专利名称：一种曲霉表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种曲霉表达载体及其应用。
背景技术：
遗传操作系统是进行基因与蛋白质功能研究必不可少的。目前已有一些遗传操作系统可用于烟曲霉，如以乳清酸核苷_5-磷酸脱羧酶基因pyrG为筛选标记的pCDA14。 pCDA14转化烟曲霉尿苷/尿嘧啶营养缺陷株CEA17后可在不含尿苷/尿嘧啶的培养基上筛选自养型转化子。虽然该载体还存在转化率和重组率不高的问题，仍是目前研究烟曲霉基因功能的重要手段。但迄今为止还没有一个较好的载体系统可用于在烟曲霉中表达蛋白质。
发明内容
本发明的目的是提供一种曲霉表达载体及其应用。 本发明所提供的曲霉表达载体，命名为pchiGFP-S载体，包含原核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒从上游至下游依次包括几丁质酶基因启动子、外源基因和终止子。 其中，pchiGFP-S载体的几丁质酶基因启动子和外源基因之间还可含有信号肽序列。含有信号肽序列的pchiGFP-S载体命名为pchiGFP载体，pchiGFP载体在宿主菌中表达的外源蛋白可分泌到细胞外。所述信号肽序列具体可为序列表中序列1自5'末端第1704-1817位。所述几丁质酶基因启动子的核苷酸序列具体可为序列表中序列1自5'末端第l-1703位。所述终止子具体可为构巢曲霉的TrpC基因终止子。所述筛选标记基因可为氨苄青霉素抗性基因。所述原核复制起点可为PBR322的复制起始点。
含有所述载体的重组菌也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种生产蛋白的方法。 本发明所述的生产蛋白的方法，是将所述的表达载体导入曲霉中获得重组菌，培养所述重组菌生产目的蛋白。 本发明的曲霉表达载体能够使外源基因在烟曲霉表达，且可以无需诱导，利用曲霉生产目的蛋白。本发明的曲霉表达载体为烟曲霉基因蛋白功能的研究提供了一个很好的表达系统。
图1为PCR鉴定结果。 图2为荧光显微镜观察GFP绿色荧光。 图3为SDS-PAGE检测发酵上清液中的GFP蛋白。
具体实施例方式
实施例1、构建烟曲霉表达载体
—、构建pchiGFP表达载体提取烟曲霉YJ407 CGMCC 0386 (ZL99105415. 6)的基因组DNA，基因组DNA的提取
方法参照《分子克隆实验指南》。 设计引物ChiG-N和ChiG-C， ChiG-N和chiG-C的核苷酸序列如下 引物ChiG-N :5' -GGAATTCGAGCCATTGCCTACATCCTTCAC-3'(划线部分为EcoRI酶识
别位点)； 引物ChiG-C :5' -GGGGTACCGCGCGCGCCTCCAGATCAGTAC-3，(划线部分为Kpnl酶识别位点)。 以烟曲霉基因组DNA为模板PCR扩增片段A，片段A包含烟曲霉几丁质酶基因(AfchiBl)的1. 5kb启动子(PehiB1)和N-端信号肽。 PCR反应体系10Xpyrobest Buffer 5 ii L，弓| 物ChiG-N和ChiG-C各1 ii L(20 ii mol/L) ， DNA模板0. 5 ii L (1 ii g/ ii L) ， dNTPs (各2. 5mM) 4 ii L，pyrobestenzyme (TAKARA， 5U/ u L) 0. 5 u L，最后补水至50 u L。 反应条件94。C热变性3min ;94。C变性lmin，50。C退火45s，72。C延伸lmin30s，共30个循环；72。C最后延伸10min。 PCR产物(片段A)用DNA凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
片段A连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒pGEM-ChiBl，并转化大肠杆菌DH5 a ，对重组质粒pGEM-ChiBl进行测序，测序结果表明片段A的核苷酸序列如序列表中序列1所示。 用Kpnl和BamHI双酶切消化pMCB17载体(Fernandez-Abalos， J. M. ， et al.，Plant—ad即ted green fluorescent protein is a versatile vital reporter forgeneexpression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus,Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 1998. 27 (1) :p. 121-30)(中国科学院微生物研究所)，用北京博大泰克生物技术公司的胶回收试剂盒购回收800bp左右的片段，得到经Kpnl/BamHI消化的片段B，片段B包含GFP2-5基因。 片段B连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5 a ，对重组
质粒进行测序，测序结果表明片段B的核苷酸序列如序列表中序列3所示。 用BamHI和HindlII双酶切消化PAN7-l载体(Punt，P. J. ， et al. transformation
of Aspergillus based on the hygromycin B resistance markerfrom Escherichia
coli.Gene， 1987. 56(1) :p. 117-24)(中国科学院微生物研究所)，回收其中700bp左右的片
段，得到经BamHI/Hindlll消化的片段C，片段C包含构巢曲霉的TrpC终止区。 片段C连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5 a ，对重组
