发明具有以下有益效果:
本发明首次证明公开了抗菌肽Cecropin D的抗PRRSV病毒的作用。本发明通过多种方法研究证实了抗菌肽Cecropin D在Marc-145细胞或PAMs细胞水平对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，尤其是对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，为研制抗猪蓝耳病的新型药物奠定了基础，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
[0028]本发明还对抗菌肽Cecropin D对HP-PRRSV抗病毒作用的机制进行了研究，分别在病毒吸附、进入细胞和进入细胞后2h、4h四个过程阐述了抗病毒机制，为其应用奠定了坚实的基础。
[0029]另外，对于抗菌肽Cecropin D的表达，为了获得稳定高效表达抗菌肽⑶的酵母工程菌，本发明通过不同浓度ZeocinTM抗性筛选高拷贝质粒，通过碳源、氮源、发酵罐溶氧量、PH值及表达时间对发酵条件进行了摸索，为筛选高效稳定表达CD工程菌奠定了基础，而且本发明表达抗菌肽⑶的表达载体为PGAPZ α Α,此载体不需要甲醇诱导，从而使表达更加方便，且表达量更高。实验结果显示，本发明所述方法制得的抗菌肽Cecropin D有很好抗HP-PRRSV病毒效果，有望成为新型的防治猪蓝耳病的生物活性分子，为抗菌肽CecropinD抗病毒作用的研究提供了先决条件，而且为抗菌肽Cecropin D的推广应用提供了理论基础。
【附图说明】
[0030]图1为抗大肠杆菌DH5 α活性图。
[0031]图2为AlamarBlue检测CD对Marc-145细胞和PAMs细胞的毒性。
[0032]图3 为在 MOI=0.1 和 I 的 HP-PRRSV 感染的 Marc-145 细胞，经 300mg/L CD 作用36h后，N基因相对于内参GAPDH的表达水平。
[0033]图4为分别经100、200、300mg/L CD处理后的HP-PRRSV感染的Marc-145细胞上清中的病毒滴度。
[0034]图5 为在 MOI=0.1 的 HP-PRRSV 感染的 Marc-145 细胞，分别经 200、300mg/L CD 处理36h后，N蛋白表达水平。
[0035]图6 为在 MOI=0.1 的 HP-PRRSV 感染的 Marc-145 细胞，分别经 100、200、300mg/LCD处理36h后，对N蛋白的间接免疫荧光试验。
[0036]图7 为以 MOI=0.1 接毒 HP-PRRSV，并分别加入浓度为 100、200、300mg/L CD，4°C孵育2h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5%C02、37°C培养箱中继续培养24h，收集细胞，N基因相对于内参GAPDH的表达水平。
[0037]图8 为以 MOI=0.1 接毒 HP-PRRSV，并分别加入浓度为 100、200、300mg/L CD，4°C孵育2h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5%C02、37°C培养箱中继续培养24h,收集细胞,针对N蛋白做Western-Blot检测。
[0038]图9为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后分别加入浓度为100、200、300mg/L CD，在5%C02、37°C培养箱中培养6h，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，弃去营养液，PBS洗3遍，收集细胞Western-Blot 检测。
[0039]图10为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗3次，37°C培养箱中培养2h，PBS洗3次，然后分别加入浓度为100、200、300mg/L CD的营养液培养6h，PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，收集细胞Western-Blot检测。
[0040]图11为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗3次，37°C培养箱中培养4h，PBS洗3次，然后分别加入浓度为100、200、300mg/L CD的营养液培养6h，PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，收集细胞Western-Blot检测。
[0041]图12为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并加入CD，4°C孵育2h，PBS洗3次，共聚焦检测CD抑制病毒吸附于细胞膜表面。
[0042]图13为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV 37°C培养24h，PBS洗3遍，加入CD继续培养2h或者4h，收集细胞上清和细胞做qRT-PCR检测。
[0043]图14为在MOI=0.1的HP-PRRSV感染的Marc-145细胞培养5h，然后加入200mg/LCD处理36h，收集细胞做qRT-PCR检测。
[0044]图15为在MOI=0.1的HP-PRRSV感染的Marc-145细胞培养5h，然后加入200mg/LCD处理36h，收集细胞做Western-Blot检测。
【具体实施方式】
