一种能够防治猪蓝耳病的生物活性分子-抗菌肽Cecropin D的制作方法
【专利说明】—种能够防治猪蓝耳病的生物活性分子-抗菌肽Cecrop i η
D
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种能够防治猪蓝耳病的生物活性分子抗菌肽Cecropin D。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome viruse, PRRSV)引起，PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以Lelystad Virus (LV)毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株(Highlypathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse, HP-PRRSV),目前，高致病性猪蓝耳病(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome,HP-PRRS)是对养猪业损害最大的疾病之一，由于该病毒具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、病毒血症维持时间长等特点，目前没有很好的疫苗和药物可以防控蓝耳病。
[0003]PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5'和3'非编码区，中间为10个开放阅读框(openreading frame, 0RF),其中 0RF2-7 分别翻译病毒糖蛋白(glycoprotein GP) GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。
[0004]PRRS的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRS难于防控主要表现在以下几方面:(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages, PAMs), PAMs是免疫细胞，破坏PAMs,从而破坏机体免疫系统,从而引起免疫抑制；(2)抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，疫苗没有交叉保护力；(3)抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；(4)病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症；(5)混合感染，目前临床上混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌等与PRRSV的混合感染，使PRRSV防控难上加难。
[0005]目前PRRS防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点:(1)需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；(2)不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；(3)产生完全免疫力需要2?3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；(4)存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。
[0006]1975年，瑞典科学家Boman等从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到一种抗菌肽，并命名为Cecropin。天蚕素Cecropin D (⑶)是家蚕体内cecropins家族的一种抗菌小肽，由36个氨基酸残基组成，分子量为3.9KDa，含有2段α -螺旋，中间由一段结节部位相连，N端经常是一些强碱性氨基酸残基，C端则由非极性氨基酸残基构成疏水性区域。目前已证明CD对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌有抗微生物学活性。而关于抗菌肽Cecropin D(CD)是否具有抗病毒活性，尤其是否具有抗PRRSV病毒的作用，至今还未见有相关的研究或报道。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是克服现有猪蓝耳病防治技术的不足，提供一种能够防治猪蓝耳病的生物活性分子抗菌肽Cecropin D(⑶)。该抗菌肽⑶对PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是针对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
[0008]本发明的目的是提供抗菌肽Cecropin D(⑶)在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，尤其是抗HP-PRRSV药物中的应用。
[0009]本发明另一目的是提供抗菌肽Cecropin D (⑶)在制备防治猪蓝耳病药物中的应用。
[0010]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
公开了抗菌肽Cecropin D在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，所述抗菌肽CecropinD的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。优选地，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSVo
[0011]公开了抗菌肽Cecropin D在制备防治猪蓝耳病药物中的应用，所述抗菌肽Cecropin D的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。优选地，所述猪蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的猪蓝耳病。
[0012]SEQ ID N0.1 所示序列为:WNPFKELERAGQRVRDAIISAGPAVATVAQATALAK。
[0013]另外，上述抗菌肽Cecropin D含有2段α -螺旋，中间由一段结节部位相连#端是强碱性氨基酸残基，C端由非极性氨基酸残基构成疏水性区域。
[0014]所述抗菌肽Cecropin D使用剂量范围为100 mg/L?300 mg/L。
[0015]包括有效量的抗菌肽Cecropin D的抗PRRSV病毒药物，也应在本发明的保护范围之内。优选地，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。
[0016]该药物的剂型可以为注射制剂或口服制剂。
[0017]本发明首先合成抗菌肽Cecropin D的基因序列引物，并利用毕赤酵母表达系统表达抗菌肽Cecropin D (⑶),然后通过抗大肠杆菌DH5 α实验验证其抗菌活性,进一步在Marc-145细胞和PAMs细胞水平上，通过qRT-PCR、Western_Blot、TCID5tl检测及IFA等方法研究其对HP-PRRSV毒株的抗病毒活性，并通过病毒吸附、进入细胞和进入细胞后2h、4h四个过程研究阐述其抗病毒机制。结果显示，本发明所述方法制得的抗菌肽Cecropin D有很好抗HP-PRRSV病毒效果，有望成为新型的防治猪蓝耳病的生物活性分子。
[0018]另外,对于抗菌肽Cecropin D的表达,为了获得稳定高效表达抗菌肽⑶的酵母工程菌，本发明通过不同浓度ZeocinTM抗性筛选高拷贝质粒，通过碳源、氮源、发酵罐溶氧量、PH值及表达时间对发酵条件进行了摸索，为筛选高效稳定表达CD工程菌奠定了基础，而且本发明表达抗菌肽⑶的表达载体为PGAPZ α Α,此载体不需要甲醇诱导，从而使表达更加方便，且表达量更高。具体抗菌肽Cecropin D (⑶)的表达纯化方法如下:
(I)基因序列合成:通过The Antimicrobial Peptide Database (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php)查找到抗菌肽⑶的氨基酸序列，根据毕赤酵母表达系统密码子偏嗜性优化密码子，设计引物，为了使表达产物分泌到细胞外且形成天然N端以保证其活性，设计引物时在5'端加入AAAAGA Kex2蛋白酶切位点。
[0019]设计的两对引物Pl和P2，P3和P4序列如下:
引物 Pl (SEQ ID N0.2 所示)
CCATTCAAGGAGTTGGAGAGAGCTGGTCAAAGAGTCAGAGACGCTATCATCTCCGCT ；
引物 P2 (SEQ ID N0.3 所示)
CAAAGCGGTAGCTTGAGCGACGGTAGCGACAGCTGGACCAGCGGAGATGATAGCGTC。
[0020]引物P3 (SEQ ID N0.4 所示)
CCCTCGAGAAAAGATGGAACCCATTCAAGGAGTTGGAG ；
引物 P4 (SEQ ID N0.5 所示)
GCTCTAGATTAGTTCTTAGCCAAAGCGGTAGCTTGAGCo
[0021]通过引物互为模版融合PCR合成⑶基因序列。
[0022](2)克隆转化:将合成得到的⑶基因序列克隆到酵母表达载体pGAPZ a A (购自Invitrogen公司)中，构建pGAPZ a A-CD重组酵母表达载体，线性化后300V、200Q电击15ms转化入酵母表达宿主菌SMDl 168 (购自Invitrogen公司),线性化酶为Avr II,构建重组酵母表达工程菌。
[0023](3)转化子筛选:经不同浓度Zeocin?的YPDS平板筛选高拷贝转化子，用于高效表达目的蛋白。
[0024](4)表达:用灭菌枪头挑筛选到的具有Zeocin?抗性的单菌落，于5mL的YPD液体培养基中进行一级培养，30°C，200 r/min振荡过夜，至0D_=2?6，即细胞处于对数生长期。取ImL —级培养液,重悬于50mL的YPD液体培养基中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时，离心收集上清。
[0025](5)纯化:His-tag柱子过柱纯化上清，纯化产物即为抗菌肽⑶，分装，_80°C保存。
[0026]实验结果显示,本发明所述方法制得的抗菌肽Cecropin D有很好抗HP-PRRSV病毒效果，有望成为新型的防治猪蓝耳病的生物活性分子，为抗菌肽Cecropin D抗病毒作用的研究提供了先决条件，而且为抗菌肽Cecropin D的推广应用提供了理论基础。
[0027]本