3-吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用的制作方法
【专利摘要】3-吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用。本发明涉及氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ?ID?NO：3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)定点特异插入目标蛋白质的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的方法。所述3-吡唑基酪氨酸翻译系统包含：(i)3-吡唑基酪氨酸；(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
【专利说明】3-吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明还涉及一种3-吡唑基酪氨酸((S)-2-氨基-3-(4-羟基-3-(1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸，简写为pyTyr)的高效合成方法及包含其的翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它们的配对将3-吡唑基酪氨酸定点特异插入目标蛋白质的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质，例如，含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体，以及含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体的应用。
【背景技术】
[0002]电子传递(Eletctron Transfer, ET)涉及体内许多重要的生化过程,包括光合作用和细胞色素P450介导的氧化作用等。尽管目前人们在了解生物大分子如核酸及蛋白质的电子传递机制方面取得了巨大进步，但是对蛋白质的电子传递实验仍依赖于在蛋白质本身含有的残基如组氨酸或半胱氨酸上连接探针来进行，因此该方法仅能用于研究小的可溶性蛋白，这也就大大地限制了其应用。光诱导电子传递(photo-1nduced electrontransfer,PET)导致的突光淬灭是一种用来探索生物大分子中的电子传递机理及酶分子构象动力学等的有利工具，但由于受到目前技术的限制，缺乏新技术手段仍是将光电子转移应用于生物功能研究中的一个瓶颈。研究者通常利用色氨酸和酪氨酸等天然氨基酸作为电子供体，荧光基团作为电子受体，因此也只能限制于研究相对简单的生物学系统。
[0003]我们通过在蛋白中遗传整合金属螯合非天然氨基酸(UAAs)来克服上述限制因素。相比于在蛋白电子传递过程研究中作为电子供体的多种天然氨基酸以及多巴、3-氨基酪氨酸或者二氟代酪氨酸等非天然氨基酸，3-吡唑基酪氨酸-Cu (II)可以作为电子受体，这种独特的性质使得我们可以研究复杂生物学系统中的电子传递过程，而这是先前的电子传递研究方法所不能达到的。尽管已有报道含有可以结合金属基团(如联吡啶，羟基喹啉等)的非天然氨基酸可以被基因编码至目标蛋白中，但是对于它们在蛋白中发挥电子传递功能的应用至今却没有描述，而且，以上非天然氨基酸应用的最大瓶颈问题来自于其合成的复杂性，目前能够整合至蛋白中的以上非天然氨基酸的合成至少需要五个步骤才能得到产率较低的消旋混合物，而且整个合成过程涉及到重金属催化，致癌溶剂，强酸强碱以及多重纯化步骤。本发明中，我们开发了一种高效合成金属螯合非天然氨基酸-3-吡唑基酪氨酸(PyTyr)的方法，该方法仅需两步就可以获得较高产率(50%)的pyTyr，并且不需要经过后续复杂的过柱纯化步骤即可被遗传整合到蛋白质中。
[0004]水母绿色突光蛋白(Aequoreavictoria green fluorescent protein, GFP)目前被广泛应用于研究生物分子定位和相互作用中，但是在水母中该蛋白的生物功能及机制至今仍在探索研究中。近期，有研究表明GFP可以作为光诱导电子供体，因此在生物体内可能通过感光进而发挥体内电子传递的功能。然而，由于缺乏在目标蛋白的特定位点中加入电子受体的有效方法，导致人们无法深入了解生物体内GFP的电子传递机制。本发明拟通过在GFP中定点特异插入pyTyr,使其通过螯合铜离子Cu(II)形成pyTyr_Cu (II)复合物，而PyTyr-Cu(II)可以作为电子受体，与作为电子供体的GFP发色基团产生光诱导电子传递，该研究将为GFP的电子传递机制提供研究基础。本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA (Ο-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该Ο-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。
[0005]本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO 2002/086075，其发明名称为 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS” ；W0 2002/085923，其发明名称为 “ IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”;W0 2004/094593，其发明名称为“EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定点特异插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz, Chem.Commun.(Camb) 1:1-11(2002)；Wang 和 Schultz, Angewandte Chemie Int.Ed.44(I):34-66 (2005) ；Xie 和 Schultz,Methods 36(3):227-238(2005) ；Xie 和 Schultz, Curr.0pinion in Chemical Biology9 (6):548-554 (2005) ；ffang 等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35:225-249 (2006)。
