专利名称：：生产丁醇的菌剂及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生产丁醇的菌剂及其应用。
背景技术：
：丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等。近年来发现丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，且能与汽油以任意比混合，可以使用现有的石油管道运输方式，丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型生物燃料。丁醇可由发酵和石油化工合成法生产。20世纪50年代以后，由于石化合成技术的成熟导致发酵法生产丁醇不再具有经济竞争优势，丁醇发酵逐渐淡出市场。70年代后，随着石油危机的出现及国际原油价格的不断上涨，世界各国对能源安全和资源安全的忧虑日增，人们又重新开始关注丁醇的发酵生产。但仍有以下困扰丁醇生产的难题存在第一，底物费用高昂，发酵用的基质占丁醇生产成本的70%左右；第二，产物浓度低，由于丁醇的毒性，导致发酵过程中产物浓度很低，总溶剂不到2%;第三，产物回收费用高，由于产物浓度太低，故回收需要大量耗能。在上世纪四、五十年代，工业生产中生物丁醇的发酵使用的是大容积的批式发酵罐(从200n^到800m"，主要的发酵基质是8-10^的玉米粉和糖蜜。由于丁醇毒性的问题，在反应器中丁醇浓度达到13g/L时，发酵不得不终止。在生物丁醇分批发酵过程中，一般反应器中细胞浓度小于4g/L，由于极低的细胞浓度以及产物的抑制作用使反应器的生产强度很较低。分批补料发酵初始基质浓度较低，产物抑制减弱，使得细胞浓度和丁醇的生产强度有所提高。
发明内容本发明的目的是提供一种生产丁醇的菌剂及其应用。本发明所提供的一种生产丁醇的菌剂，它的活性成份包括丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)SMB-1(pMPl)禾口丙酮丁醇梭菌(C.acetobutyli固)SMB-1(pITG-B);所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-l(pMPl)是将红霉素抗性基因导入丙酮丁醇梭菌中构建的重组菌，所述丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)是将含有谷胱甘肽编码基因的DNA分子导入丙酮丁醇梭菌中构建的重组菌。其中，所述含有谷胱甘肽编码基因的DNA分子中自上游至下游依次为硫解酶启动子、谷胱甘肽编码基因和终止子。所述谷胱甘肽编码基因的核苷酸序列具体可为序列表中的序列l。所述硫解酶启动子的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2。所述红霉素抗性基因的核苷酸序列为序列表中的序列3。所述菌剂中，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)和所述丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)的集落形成单位数目比为(1-5):1。所述菌剂中，所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)和所述丙酮3丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)可分别独立包装，也可混合在一起。本发明生产丁醇的菌剂可为液体制剂，也可为固体制剂。在液体制剂中加入吸附剂即可获得固体制剂，如加入轻质碳酸钙或草炭等。所述所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)具体可为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)CGMCCNo.2800;所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pITG-B)具体可为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pITG-B)CGMCCNo.2797。本发明的另一个目的是提供一种生产丁醇的方法。本发明所提供的生产丁醇的方法，是用所述的菌剂发酵玉米淀粉生产丁醇。其中，所述玉米淀粉为玉米淀粉水溶液，所述玉米淀粉水溶液中所述玉米淀粉的质量百分含量为8-10%。所述发酵条件可为35-37t:，静置发酵。本发明的生产丁醇的菌剂的活性成分为丙酮丁醇梭菌(Clostridi丽cetobutyli固)SMB-1(pMPl)禾口丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)。丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)能够在胞内合成谷胱甘肽(GSH)，改变细胞生理代谢途径，提高对玉米粉培养基的利用效率，生长速率较快；丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)具有相对较好的耐受丁醇和发酵生产丁醇的能力。本发明的菌剂发酵玉米淀粉生产丁醇，发酵36小时，可得到13.3g/l的丁醇发酵液，平均生产强度达到0.37g/lh;发酵40小时，可得到14.5g/l的丁醇发酵液，平均生产强度达到0.36g/lh;且残渣凝结，发酵液澄清，有利于丁醇回收纯化。图1为pITG-B载体的结构示意图。图2为pIMPl载体的结构示意图。具体实施例方式下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。酵母粉购自英国0X0ID公司(目录号1023098)，蛋白胨购自英国0X0ID公司(目录号594566)，牛肉膏购自北京双旋微生物培养基制品厂，玉米粉购自普通超市。强化梭菌培养基(RCM)组成为每升含酵母粉3.0g、蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖5.0g、淀粉10.0g、乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH6.8。10%玉米淀粉培养基每100mL水中加入10.0g玉米淀粉，加热糊化。实施例1、制备生产丁醇的菌剂—、构建合成谷胱甘肽的丙酮丁醇梭菌采用细菌基因组提取试剂盒提取对数生长中后期的E.coliJM109的染色体DNA，以此为模板，用以下引物进行PCR扩增gshB-F:5，-ttcagaggatccATGATCAAGCTCGGCATCGTG-3，(化线部分为BamHI识别位点)；gshB-R:5，-aaggcgaattcTTACTGCTGCTGTAAACGTGCTTC_3，(划线部分为EcoRI识别位点)。