质粒进行测序，测序结果表明片段B的核苷酸序列如序列表中序列2所示。用EcoRI/Kpnl双酶切的片段A，用KpnI/BamHI消化的片段B以及BamHI/Hindlll
消化的片段C与EcoRI/Hindlll酶切的pUC19载体连接，构建重组载体pchiGFP。 二、构建pchiGPF-S表达载体 提取烟曲霉YJ407 CGMCC 0386的基因组DNA，基因组DNA的提取方法参照《分子克隆实验指南》。 设计引物ChiG-CS，引物ChiG-CS的核苷酸序列如下
弓I物ChiG-CS :5， -GGGGTACCGCTGTTGTCGTTTCAGTCGAGCTTG-3，(划线部分为Kpnl酶识别位点)。 以烟曲霉基因组DNA为模板PCR扩增片段D，片段D仅包含烟曲霉几丁质酶基因(AfchiBl)的启动子(PAiB1)。 PCR反应体系IOXPCR Buffer 5 ii L，弓|物ChiG-N和ChiG-CS各1 ii L， DNA模板0. 5ii L(l ii g/ii L) ，d證s(各2. 5mM)4ii L，pyrobest enzyme (TAKARA， 5U/ii L) 0. 5 ii L，最后补水至50ii L。 反应条件94。C热变性3min ;94。C变性lmin，50。C退火45s，72。C延伸lmin30s，共30个循环；72。C最后延伸10min。 PCR产物(片段D)用DNA凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
片段D连接到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒pGEM-ChiGS，并转化大肠杆菌DH5a ，对质粒pGEM-ChiGS进行测序，测序结果表明片段D的核苷酸序列如序列表中序列1中自5'末端第1-1703位。 用EcoRI和Kpnl酶切的片段D与EcoRI和Kpnl酶切的载体pChiGFP连接，获得
重组载体pchiGPF-S。 三、烟曲霉中GFP的表达 pCDA14(d' Enfert， C. ， Selection of multiple disruption eventsinAspergillus fumigatus using the orotidine-5' -decarboxylase gene， pyrG， asaunique transformation marker. Curr Genet， 1996. 30 (1) :p. 76-82)(中国科学院微生物研究所)与pchiGPF-S， pCDA14与pchiGFP分别共转化烟曲霉CEA17 (d' Enfert， . CurrentGenetics, 1996， Jun ;30(1) :76-82.)(中国科学院微生物研究所)，方法如下:
接种108-l()9烟曲霉CEA17孢子于50ml YG培养基(酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L，琼脂15g/L)中，37°C ，培养5小时，离心6000rpm， 10分钟，回收孢子，用灭菌水洗二次，加入40ml细胞壁消化液(硫酸铵52. 8g/L，柠檬酸钾16. 2g/L，酵母提取物5g/L，蔗糖5g/L，4g/L Lysing enzyme (Sigma) ， pH 6. 0) ， 33°C ， 100rpm缓慢裂解3小时。离心去上清，用洗涤液(硫酸铵52. 8g/L、蔗糖10g/L，pH 6. 0)洗二次。原生质体悬于lml储存液(KC1 44. 4g/L、CaCl2 7.35g/L、M0PS 2g/L，pH 6.0)，4。C保存。取100 ii 1原生质体与4 ii g pCDA14禾P4iigpchiGFP(或者pChiGFP-S)再加入50ii1 PEG 6000溶液(PEG6000 250g/L、CaCl2 7. 35g/L、KC144. 4g/L、Tris 1.21g/L，pH 7. 5)，冰上放置15分钟后，加入lml PEG 6000溶液，室温20分钟。37t:保温Plate溶液(琼脂糖3. 5g/L、硫酸铵52. 8g/L、蔗糖342g/L，溶于100ml MM)，保持液体状态，加入3. 5ml混匀，铺在高渗固体选择培养基(琼脂15g/L，硫酸铵52. 8g/L，蔗糖340g/L，溶于1000ml匪)上，30。C培养2_3天，看到明显的菌落后，用匪[盐溶液20m1/L [氯化钾26g/L，七水合硫酸镁26g/L，磷酸氢二钾76g/L，微量元素50ml/L (十水合硼酸钠40mg/L，五水合硫酸铜400mg/L， 二水合硫酸亚铁800mg/L， 二水合硫酸锰800mg/L， 二水合钼酸钠800mg/L，七水合硫酸锌8g/L)，葡萄糖10g/L、谷氨酸钠lg/L， p朋.8]再筛选，快速提取DNA进行PCR，扩增GFP以及P。hiB1进行鉴定(图1)。以pCDA14与pUC19载体转化烟曲霉CEA17作为对照。 图1A为PCR鉴定pCDA14和pchiGFP共转化的烟曲霉CEA17， 1为PCR扩增PchiB1，2为PCR扩增GFP， 3为DNA分子量标准；图IB为PCR鉴定pCDA14和pchiGPF-S共转化的烟曲霉CEA17， 1为PCR扩增PchiB1， 2为PCR扩增GFP， 3为DNA分子量标准。
PCR鉴定为阳性的菌的lOiU孢子(lXl()8个/ml)分别接于200ml液体CM中， 37t:，200rpm培养。对转化菌株在菌丝生长初期(7h)、对数生长中期(30h)、平台期(60h) 和衰亡期(140h)进行GFP表达分析。 CM由如下物质组成葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物lg/L，酶水解酪素 1. 5g/L，盐溶液20ml/L[氯化钾26g/L，七水合硫酸镁26g/L，磷酸氢二钾76g/L，微量元素 50ml/L (十水合硼酸钠40mg/L，五水合硫酸铜400mg/L， 二水合硫酸亚铁800mg/L， 二水合硫 酸锰800mg/L， 二水合钼酸钠800mg/L，七水合硫酸锌8g/L) ] ， pH 6. 8。