【发明内容】
[0006]1、技术问题
[0007]本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ IDNO:3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入3-吡唑基酪氨酸。这是本发明人首次发现的，相应地，在本发明中将其命名为正交3-吡唑基酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(pyTyrRS)。
[0008]本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3_吡唑基酪氨酸定点特异插入目标蛋白质的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质及其应用。
[0009]因此，本发明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3-吡唑基酪氨酸定点特异插入蛋白质的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，并且提供该翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的方法。
[0010]本发明还提供利用本发明的3-吡唑基酪氨酸翻译系统产生的含有至少一个3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质。在本发明的优选方面中，本发明人利用这种方法将3-吡唑基酪氨酸定点特异插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，绿色荧光蛋白(GFP)。通过本发明的方法得到的包含3-吡唑基酪氨酸的突变绿色荧光蛋白通过螯合铜离子，可以作为电子受体，与作为电子供体的GFP发色基团产生光诱导电子传递。同时，本发明还通过解析了 GFP-151pyTyr和GFP-151pyTyr_Cu(II)的高分辨率晶体结构为pyTyr螯合铜离子及GFP发色基团和PyTyr-Cu(II)之间产生的光诱导电子传递提供了结构研究基础。然而，本领域技术人员应该理解，本发明的方法也可以用于在绿色荧光蛋白之外的多种蛋白中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸，并不局限于绿色荧光蛋白。[0011]最后，本发明还有一个目的是提供一种高效的3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法，该方法仅需两步就可以获得较高产率的pyTyr，并且不需要经过后续复杂的过柱纯化步骤。
[0012]2、技术方案
[0013]本发明人经过筛选，首次获得一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。并且，本发明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研发了 3-吡唑基酪氨酸翻译系统。
[0014]具体来说，本发明提供在体内(例如在宿主细胞内)对选择密码子(selectorcodon)如琥珀终止密码子(TAG)起反应而将非天然氨基酸3-吡唑基酪氨酸定点特异插入延伸中的多肽链的3-吡唑基酪氨酸翻译系统。所述3-吡唑基酪氨酸翻译系统包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA (Ο-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)配对。SP，宿主细胞内源性氨酰基-tRNA合成酶不会用氨基酸(天然的或非天然的)加载0-tRNA。类似地，本发明提供的O-RS不以显著水平或者某些情况下不以可检测水平地用氨基酸(天然的或非天然的)加载内源性tRNA。利用所述翻译系统能够产生含有在翻译过程中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的大量蛋白质。
[0015]在一些方面中，本发明提供3-吡唑基酪氨酸翻译系统，所述翻译系统包含:(a)非天然氨基酸，即3-吡唑基酪氨酸，(b)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和(c)正交tRNA(Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)，优先氨酰化所述0-tRNA。
[0016]优选地，本发明的3-吡唑基酪氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA (Ο-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子，优选地为琥珀密码子。更优选地，本发明的3-吡唑基酪氨酸翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0017]所述系统中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)即为本发明人发现的氨酰基tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。