采用TaKaRa公司的高效保真酶Primerstart进行PCR扩增，其PCR扩增程序为95°C3min;98。C10s、55。C15s、72。Clmin，30个循环；72。C10min。将所得的PCR产物采用PCR产物回收试剂盒纯化，连接到pGEM-TEasy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5a，对重组质粒进行测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示。随后用Fermetas公司的BamHI和EcoRI对纯化的PCR产物进行双酶切，37t:静置4h后，用DNA回收试剂盒纯化酶切后的PCR产物，与用同样酶双酶切的P頂P1-Pthl载体在T4DNA连接酶作用下连接，连接产物，转化E.coliJM109的高效感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选。菌落PCR验证阳性克隆子。阳性克隆子含有的重组表达载体命名为pITG-B(图1)。pIMPl-Pthl载体按照如下方法获得采用溶菌酶、SDS等试剂破坏细胞壁的常规细菌基因组提取方法，提取丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824(美国典型培养物保藏中心，美国专利US7432090)的基因组DNA，按照常规PCR方法，使用高保真DNA聚合酶Pfu扩增硫解酶启动子区域(Pthl)。表l.引物的核苷酸序列引物名称序列酶切位点(下划线)Pthl-FagtgtcgactatattgataaaaataataatagtgggSailPthl-RcgtggatccttctttcattctaactaacctccB咖HI将PCR扩增硫解酶启动子区域的产物克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-Pthl载体，测序，测序结果表明Pthl的核苷酸序列如序列表中序列2所示。SalI和BamHI酶切扩增得到的硫解酶启动子区域(Pthl)与经过同样酶切的pIMPl载体(图2)(pIMPl载体中含有红霉素抗性基因，其核苷酸序列为序列表中的序列3)(Mermelstein，L.D.，N.E.Welker，G.N.Be騰tt，andE.T.Papoutsakis.(1992).ExpressionofclonedhomologousfermentativegenesinClostridiumacetobutylicumATCC824.Bio/Technology.10:190-195)(中国科学院微生物研究所)连接构建载体pMPl-Pthl。pITG-B质粒转化到E.coliER2275(E.coliER2275含质粒pANl，pANl含来自枯草芽孢杆菌的①3T甲基化酶基因)(Mermelstein,L.D.andE.T.P即outsakis(1993)〃InvivomethylationinEscherichiacolibytheBacillussubtilisphagephi3TImethyltransferasetoprotectplasmidsfromrestrictionupontransformationofClostridiumacetobutylicumATCC824.〃Appl.Environ.Microbiol.59(4):1077-1081.)(中国科学院微生物研究所)中，并将转化后细胞涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，挑取单菌落富集培养，菌落PCR验证阳性克隆子，阳性克隆中pITG-B质粒即是甲基化的pITG-B质粒。厌氧环境下，取强化梭菌培养基(RCM)培养的对数生长中后期的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)SMB-1CGMCCN22287(中国专利:200810102673.2)培养液冰浴放置10min，4°C、4000rpm离心1Omin，厌氧环境下，去上清，加入足量的预冷的电转缓冲液(270mM蔗糖，5mMNaH2P04，pH7.4)，洗涤两次，并用电转缓冲液重悬，然后转入0.4cm的电转杯，放置在冰浴中冷却，加入甲基化的pITG-B质粒，冰浴放置2min，2.Okv脉冲电压和25iiF的电容进行电转化，随后将电转液加到RCM培养基中37t:复活培养4h，离心收集细胞，并将所得细胞涂布于含红霉素抗性的RCM琼脂培养基中，培养24-36h后，获得含有甲基化的PITG-B质粒丙酮丁醇梭菌，命名为丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)。pMPl载体按照上述方法转入丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1CGMCCN2.2287中，获得含有甲基化的pMPl质粒的丙酮丁醇梭菌，命名为丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pMPl)。三、制备生产丁醇的菌剂丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)分别在含有50yg/ml红霉素的强化梭菌培养基(RCM)(酵母粉3.0g/L、蛋白胨10.Og/L、牛肉膏10.0g/L、葡萄糖5.Og/L、淀粉10.Og/L、乙酸钠3.0g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH6.8)中培养至对数生长中期，然后按照如下任一方法制备发酵生产丁醇的菌剂1)丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pIMPl)与丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)按照1:lcfu/L混合，获得菌剂1;2)丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pIMPl)与丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)按照5:lcfu/L混合，获得菌剂2;3)丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pIMPl)与丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)按照2.5:lcfu/L混合，获得菌剂3。