荧光显微镜观察GFP绿色荧光。 荧光显微镜观察结果如图2所示，pchiGFP-S转化的菌株中绿色荧光在菌丝生长 初期开始出现，在对数生长期和平台期逐渐增强，并在衰亡期达到最大，说明pchiGFP-S转 化的菌株中GFP的表达受生长周期调控。pchiGFP转化的菌株在对数期、平台期及衰亡期的 菌丝细胞内只有微弱的荧光信号。PCDA14与pUC19载体转化的菌株则无任何荧光信号出 现。 SDS-PAGE检测菌丝生长初期(7h)、对数生长中期(30h)、平台期(60h)和衰亡期 (140h)发酵上清液中的GFP蛋白。 SDS-PAGE检测结果如图3所示，表明pchiGFP-S转化的菌株发酵上清液中没有检 测到GFP蛋白，pchiGFP转化的菌株发酵上清液中GFP蛋白在菌丝生长初期开始出现，并随 培养时间的延长而逐渐增强，而且GFP的分泌与几丁质酶AfChiBl的分泌同步。pCDA14与 pUC19载体转化的菌株无任何荧光信号出现。 图3中，"EC"代表胞外蛋白，"IC"代表胞内蛋白，"M"代表蛋白分子量标记。
上述实验结果说明pchiGPF-S和pchiGPF载体中的目的基因(GFP)可在烟曲霉中 表达。 序列表 〈110〉中国科学院微生物研究所 〈120〉一种曲霉表达载体及其应用 〈130>CGGNARW82096 〈160>3 〈210>1 〈211>1817 〈212>DNA 〈213〉曲霉属烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
〈400〉 1 aaagcgacac ctacggatag aagtgttcta atgacaagcg gcttgttcaa gctatttagc 60
tgtcctcaac tggaaagatt agaacagctt cagacattaa ctagatatgc ctccctgcaa 120
cagcctcgct attgggaagt tcattaatta tgaacatcgc agccttttct aatctactcc 180
gtetccttcc ctctacttat gacttgtttt tccateactg agaagcgaca tgaaacggac 240
tttatggatt cactagaaaa gctaatggat acagaatctc gacatccagc catggcaggt 300
accctggttt ataatgagcc attgcctaca tccttcacaa ctcaattgtg tttttattat 360
60067]tcctgctttctcttccggtagcaggccgacgC3tg3gtgC gtgtCgtctC Cg3皿C^3C420
0068]tggctaactatttcctgattacggcctcgt ggtcatcggt gtgattctca480
0069]tcatctggacggtttectggtttatcaaggggcag^gag attctcacgt cagratgtcc540
0070]tctcgacaacgttaactcatCtgC3tCgCt gtg3皿C3gC ggcagacc皿600
0071]tctgcactgatgcactggatgtg鄉tectctctttctgt gccattgacg gacteggtat660
0072]caaatcggttC3gCgg3g^gttctcaacttcatgagtat gacacgtgcg agctectcca720
0073]tatgttcgcctctcagacattectgactccte^tgg^g gac3cgc^3 gte皿ccteg780
0074]atgg^tggcgtccccccatatttcgactgacacgtetgc atcgg^teg ctgacc3gg3840
0075]■teggggttcggcagcatcaccccgtactgcactccatc gcgcggggtc aaccccagtg■
0076]tgtcttcaagaccctgtcagacaacattgg tatgttacat tacattactc960
0077]皿gggttg皿皿gccgteatctcggctgttgccaattcte ctgcccagtt gacaaaatga1020
0078]tegcgggagtgategtgacatcccttgggctcggcggcaa cggtcacgtc gcategcgtc1080
0079]acgctccctttcagctgctgcaaaccccttttgacccatt皿3C3gtgga atgateaccc1140
0080]C皿3gggC3tgtgcttcgatatecacgtcctcatgtcgtt acatcgaact gagattecgg1200
0081]agacccctcacgcgacteagcgccttggcgaccctccacg cggggagtca cattgccttt1260
0082]tctgcaccaagtgaagctctateagcccag ctccctttca tctgccgacg1320
0083]tcgcatgcaggatggtc郷tecgtga皿cctggcctgtg actcgagatt actgcaagat1380
0084]cgacggccgtcggatcaccggaacctggttcttcactgaa tcgctgcctt atctcttcat1440
0085]ctgatttgatccctetcttgtgacacgttgcratragggt tectegtgat agggctctgg1500