[0018]在本发明的优选方面中，本发明提供一种3-吡唑基酪氨酸翻译系统，所述系统包含:
[0019](i) 3-吡唑基酪氨酸；
[0020](ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0021](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA ;和[0022](iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
[0023]优选地，所述3-吡唑基酪氨酸翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0024]该翻译系统中的各种组分可以衍生自各种物种来源，例如，该翻译系统中的各组分衍生自詹氏甲烧球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA (Ο-tRNA)为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA。在一些实施方式中，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些实施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，优选地，Ο-tRNA的序列如SEQ ID N0:1所示。在一个实施方式中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列及该序列的保守变体。
[0025]在一些方面中，本发明的3-吡唑基酪氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA (Ο-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子。在优选方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。
[0026]在一些方面中，本发明提供包含正交tRNA序列和编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞。所用的宿主细胞不作具体限定，只要O-RS和Ο-tRNA在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。例如，所述宿主细胞可以是真细菌细胞，如大肠杆菌。如实施例所述，可以将包含正交tRNA序列的重组载体和包含编码正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重组载体共转化到宿主细胞中，而获得包含正交tRNA序列和编码正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞。所述包含正交tRNA序列和编码本发明的正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞构成本发明的另一个方面。
[0027]本发明还提供产生在至少一个所选位置定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质的方法。所述方法利用上述3-吡唑基酪氨酸翻译系统实现。所述方法通常始于提供含有以下组分的3-吡唑基酪氨酸翻译系统的步骤:(i)非天然氨基酸，即3-吡唑基酪氨酸；(?)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS) ; (iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)优先氨酰化所述Ο-tRNA;和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列转化到适当的宿主细胞中，然后将编码所述目标蛋白质的核酸转化到包含正交tRNA序列和编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞中，在培养基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白质的翻译过程中，3-吡唑基酪氨酸氨酰化的Ο-tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的3-吡唑基酪氨酸定点特异插入所述目标蛋白质的所选位置，从而产生在所选位置含有3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质。其中包含正交tRNA序列和编码正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞可以通过将包含正交tRNA序列的重组载体和包含编码正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重组载体共转化到所选的宿主细胞中而获得。本领域技术人员应该理解，适当的重组载体的构建和宿主细胞的筛选可以通过常规分子克隆技术和筛选技术实现。