菌剂1、2和3分别接种到预装50ml10%玉米淀粉培养基的150ml厌氧瓶，37。C，培养36h，用液相色谱检测发酵36小时后的发酵液。液相色谱检测条件为样品前处理12000rpm离心lmin，取上清液，用0.22ym滤膜过滤；色谱条件:Agilent1200液相色i普仪，示差检测器；BioRadAminexHPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15。C;上样量10ii1;流动相为O.05mM112504，流速0.5ml/min。丁醇标准品购自Sigma公司(目录号4C006217);在如上色谱条件下标准品的保留时间为40.9分钟。以丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pMPl)作为对照1;以丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)作为对照2;丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1CGMCCN22287作为对照3。发酵36小时后丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)易于消化玉米粉培养基，而丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pMPl)的玉米粉利用效率相对较差。发酵生产丁醇的菌剂1、2和3的玉米粉利用率相对较高，发酵滤液也同时增加，澄清的发酵液有利于丁醇的回收。液相色谱检测36小时发酵液的结果如表2所示。表2.液相色谱检测36小时发酵液的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>四、制备生产丁醇的菌剂丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)中的一株菌已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2797。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)中的一株菌已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2800。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)CGMCCNo.2800和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)CGMCCNo.2797分别在含有50iig/ml红霉素的强化梭菌培养基(RCM)(酵母粉3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、葡萄糖5.0g/L、淀粉10.0g/L、乙酸钠3.0g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH6.8)中培养至对数生长中期，然后按照如下任一方法制备发酵生产丁醇的菌剂1)丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pIMPl)CGMCCNo.2800与丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)CGMCCNo.2797按照1:lcfu/L混合，获得菌剂A;2)丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pIMPl)CGMCCNo.2800与丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)CGMCCNo.2797按照5:lcfu/L混合，获得菌剂B;3)丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pIMPl)CGMCCNo.2800与丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)CGMCCNo.2797按照2.5:lcfu/L混合，获得菌剂C。菌剂A、B和C分别接种到预装3L10%玉米淀粉培养基的7L发酵罐，37°C，培养36h，用液相色谱检测发酵36小时后的发酵液。以丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pIMP1)CGMCCNo.2800作为对照1;以丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-l(pITG-B)CGMCCNo.2797作为对照2;丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1CGMCCN2.2287作为对照3。表3.菌剂发酵生产丁醇<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序列表〈110〉中国科学院微生物研究所〈120〉生产丁醇的菌剂及其应用〈130〉〈160>3〈210>1〈211>951〈212>DNA〈213>大肠杆菌(Escherichiacoli)〈400>1atgatc朋gctcggcatcgtgatggaccccg^agattcc60agttttgctatgttgctgga3gC3C3gCgtcgtggttacgaacttcactatetgg卿tg120ggcgatctgtatctgatcaatggtg朋gcccgcgcccatacccgcacgctg^cgtg^g180cag朋ctecgEl卿gtggttttcgttcgtcggtg朋C3ggatctgccgctggccgatctc240gatgtgatcctgatgcgteaagacccgccgtttgataccgagtttetctacgcgacctat300attctggaacgtgccgaagag￡l￡l￡lggg￡lCgctgatcgtta3C^gCCgC3gagcctgcgc360gactgt朋cg3g朋3Ctgtttaccgcctggttctctgactteacgccagaaacgctggtt420acgcgc朋te朋gcgcagct朋朋gcgttctggg3g朋3Ccattcttaag480ccgctggacggtetgggcggcgcgtcgattttccgcgtga■g33ggCg3tccaaacctc540ggcgtgattgccgaaaccctgactgagcatggcactcgctactgcatggc600ctgccagccatte朋gatggCg3C3朋CgCgtgctggtggtggatggcgagccggtaccg660tactgcctggcgcgtattccgc鄉ggggcga朋cccgtggcaatctggctgccggtggt720cgcggtgaacctcgtccgctg3Cgg朋3gtg3Ctgg朋朋tcgcccgtcagatcgggccg7803CgCtg朋3g朋a朋gggctgatttttgttggtctggatatcatcggcgaccgtctgact840gaaattaacgtcaccagcccaacctgtattcgtgagattgaagcagagtttccggtgtcg900atcaccggaatgttaatggatgccatcgaagcacgtttacagcagcagtaa951〈210>2〈211〉150〈212>DNA〈213〉丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)〈400>2tatattgatategtgggtetcgteteaatt60agggate朋ctetggaacttttga皿tggtttetctgtteccccgtetca1203朋ttteggaggttegtteg150〈210>3〈211>735〈212>DNA〈213〉〈400>33tg朋Cg3g3aactttetteteatetegat60c皿3teteagcatgateatetctttgaaatCggCtC3gg31203朋gggC3ttttecccttgatcgteactgc180gaccate朋taaacttgttgtttccaagtt240tte朋c朋ggatetettgcagttteaatttaatetttggt300aateteccttateacateagtecggateteatecgc皿皿ttgtttttgategtetegct360gatgagatttattteatcgtgg皿tecgggtttgcteaaatec皿皿cgc420tcattggcattettttteatggc卿agttgatetttcteggttcc皿ga■gaatettttcatccteaaccagctcactte540tc朋g朋tette皿cag皿gtcgttetgaa600attcctteaa660attgacgatttegctttgaacaattcttetctcttttcaategctete皿720ttettteateagtea73权利要求一种生产丁醇的菌剂，它的活性成份包括丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMP1)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pITG-B)；所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMP1)是将红霉素抗性基因导入丙酮丁醇梭菌中构建的重组菌，所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pITG-B)是将含有谷胱甘肽编码基因的DNA分子导入丙酮丁醇梭菌中构建的重组菌。2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于所述含有谷胱甘肽编码基因的DNA分子中自上游至下游依次为硫解酶启动子、谷胱甘肽编码基因和终止子。3.根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于所述谷胱甘肽编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1;所述硫解酶启动子的核苷酸序列为序列表中的序列2。4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于所述红霉素抗性基因的核苷酸序列为序列表中的序列3。5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)SMB-1(pMPl)禾口所述丙酮丁醇梭菌(Clostridi丽cetobutyli固)SMB-1(pITG-B)的集落形成单位数目比为(1-5):1。6.根据权利要求5所述的菌齐U，其特征在于所述菌剂中，所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pMPl)和所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pITG-B)分别独立包装。7.根据权利要求6所述的菌齐U，其特征在于所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMPl)CGMCCNo.2800;所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)SMB-1(pITG-B)为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-l(pITG-B)CGMCCNo.2797。8.—种生产丁醇的方法，是用权利要求1至7中任一所述的菌剂发酵玉米淀粉生产丁醇。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述玉米淀粉为玉米淀粉水溶液，所述玉米淀粉水溶液中所述玉米淀粉的质量百分含量为8-10%。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述发酵条件为35-37t:，静置发酵。全文摘要本发明公开了一种生产丁醇的菌剂及其应用。所述生产丁醇的菌剂，它的活性成份包括丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMP1)和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)；所述丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMP1)是将质粒pIMP1导入丙酮丁醇梭菌中构建的重组菌，所述丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB-1(pITG-B)是将含有谷胱甘肽编码基因的DNA分子导入丙酮丁醇梭菌中构建的重组菌。用本发明的菌剂发酵玉米淀粉生产丁醇，其产率高，且发酵液澄清，易于丁醇回收纯化。文档编号C12R1/145GK101760440SQ20081024101公开日2010年6月30日申请日期2008年12月24日优先权日2008年12月24日发明者张延平,朱林江,李寅,王少华申请人:中国科学院微生物研究所