[0045]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试齐U、方法和设备。
[0046]除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0047]本发明以下实施例的统计学分析:所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P〈0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
[0048]实施例1抗菌肽Cecropin D (⑶)的表达 1、抗菌肽Cecropin D (⑶)的合成
(I)基因序列合成:通过The Antimicrobial Peptide Database (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php)查找到抗菌肽⑶的氨基酸序列，根据毕赤酵母表达系统密码子偏嗜性优化密码子，设计引物，为了使表达产物分泌到细胞外且形成天然N端以保证其活性，设计引物时在5'端加入AAAAGA Kex2蛋白酶切位点。
[0049]设计的两对引物Pl和P2，P3和P4序列如下:
引物 Pl (SEQ ID N0.2 所示)
CCATTCAAGGAGTTGGAGAGAGCTGGTCAAAGAGTCAGAGACGCTATCATCTCCGCT ；
引物 P2 (SEQ ID N0.3 所示)
CAAAGCGGTAGCTTGAGCGACGGTAGCGACAGCTGGACCAGCGGAGATGATAGCGTC。
[0050]引物P3 (SEQ ID N0.4 所示)
CCCTCGAGAAAAGATGGAACCCATTCAAGGAGTTGGAG ；
引物 P4 (SEQ ID N0.5 所示)
GCTCTAGATTAGTTCTTAGCCAAAGCGGTAGCTTGAGCo
[0051]通过引物互为模版融合PCR合成⑶基因序列。
[0052](2)克隆转化:将合成得到的⑶基因序列克隆到酵母表达载体pGAPZ a A (购自Invitrogen公司)中，构建pGAPZ a A-CD重组酵母表达载体，线性化后300V、200Q电击15ms转化入酵母表达宿主菌SMDl 168 (购自Invitrogen公司),线性化酶为Avr II,构建重组酵母表达工程菌。
[0053](3)转化子筛选:经不同浓度Zeocin?的YPDS平板筛选高拷贝转化子，用于高效表达目的蛋白。
[0054](4)表达:用灭菌枪头挑筛选到的具有Zeocin?抗性的单菌落，于5mL的YPD液体培养基中进行一级培养，30°C，200 r/min振荡过夜，至0D_=2?6，即细胞处于对数生长期。取ImL —级培养液,重悬于50mL的YPD液体培养基中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时，离心收集上清。
[0055](5)纯化:His-tag柱子过柱纯化上清，纯化产物即为抗菌肽⑶，分装，_80°C保存。
[0056]抗菌肽CD的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，序列为:WNPFKELERAGQRVRDAIISAGPAVATVAQATALAKo
[0057]实施例2抗菌肽Cecropin D (⑶)的抗菌活性和细胞毒性 1、抗大肠杆菌DH5 α实验，验证抗菌肽CD的抗菌活性
⑶抗大肠杆菌活性实验方法采用标准琼脂孔穴扩散法。将Ε.coimm α 10 μ L与55°C的LB固体培养基30mL混匀后涂布平板，待其凝固后，用直径为3mm的灭菌的打孔器打孔，并分别加入100 μ L抗菌肽⑶，同时以Amp (100mg/mL)2 μ L作为阳性对照。37°C培养箱中培养12h，当能看到明显的抑菌圈时拿出并测量抑菌圈直径。
[0058]结果如附图1所示，抗菌肽CD能够明显抑制大肠杆菌DH5CI活性，能够看到明显的抑菌圈，表明CD具有抗菌活性。
[0059]2、抗菌肽⑶的细胞毒性实验
AlamarBlue (购自Invitrogen公司)作为活细胞代谢指示剂,在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。
[0060]用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞或者PAMs细胞至60?70%，弃去培养液，分别加入含⑶倍比稀释的营养液作用36h，设定PBS对照组，然后加入10%( v/V)比例AlamarBlue继续培养3h,使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作CD细胞毒性曲线(如附图2所示)。
[0061]以PBS对照组细胞活性作为100%，倍比稀释的⑶处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下CD相对细胞活性，由附图2可知，当CD浓度为300mg/L以下时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100% ;当⑶浓度为200mg/L以下时，其对PAMs细胞没有毒性，细胞活性100%。
[0062]实施例3抗菌肽⑶的抗病毒试验
1、在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以MOI=0.1和MOI=I接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37 °C继续培养5h。
[0063]PBS洗3遍，分别将浓度为100、200、300mg/L CD的2%胎