[0028]在所述方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变使野生型氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋发生突变，选择用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)优先氨酰化所述Ο-tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突变体(即，本发明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述选择步骤包括定点诱变后从得到的氨酰基-tRNA合成酶分子库进行所述O-RS的正选择和负选择(参见下述实施例2)。在一些实施方式中，提供翻译系统的步骤还包括提供Ο-tRNA的序列，Ο-tRNA为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA，例如，所述Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。在这些方法中，提供翻译系统的步骤还包括提供含有所述翻译系统所用的琥珀选择密码子的编码目标蛋白质的核酸。 [0029]还可在宿主细胞内实施产生含有3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质的方法。在这些情况中，提供的宿主细胞包含本发明的3-吡唑基酪氨酸翻译系统(即，包含编码O-RS的核苷酸序列、Ο-tRNA序列和含有至少一个选择密码子的编码目标蛋白质的核酸)，而在适宜的培养条件下(例如，在培养基中添加3-吡唑基酪氨酸等)培养该宿主细胞可导致在所述目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)。
[0030]本发明还提供生产含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体的方法，所述方法利用上述3-吡唑基酪氨酸翻译系统，其中所用的编码绿色荧光蛋白突变体的核酸序列可以为，但不限于，SEQ ID NO:8，10，12，例如，在野生型绿色荧光蛋白的149位，151位和182位分别引入3-吡唑基酪氨酸，相应地，利用本发明的突变方法所得到绿色荧光蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7,9,llo这些方法通常始于提供含有以下组分的3-吡唑基酪氨酸翻译系统的步骤:(i)3-吡唑基酪氨酸；(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)正交tRNA(Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述Ο-tRNA ;和(iv)编码所述绿色荧光蛋白的核酸，例如，但不限于，SEQ ID NO:8，10，12，其中所述核酸含有所述Ο-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列转化到适当的宿主细胞中，然后将编码所述目标蛋白质的核酸转化到所得到的宿主细胞中，在培养基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白质的翻译过程中，3-吡唑基酪氨酸氨酰化的Ο-tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的所述3-吡唑基酪氨酸定点特异插入所述绿色荧光蛋白的所选位置，之后通过螯合铜离子来研究GFP的光诱导电子传递。
[0031]本发明还提供利用本发明的3-吡唑基酪氨酸翻译系统产生的含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体，所述绿色荧光蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:7，9，ll，在野生型绿色荧光蛋白的149位，151位和182位分别引入3-吡唑基酪氨酸，所述绿色荧光蛋白突变体通过螯合铜离子产生光诱导电子传递。
[0032]最后，本发明还提供一种高效的3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法，所述方法包括下列两个步骤:第一步:在50ml圆底烧瓶中加入2.46g3-碘代酪氨酸,溶于20ml 10%NaOH水溶液中，另取1.92gt-Boc酸酐溶于20ml THF中后，将其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室温下搅拌过夜，停止反应后，加入适量的盐酸，调节PH值至6.5-7.0之间，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相进行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸；
[0033]第二步:取一干净的50ml三口瓶，加入0.34g吡唑，1.92g无水Cs2C03，0.019gCuI (作为催化剂)，2.03g Boc-L-3-碘代酪氨酸和8ml无水DMF。在氮气保护的条件下，搅拌并于180°C回流18小时，冷却后，旋干DMF，用无水乙醇溶解并抽滤沉淀，取滤液加浓盐酸至沉淀完全，然后再进行抽滤，旋干滤液，用乙酸乙酯和蒸馏水进行萃取，收集水相，用制备型HPLC进行分离纯化。
[0034]本领域技术人员应该理解，上述制备方法中各反应物的用量仅是举例说明的目的，本领域技术人员根据所需终产物量等因素，可以适当成比例放大或减少各反应物用量，这也在本发明的范围之内。
[0035]3、有益效果
[0036]蛋白质分子设计的目的之一是揭示一些通过研究天然蛋白所无法获得的生物原理，而这些新的原理可能会有潜在的生物化学与生物物理的应用前景。然而，近观一些天然存在的金属蛋白，我们发现自然界利用金属或其配合物的种类十分有限。而且能与这些金属或其配合物形成配位作用的氨基酸种类也十分有限，自然界存在的20种天然氨基酸中能形成配位作用的不到一半。对于天然配位性氨基酸的局限性，人们正试图通过在蛋白的设计与构建的过程中引入非天然氨基酸来加以克服。这些非天然氨基酸与天然氨基酸在结构上有着类似性，但其结构与性质更多样化。