0086]atctecaacgcgacgatgggacttgaccag ggagcgacgc tgtgtggtga1560
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0088]agcgtttcttgtggtettteC皿tgC3C3gaacgactcat ccgacaagct catecatcga1680
0089]caagctcgacacaatgcgctttgcaacttc caccatcgtc aaggtcgccc1740
0090]ttctgcttegcagtctttgtgtcgacgccgcagtgatgtg g皿tcgtgat 3ccagtegte1800
0091]ctgatctggaggcgcgc1817
0092]〈210〉2
0093]〈211〉769
0094]〈212〉DNA
0095]〈213〉曲霉属烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
0096]〈400〉2
0097]acttaacgtttcaaacagcttgacg^tct ggateteaga tcgttggtgt60
0098]cgatgtcagctccggagttgtgttcaggat ctcgataaga tacgttcatt120
0099]tgtccaagcagc^agagtgccttctegtgattt皿tegc tccatgtc^ c^g^te皿180
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〈210〉3 〈211〉721〈212〉DNA〈213〉〈400〉3atgagte皿ggag皿g皿cttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattegatggt60gatgtteatgttctgtcagtgg卿gggtg皿ggtgatgc皿catecgg3120aaacttecccttgcactectgg皿皿ctecctgttccatggccaacactt180gtcactectttcacctetggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatetg皿gcgg240cacgacttcttc皿gagcgccatgcctgagggatecgtgc郷卿ggaccatcttcttc300皿ggacgacggg皿ctec皿gacacgtgctg皿gtc皿gtttg郷g卿caccctcgtc360agctte郷gaatcgatttc皿gg郷acggaaacatcctcggccac皿g420ttgg皿tecaactecaactcccacaacgtetecatcatggCCg3C皿gC3a皿g皿cggc■acttcaagacccgccac皿catcg^gacggcggcgtgcaactcgctgat540cattetcaac皿ttggcgatggccctgtcctttteccagacaaccattec600ctgtccacacaatctgccctttcg^agatccc皿cga皿catggtcctt660cttgagtttgteacagctgcatg皿cteteca^teaccg720g721
8
权利要求
一种表达载体，包含原核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒从上游至下游依次包括几丁质酶基因启动子、外源基因和终止子。
2. 根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述几丁质酶基因启动子和所述外源基因之间还含有信号肽序列。
3. 根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述信号肽序列为序列表中序列1自5'末端第1704-1817位。
4. 根据权利要求1至3中任一所述的表达载体，其特征在于所述几丁质酶基因启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第1-1703位。
5. 根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述终止子为构巢曲霉的TrpC基因终止子。
6. 根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因。
7. 根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述原核复制起点为pBR322的复制起始点。
8. 含有权利要求1至7中任一所述的表达载体的重组菌。
9. 权利要求1至7中任一所述的表达载体、权利要求8所述的重组菌在生产蛋白中的应用。
10. —种生产蛋白的方法，是将权利要求1至7中任一所述的表达载体导入曲霉中获得重组菌，培养所述重组菌生产目的蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种曲霉表达载体及其应用。该表达载体，包含原核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒从上游至下游依次包括几丁质酶基因启动子、外源基因和终止子。本发明还公开了一种生产蛋白的方法，该方法是将所述的表达载体导入曲霉获得重组菌，培养所述重组菌生产目的蛋白。本发明的曲霉表达载体能够使外源基因在烟曲霉表达，利用曲霉生产目的蛋白。本发明的曲霉表达载体为烟曲霉基因蛋白功能的研究提供了一个很好的表达系统。
文档编号C12N1/15GK101760471SQ200810240800
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者欧阳浩淼, 金城, 陈晓敏 申请人:中国科学院微生物研究所