.，Jiranekj V.，2009.Cloning and characterizationof an intracellular esterase from the wine-associated lactic acid bacteriumOenococcus oen1.Appl.Environ.Microb.75, 6729-6735)的方法:将 50 μ L20mM 对硝基苯丁酸酯的异丙醇溶液加入到400uL50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0)中，在50°C水浴中预热3min,加入50 μ L稀释至合适倍数的所述上清液反应lOmin。反应完毕后加入40C 500 μ L300mM磷酸缓冲液(pH 7.0)并在冰水浴中冷却2min。最后在410nm处测量吸光值，再根据利用对硝基苯酚(410nm具有最大吸收波长)标准品在410nm下的制作的标准曲线，计算出酶反应后生成的对硝基苯酚的量。酶活力单位(U)定义为在以上条件下，每分钟反应生成I μ mo I对硝基苯酹所需要的酶量。
[0056]二、菌株的鉴定
[0057]经鉴定，证实本发明得到的菌株CAU709为太瑞斯梭孢壳(Thielaviaterrestris)。本发明的菌株太瑞斯梭抱壳(Thielavia terrestris)CAU709,已于2012年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCN0.6233。以下详述其形态学鉴定和18S rDNA鉴定。
[0058]1、形态学观察
[0059]将步骤一所得菌株CAU709在PDA平板培养基上培育，观察菌株生长情况如下:生长良好，最适生长温度为45°C。菌落铺展生长，白色，最后菌落中央变成粉红色，菌落背面有红棕色色素产生(图1中A)。采用显微镜观察，发现菌丝透明，从顶端到基部依次形成紧密、规则的隔膜，有分化的分生孢子梗，分生孢子梗有隔膜，分生孢子相互连接呈链状或聚成球状，分生孢子无色至淡黄色，呈鸭梨状(图1中B)。
[0060]2、18S rDNA 鉴定
[0061]使用18S rDNA 通用引物 NSl:GTAGTCATATGCTTGTCTC, NS8:TCCGCAGGTTCACCTACGGA,以菌株CAU709的总DNA为模板，PCR扩增18SrDNA序列。目标片段经凝胶回收后测序。测序获得可靠序列1659bp (序列I)。将测序获得的基因序列在NCBI数据库中进行比对。
[0062]实施例2、太瑞斯梭孢壳CAU709在制备角质酶中的应用
[0063]一、角质酶的获得
[0064]1、发酵生产角质酶
[0065]将实施例1 得到的太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)CAU709CGMCC N0.6233进行液体发酵培养，并对发酵培养基做单因素优化，试验表明最佳产酶条件为:2.5%小麦麸皮，1%橄榄油，1%胰 蛋白胨，0.15%ΚΗ2Ρ04，0.05%MgS04.Η20，0.02%CaCl2,0.001%FeS04.Η20，0.1%吐温80(上述各组分的浓度均为质量体积百分含量，即％表示g/100ml)，初始pH 6.5。
[0066]将所述太瑞斯梭抱壳(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233接种于上述优化后发酵培养基中。接种方法为:将该菌在PDA培养基上于45°C条件下培养3天，之后在平板培养基中切取一块边长为Icm的长有菌丝体的培养基，接至含有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在50°C条件下，200rpm旋转震荡培养(旋转半径为26mm)，每隔24h取适量发酵液，离心(10000 X g，IOmin),离心后的上清液按照实施例1所述方法测定其酶活力。
[0067]结果表明，培养到第4天时，发酵液中酶的酶活力最高，达到90U/mL (图2)。
[0068]2、角质酶的鉴定
[0069]按照步骤I所述，将所述太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris) CAU709CGMCCN0.6233接种于优化后发酵培养基中进行培养，培养3天后，离心(10000 X g，IOmin)收集含有角质酶的发酵上清液。并按照如下方法对发酵上清液进行纯化，获得纯度较高的角质酶。
[0070]I)硫酸铵沉淀
[0071]向发酵上清液中缓慢加入80%饱和度的硫酸铵粉末，冰水浴中搅拌lh，然后1000OXg冷冻离心lOmin，收集沉淀，将沉淀用少量20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液溶解，得到硫酸铵沉淀产物。
[0072]2) CM-Separose 柱纯化
[0073]将上述得到的硫酸铵沉淀产物用20mM pH 4.5醋酸缓冲液(缓冲液A)透析16h，过CM-Separose弱阳离子交换柱(GE Healthcare, USA),上样流速为0.5mL/min。之后将未吸附部分蛋白质(角质酶未吸附到CM-S印arose弱阳离子交换柱上)用20mM pH 8.5Tris_HCl缓冲液(缓冲液B)透析16h,过Q-Separose强阴离子交换柱(GE Healthcare, USA),上样流速为0.5mL/min。上样后用缓冲液洗B脱至洗脱液0D28(I〈0.05 (流速为1.0mL/min)，之后用含有0-50mM NaCl的缓冲液B线性洗脱，将有角质酶活力的洗脱液(通过按照实施例1所述方法测定洗脱液酶活力，从而确定所检测的洗脱液是否具有角质酶活力)超滤浓缩后过G-75凝胶柱，洗脱液为含有IOOmM NaCl的缓冲液B (流速为1.0mL/min)，收集得到纯化产物。