[0037]通过生物正交化学的方法选择性的修饰蛋白，可以实现蛋白位点特异性插入非天然氨基酸。应用琥珀密码子在细胞中编码3-吡唑基酪氨酸，实现在绿色荧光蛋白中特定位点插入该非天然氨基酸，使其螯合铜离子Cu(II)形成PyTyr-Cu(II)复合物，而PyTyr-Cu(II)可以作为电子受体，与作为电子供体的GFP发色基团产生光诱导电子传递。同时，本发明还通过解析了 GFP-15IpyTyr和GFP-15IpyTyr-Cu (I I)的高分辨率晶体结构为pyTyr螯合铜离子及GFP发色基团和PyTyr-Cu(II)之间产生的光诱导电子传递提供了结构研究基础。同时，本发明涉及的高效合成3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的方法，大大简化了合成步骤，避免了合成过程中所涉及到的重金属催化，致癌溶剂及强酸强碱，并且不需要经过后续复杂的过柱纯化步骤就能得到较高产率的目标产物。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0039]图1是(S)-2-氨基-3-(4-羟基-3-(1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸(简写为pyTyr)的化学合成；
[0040]图2是pyTyr的核磁图谱，上图是氢谱图，下图是碳谱图；
[0041]图3是正交tRNA，氨酰基-tRNA合成酶，肌红蛋白及绿色荧光蛋白系列突变体序列；
[0042]图4是SDS-PAGE电泳图及质谱图:A是pyTyr_Mb (4TAG)的SDS-PAGE电泳图，B是pyTyr-GFP(151TAG)的 SDS-PAGE 电泳图；C 是 pyTyr-Mb (4TAG)的质谱图；
[0043]图5 是 wt GFP, GFP_149pyTyr 和 GFP_151pyTyr 的荧光光谱图；
[0044]图 6 是 wt GFP, GFP_149pyTyr, GFP_151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 中加入不同浓度Cu(II)离子后的荧光强度图；
[0045]图7是亚铁氰化钾导致的GFP-149pyTyr_Cu(II)荧光强度恢复；
[0046]图8是荧光淬灭强度与温度的关系图；
[0047]图9是pyTyr-Cu (II)的吸收光谱和GFP的荧光光谱图；[0048]图10是GFP-149pyTyr-Cu(II)光激发后加入BCS的吸收光谱图；
[0049]图11是GFP系列突变体螯合铜离子后的荧光寿命曲线图；
[0050]图12是GFP发光基团和pyTyr残基间距离值与光诱导电子传递速率kET值的线性关系图；
[0051]图13是高分辨率晶体结构图和电子密度图:A是GFP-151pyTyr-Cu(II)的晶体结构图；B是GFP-151pyTyr的电子密度图；C是GFP-151pyTyr_Cu(II)的电子密度图。
【具体实施方式】
[0052]以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0053]本领域技术人员应该理解，除非特别说明，下述实施例中所用的化学试剂均为可通过商业途径购得的分析纯级别的试剂。
[0054]实施例1:pyTyr的化学合成(参见图1和图2)
[0055]在50ml圆底烧瓶中加入3_碘代酪氨酸(2.46g，8mmol，购自上海吉尔生化公司)，溶于20ml 10% NaOH水溶液中，另取t-Boc酸酐(1.92g，8.8mmol，购自北京中胜华腾有限公司)溶于20ml THF中后，将其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室温下搅拌过夜。停止反应后，加入适量的盐酸，调节pH值至6.5-7.0之间，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相进行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸。
[0056]取一干净的50ml三口瓶，加入吡唑(0.34g, 5mmol,购自Sigma公司)，无水Cs2CO3 (1.92g, IOmmol,购自天津 Alfa Aesar 公司)，CuI (0.019g, 0.1mmol,作为催化剂)，Boc-L-3-碘代酪氨酸(2.03g,5mmol)和8ml无水DMF(购自北京百灵威公司)。在氮气保护的条件下，搅拌并于180°C回流18小时。冷却后，旋干DMF，用无水乙醇溶解并抽滤沉淀，取滤液加浓盐酸至沉淀完全，然后再进行抽滤，旋干滤液，用乙酸乙酯和蒸馏水进行萃取，收集水相，用制备型HPLC进行分离纯化(分离柱YMC AA12S052503WT，购自慧德易公司，流速 12ml/min)。收率 50 % ? MS:m/z:248 [M+H]+ ；IH-NMR(600MHz, DMS0_d6(CD3S0CD3)):δ 10-11.6(s-b, 1H)，8.44(t，2H)，8.38(s, 1H)，7.8(s, 1H)，7.7(s, 1H)，7.14(dd, I Η)，
6.6(s, 1H) ,4.27 (dd, 1H, -CH)，3.19 (m，2H，-CH2).13C NMR(600MHz, DMS0_d6) d 35，54，107，118，124，126，127，129，132，139，147，172ppm.[0057]以上合成反应所需化学试剂如无特别说明，均购自北京化工厂，纯度均为分析纯以上级别。
[0058]实施例2:进化pyTyr特异性氨酰基-tRNA合成酶
[0059]为了在基因中位点特异性插入pyTyr，需要在所用的E.coli宿主细胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交对，这个正交对来源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)琥珀抑制酪氨酰tRNA (MjtRNACUATyr) /酪氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS，野生型，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2)对。MjTyrRS突变库构建在卡纳霉素抗性pBK质粒(购自美国Scripps研究所Peter G.Schultz实验室)中，位于该质粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的启动子和终止子之间。所使用的合成酶突变库为pBk-lib-jwl库，该突变库的构建方法为:在MjTyrRS 基因上挑选 6 个位点(Tyr32，Leu65，Phel08，Glnl09，Aspl58，和 Leul62)引入 NNK突变(N = A+T+C+G ;K = T+G)，另外 6个位点(Ile63,Ala67,His70,Tyrll4, Ilel59,Vall64)或随机突变为 Gly 或保持不变(参见 Xie, J.；Liu, ff.S.；Schultz, P.G.Angew.Chem., Int.Ed.2007,46,9239-9242 ;Wang, JY.；Zhang ff.；Song WJ ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010,132,14812-14818)。
[0060]通过正负筛选来进化特异性识别pyTyr的氨酰基-tRNA合成酶(参见Liu，X.H.；Yu, Y.；Hu,C.；Zhang, ff.；Lu,Y.；ffang, J.Y,Significant Increase of Oxidase Activitythrough the Genetic Incorporation of a Tyrosine-Histidine Cross-Link in aMyoglobin Model of Heme-Copper Oxidase.Angewandte Chemie-1nternational Edition2012,51 (18),4312-4316.)。正筛选质粒包含MjtRNACUATylr，TAG突变的氯霉素乙酰转移酶基因，启动表达绿色荧光蛋白的琥珀突变的T7 RNA聚合酶，四环素抗性基因。负筛选质粒包含MjtRNAa/'在阿拉伯糖操纵子下的琥珀突变芽孢杆菌RNA酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。进行3轮正负筛选:包含有正筛选质粒的E.coli DHlOB细胞作为正筛选寄主细胞。细胞电转pbk-lib-jwl库，SOC培养基(2% (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母粉，0.05%(W/V)NaCl,2.5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM葡萄糖)在37°C培养I小时。之后换用极限培养基(GMML 极限培养基的配方:M9 盐 / 甘油:764gNa2HP04.7H20 或者 30g Na2HPO4,15g KH2PO4,
2.5g NaCl，5g NH4Cl, 50ml 甘油，高压灭菌，pH 7.0 ；1M MgSO4:高压灭菌；50mM CaCl2:高压灭菌；25mM FeCl2:过滤灭菌；0.3M亮氨酸:溶解于0.3M NaOH中，过滤灭菌；1L液体GMML培养基:200ml M9盐/甘油，2ml MgSO4, 2ml CaCl2, 2ml FeCl2, Iml亮氨酸)洗两次，铺板固体极限培养基(在液体GMML培养基中加入500ml 3%琼脂粉，0.5mM pyTyr，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四环素)，37°C培养60小时。收取细胞，提取质粒DNA，电泳分离，胶回收。然后，将经过正筛选 的pBK-lib-jwl转化到包含负筛选质粒的DH10B感受态细胞中。SOC培养基中恢复I小时。之后涂板包含0.2%阿拉伯糖(购自sigma公司)的LB固体培养基(每升培养基含IOg胰蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl)。37°C培养8_12小时。共重复3轮。
[0061]最后一轮正筛选挑384个克隆，分别点板在含有0.5mM pyTyr、氯霉素60，80，100，120mg/L的GMML固体培养基上，及不包含pyTyr、但包含氯霉素0，20，40，60mg/L的GMML固体培养基。挑选在在0.5mM pyTyrl20mg/L氯霉素的培养基上生长，而在OmM pyTyr 40mg/L氯霉素培养基中不生长的克隆进行进一步验证。挑出3个克隆，其中克隆I的3-吡唑基酪氨酸插入效率最高，测序表明，克隆I所包含的氨酰基-tRNA合成酶突变体(pyTyrRS)的氨基酸序列为SEQ ID N0:3所示，其中突变位点为Tyr32Asp，Leu65Thr，His70Gly和Aspl58Ala。
[0062]实施例3:表达pyTyr-肌红蛋白，pyTyr-绿色突光蛋白及质谱鉴定
[0063]将正交tRNA(SEQ ID NO:1)和筛选出来的pyTyrRS (SEQ ID NO:3)分别构建到pEVOL载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上,然后共转化到包含有pbad-肌红蛋白(4TAG)或pET-绿色荧光蛋白(151TAG)表达质粒(该质粒购自美国Scripps研究所Peter G.Schultz实验室)(其中肌红蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:5,绿色荧光蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:10)的DH10B细胞(购自全式金公司)中。挑取单个克隆在37°C培养到OD6tltl约等于1.1时，向LB培养基中加入0.5mM pyTyr, ImM IPTG及0.2%阿拉伯糖(购自Sigma公司)培养细胞,对照不加入pyTyr。6_8小时之后，收菌，N1-NTA纯化蛋白，并用SDS-PAGE电泳分析(图4A，图4B)。[0064]我们发现，只有在存在pyTyr的培养基中才能纯化出全长的肌红蛋白和绿色荧光蛋白，这说明筛选出来的pyTyrRS可以特异性的识别pyTyr。在LB培养基中pyTyr-肌红蛋白的产率为10mg/L，而野生型肌红蛋白的产率为50mg/L ;pyTyr_绿色荧光蛋白的产率为20mg/L,而野生型绿色突光蛋白的产率为100mg/L。为了检测pyTyr仅仅插入到肌红蛋白的4位琥珀突变位点，我们对pyTyr-肌红蛋白进行了 ES1-TOF质谱检测，检测结果分子量为18496Da(图4C)，与计算的分子量18496Da吻合。