[0074]检测纯化产物的酶活力，酶活力测定方法同实施例1，采用Lowry法(Lowry，0.H.，Rosebroughj N.J.，Farr, A.L and Randall, R.J.，1951.Protein measurement withthe folin phenol reagent.J.Biol.Chem.193，265-275)测定纯化过程中各环节所得物中蛋白质的总含量。并根据“比酶活=总酶活/总蛋白”这一公式计算纯化过程中各环节所得产物角质酶的比酶活，角质酶的回收率。
[0075]结果如表1所示，从上述可以看出，经过硫酸铵盐浓缩、离子交换柱和凝胶柱，得到比酶活为984U/mL的纯化产物，纯化倍数和回收率分别为16和10%。
[0076]表1角质酶纯化过程中比酶活和回收率的测定
[0077]
【权利要求】
1.太瑞斯梭孢壳(Thielaviaterrestris)CAU709,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.6233。
2.权利要求1所述的太瑞斯梭孢壳(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233在制备角质酶中的应用。
3.一种制备角质酶的方法，包括如下步骤:发酵培养权利要求1所述的太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris) CAU709CGMCC N0.6233，收集发酵产物，获得角质酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述发酵培养的温度为35°C-55°C，所述发酵培养的时间为2-6天，所述发酵培养的方式为旋转震荡培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述旋转震荡培养的转速为150-250转/分钟，旋转半径为20-30mm。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于:所述发酵培养的培养基中含有小麦麸皮、橄榄油、胰蛋白胨、KH2PO4, MgSO4.H2O, CaCl2, FeSO4.H2O和吐温80 ； 所述小麦麸皮在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有2-3g所述小麦麸皮，所述橄榄油在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.5-1.5g所述橄榄油，所述胰蛋白胨在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.5-1.5g所述胰蛋白胨，所述KH2PO4在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.1-0.2g所述KH2PO4，所述MgSO4.Η20在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.01-0.1g所述MgSO4.Η20，所述CaCl2在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0.01-0.05g所述CaCl2，所述FeSO4.Η20在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0-0.005g所述FeSO4.Η20，所述吐温80在所述培养基中的含量为每IOOmL所述培养基中含有0-0.5g所述吐温80，所述培养基的pH为6.0-7.0。
7.一种角质酶，具有序列表中序列2-序列6所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的角质酶，其特征在于:所述角质酶是由权利要求1所述的太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris) CAU709CGMCC N0.6233 分泌得到的。
9.权利要求1所述的太瑞斯梭孢壳(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233在如下a)或b)中的应用: a)降解角质； b)降解树脂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述树脂为聚己内酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚丁二酸丁二醇酯中的至少一种。
【文档编号】C12R1/645GK103589645SQ201210286810
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月13日 优先权日:2012年8月13日
【发明者】江正强, 徐海博, 杨绍青, 闫巧娟, 刘昱 申请人:中国农业大学