[0065]实施例4:表达pyTyr-绿色荧光蛋白突变体进行光诱导电子传递研究
[0066]我们用基因工程方法构建了绿色荧光蛋白系列突变体(核苷酸序列如SEQ ID NO:8，10，12所示)，其中149位，151位和182位分别突变为TAG终止密码子，然后用实施例3中的相同方法在GFP的突变位定点特异插入pyTyr，表达产生突变蛋白GFP_149pyTyr，GFP-151pyTyr 和 GFP_182pyTyr (氨基酸序列如 SEQ ID NO:7，9，11 所示)。
[0067]由于本发明主要通过测量荧光淬灭和荧光寿命的方法来研究GFP的光诱导电子传递，因此首先需验证GFP突变后有没有对蛋白自身的荧光强度产生影响，所以我们测量了 ΙμΜ wt GFP(核苷酸序列为 SEQ ID NO:6)，GFP_149pyTyr 和 GFP_151pyTyr 在 60mMTris-HCl (pH 7.0)缓冲液中的发射光谱，结果显示GFP系列突变体与其野生型的发射光谱相似，说明GFP中引入非天然氨基酸后没有影响蛋白的发光团形成及其荧光量子产率(图5)。然后，我们往 5μ M Wt GFP，GFP-149pyTyr, GFP_151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 中加入不同浓度的Cu(II)离子，测量其荧光强度，结果如图6所示，加入5μΜ的Cu(II)离子可以导致 GFP-149pyTyr，GFP-151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 的荧光强度分别淬灭 85 %，50 %和 25 %，而wt GFP仅仅淬灭了不到5%,证明GFP中插入pyTyr后可以有效地螯合铜离子,且蛋白荧光可以被Cu(II)不同程度的淬灭。接着，我们又往GFP-149pyTyr-Cu(II)中分别加入多种对Cu(II)离子具有不同亲和力的铜离子螯合剂:甲硫氨酸、乙二胺、组氨酸、44'-联吡啶和N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸，通过测量GFP-149pyTyr-Cu(II)的荧光强度，再结合Scatchard分析法计算发现GFP-149pyTyr对Cu (II)具有高度亲和力，其Kd值为0.9nM。然后，我们用还原滴定法往5 μ M GFP-149pyTyr-Cu (II)中加人50mM还原剂亚铁氰化钾，发现其可以完全恢复GFP-149pyTyr-CU(II)的荧光强度(图7)，根据能斯特方程设计实验并计算得出GFP-149pyTyr-Cu(II)的还原电位为168mV，这与Cu2++丨一Cu+中产生的153mV电位值很接近。以上这些结果都充分地证明GFP-149pyTyr对Cu(II)的高度亲和力。
[0068]由于GFP在不同位置含有结合金属离子的非天然氨基酸pyTyr，其荧光强度可以被Cu(II)离子不同程度的淬灭，为了验证这种淬灭机制，我们还检测了荧光淬灭强度和温度的关系，发现淬灭强度随着温度的增加而降低(图8)，说明该淬灭现象并非动态荧光淬灭；如图9所示，pyTyr-Cu(II)的吸收光谱和GFP的荧光光谱没有重叠，因此由FRET引起的淬灭机制也可能得到排除；为了进一步验证以上的荧光淬灭机制为PET机制，我们选用一种Cu(I)特异性螯合剂-bathocuproine disulfonate (浴酮灵二磺酸二钠盐,BCS)来验证GFP-149pyTyr-Cu(II)中的光诱导电子传递现象，因为当GFP_149pyTyr螯合Cu(II)并且经过光激活后，如果能够在GFP和Cu(II)之间形成电子传递，势必会产生Cu(I),而BCS和Cu (I)特异性结合形成的复合物在483nm处具有较强吸收(摩尔消光系数为12，δΟΟΜ^1)。测量结果如图10所示，当2μΜ GFP-149pyTyr,5yM Cu(II)和10 μ M BCS的混合液经过405nm激光激发后，其在483nm处的吸光值迅速升高，并且在10分钟后达到最高值。计算发现，该过程中产生了 4.ΙμΜ Cu1(BCS)2产物。即I当量的蛋白通过光诱导转移可以产生两个当量的电子转移，这些结果与之前报道的GFP能通过光诱导产生2个电子氧化的结果一致。该实验证实了 GFP发色基团和pyTyr-Cu(II)之间确实产生了光诱导电子传递现象。
[0069]通过测量荧光寿命进一步研究GFP发色基团和pyTyr-Cu(II)之间的光诱导电子传递速率。如图11所示，加入Cu(II)后，PyTyr-GFP不同突变体的荧光寿命均不同程度的减短，其中GFP-149pyTyr的突光寿命从3.4ns降低至0.7ns,根据公式:kET = τ 加入Cu(II))-τ2_Η不加Cu(II))可以得到GFP-149pyTyr-Cu(II)的光诱导电子传递速率kET为 1.13X IOV1 ;同理计算出 GFP-151pyTyr-Cu(II)和 GFP_182pyTyr_Cu (II)的 kET 分别为
0.37X IO9 和 0.08X IOV1 (表 I)。相比于 GFP_149pyTyr_Cu (II)，GFP-15IpyTyr-Cu (II)和GFP-182pyTyr-Cu(II)电子传递速率有所降低，我们推测很有可能是因为GFP发色团与pyTyr残基之间的距离增大而导致的，因此我们根据GFP-151pyTyr_Cu (II)高分辨率晶体结构(如实施例5所述)计算出GFP发色基团与pyTyrl51残基之间的距离为为11.4A，而GFP发色基团与pyTyr 149和pyTyr 182之间的距离则通过测量GFP-15IpyTyr-Cu (II)晶体结构中其与Asnl49和Tyrl82之间的距离得到。结果如图12所示，GFP发色基团和PyTyr-Cu(II)之间的光诱导电子传递速率随着它们之间距离的增加而减慢。由于GFP 二级结构主要为β桶组成的，实验证明该种类型结构相对于α螺旋更有利于GFP中的电子传递发生。通过计算发现GFP-151pyTyr-Cu (II)的距离衰减因子β值为0.7,该值小于在通常蛋白中的距离衰减因子，因此推测在该GFP蛋白中的电子传递有可能还存在跳跃模式，使电子传递更加有效的进行。需要值得关注的是，GFP-151pyTyr-Cu(II)的电子传递速度约10-100倍低于光系统(II)的主要电子传递反应，但高于目前为止的光系统(II)模拟系统。
[0070]表1.GFP系列突变体的荧光寿命值及电子传递速率kET值。
【权利要求】
1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。
2.一种3-吡唑基酪氨酸翻译系统，所述系统包含: (i)3-吡唑基酪氨酸； (?)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；和 (iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA。
3.如权利要求2所述的翻译系统，其还包含(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
4.如权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子，并且其还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其包含所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列，并且该所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。
6.一种产生在至少一 个所选位置定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤: (a)提供权利要求3所述的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，该系统包含: (i)3-吡唑基酪氨酸； (?)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和 (b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列转化到适当的宿主细胞中，然后将编码所述目标蛋白质的核酸转化到所得到的宿主细胞中，在培养基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白质的翻译期间，3-吡唑基酪氨酸氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的3-吡唑基酪氨酸定点特异插入所述目标蛋白质的所述所选位置，从而产生在所选位置含3-吡唑基酪氨酸的所述目标蛋白质。
7.生产含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体的方法，其利用权利要求6所述的方法，其中所用的编码绿色荧光蛋白突变体的核酸序列分别为SEQ ID NO:8，10，12，在野生型绿色荧光蛋白的149位，151位和182位分别引入3-吡唑基酪氨酸，所述绿色荧光蛋白突变体的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7,9,llo
8.由权利要求7所述的方法获得的含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:7，9或11。
9.由权利要求8获得的绿色荧光蛋白突变体及其螯合铜离子后形成的复合物的高分辨率晶体结构，其中所述绿色荧光蛋白突变体的核酸序列为SEQ ID NO:8，10，12，氨基酸序列分别为 SEQ ID NO:7,9,11ο
10.一种高效的3-批唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法,其包括下述两个步骤: 第一步:在50ml圆底烧瓶中加入2.46g 3-碘代酪氨酸，溶于20ml 10% NaOH水溶液中，另取1.92g t-Boc酸酐溶于20ml THF中后，将其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室温下搅拌过夜，停止反应后，加入适量的盐酸，调节PH值至6.5-7.0之间，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相进行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸；
第二步:取一干净的50ml三口瓶，加入0.34g吡唑，1.92g无Cs2CO3,0.019g
CuI，2.03g Boc-L-3-碘代酪氨酸和8ml无水DMF，在氮气保护的条件下，搅拌并于180°C回流18小时，冷却后，旋干DMF，用无水乙醇溶解并抽滤沉淀，取滤液加浓盐酸至沉淀完全，然后再进行抽滤，旋干滤液，用乙酸乙酯和蒸馏水进行萃取，收集水相，用制备型HPLC进行分离纯化。
【文档编号】C12N9/10GK103571804SQ201210285659
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月10日 优先权日:2012年8月10日
【发明者】王江云, 刘晓红, 李家松, 董建树, 胡诚, 龚为民, 江欢欢 申请人:中国科学院生物物理研究所