一种定量聚合酶链式反应检测装置及其制备方法

专利名称：一种定量聚合酶链式反应检测装置及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片技术，具体涉及一种基于生物芯片和单片机 5技术的定量聚合酶链式反应测量装置。
背景技术：
PCR(聚合酶链式反应)是1985年美国Cetus公司的K. B. Mullis 和R.K.Saiki等人发明的一种特异性DNA体外扩增技术。这种技术 的实质是体外酶促合成特异性的DNA片断，即无细胞分子克隆系
io 统，这一技术称为Polymerase Chain Reaction,简称PCR (聚合酶链 式反应)。PCR可以非常简便快速地采取体外扩增的方式从微量生物 材料中获取大量特定的遗传物质。PCR技术原理是将待扩增的DNA 作模板，用来与模板正链和负链互补的两种寡聚核普酸(通过生物样 品溶液获得)做引物，经过模板DNA的定性、模板与引物结合复性
15 以及在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应等三步循环来扩增两 引物间的DNA片段。每一循环的DNA产物经变性后又成为下一个 循环的模板DNA。整个工作过程需要在三种不同温度下(即变性、 退火、延伸)循环完成，每经历一次循环可使基因增加一倍，经过 30次左右的循环，就能将待测基因扩增IOO万倍以上。
20 自Cetus公司第一台PCR扩增测量仪问世以来，经过几代的发
展，出现了目前被广泛应用的定量PCR测量装置(简称qPCR)。
qPCR系统巿场前景广阔，在至少以下几个方面具有广阔的前 景药物筛选和新药开发、疾病诊断基因芯片、环境保护、重大疫情 的第一时间现场快速检测。例如03年的非典和近期阜阳地区爆发的
25手足口病这种大规模传染病突发的时候，需要第一时间进入现场找出 病源，这样对qPCR测量仪器的便携性和快速性提出了很高的要求。为了满足这些应用，微型化qPCR测量装置是重要的发展方向。
目前已经有将微流体控制模块和qPCR系统集成于单一芯片的集 成qPCR芯片，微流体控制模块的功能是加载及分配生物样品溶液， 包括微流体沟道及反应阵列芯片。这样集成的目的是实现一次性低成 5 本快速测量。但是，由于将生物样品溶液的加载、分离、分配、混合、 测量的所有模块，及微流体沟道及反应阵列的相关微伐、微泵、控制 和测量部件都集成于单一芯片，系统十分复杂，加工难度很大，很难 发挥微加工的批量化低成本优势，从而使一次性使用的芯片成本很 高，很难实现低成本实用化的目标。
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发明内容
本发明的目的是提供一种新的定量聚合酶链式反应测量装置及 其制备方法，该装置釆用三模块化结构，降低了使用的成本，同时解
决了微型化qPCR将反应单元、加热单元、测量单元制作在一个芯片 上而造成的加工难度大、造价过高等问题，适用于便携式高灵敏生物 15 传感应用。
为实现上述目的，本发明釆用如下技术方案 一种定量聚合酶链式反应测量装置，该装置中用于提供PCR反应 所需温度的加热单元、用于加载及分配生物样品溶液使其与生物样本 DAN发生PCR反应的微流体单元、用于采集DAN扩增产量的电信号 20的测量单元被集成为三个模块，所述三个模块釆用叠合结构连接并相 互对准。
优选地，所述三个模块釆用翻盖式叠合结构，集成所述加热单元 的模块处于底层，集成所述微流体单元的模块处于中间层，集成所述 测量单元的模块处于顶层。
25 优选地，该装置还包括控制电路模块，其与加热单元连接用于对
所述温度进行实时检测与控制，所述控制电路模块与测量单元连接，
用于根据测量单元釆集的所述电信号来获取DAN扩增产量。优选地，集成所述加热单元的模块包括集成微加热器及温度传
感器阵列的第一芯片；封装所述第一芯片的第一外壳；其中所述第一
芯片上的微电极通过引线与第一外壳内的电极连接。
优选地，集成所述微流体单元的模块包括集成微流体沟道及反
5应阵列的第二芯片；封装所述第二芯片的第二外壳；其中所述第二芯
片上的微电极通过引线与第二外壳内的电极连接。
优选地，集成所述测量单元的模块包括集成微密封仓及电化学
电极阵列的第三芯片；封装所述第三芯片的第三外壳；其中所述第三
芯片上的微电极通过引线与第三外壳内的电极连接。 io优选地，该装置还包括控制电路模块，所述第一外壳、第二外壳
和第三外壳分别被安装在不同封装插座板上，其中
安装第一外壳的封装插座与控制电路模块的温度控制电路连接； 安装第三外壳的封装插座通过排线与控制电路模块的电化学检
测电路相连接。
15 优选地，所述控制电路模块内存储有设定温度T，若提供给加热
单元的温度Tx与T不相等，所述控制电路模块利用PID算法对偏差 Tx-T进行运算得到调节量，利用所述调节量对提供给加热单元的温 度进行调节。
本发明还提供了 一种定量聚合酶链式反应测量装置的制备方法， 20 该方法包括以下步骤
将用于提供PCR反应所需温度的加热单元、用于加载及分配生 物样品溶液使其与生物样本DAN发生PCR反应的微流体单元、用于 采集DAN扩增产量的电信号的测量单元集成为三个模块； 将所述三个模块釆用叠合结构连接并相互对准。 25 优选地，所述集成为三个模块的步骤包括以下子步骤
将构成加热单元的微加热器及温度传感器阵列集成到第一芯片； 利用第一外壳封装所述第一芯片，并将第一芯片上的微电极通过引线与第一外壳内的电极连接；
将构成微流体单元的集成微流体沟道及反应阵列一起集成到第
二芯片；
利用第二外壳封装所述第二芯片，并将第二芯片上的微电极通过
5引线与第二外壳内的电极连接；
将构成测量单元的微密封仓及电化学电极阵列集成到第三芯片； 利用第三外壳封装所述第三芯片，并将第三芯片上的微电极通过 引线与第三外壳内的电极连接；
将第一、第二和第三外壳分别安装在三个不同封装插座板上； io 将安装第一外壳的封装插座板与控制电路模块中的温度控制电 路连接；
将安装第三外壳的封装插座通过排线与控制电路模块中的电化 学检测电路相连接。
利用本发明提供的定量聚合酶链式反应测量装置及其制备方法， 15 具有以下有益效果
1) 解决了微型化qPCR将微流体单元、加热单元、测量单元制作 在一个芯片上而造成的加工难度大、造价过高等问题，降低了使用的 成本；
2) 采用的叠合结构适用于便携式高灵敏生物传感应用；
20 3 )每次使用，只要更换承载生物医学样品的微流体模块即可。


图l为本发明定量聚合酶链式反应测量装置闭合工作时的密封结 构图2为本发明定量聚合酶链式反应测量装置中的三个集成芯片结 25 构示意图3为本发明定量聚合酶链式反应测量装置各模块釆用层叠式模 块组合的结构图；图4为本发明定量聚合酶链式反应测量装置的立体装配图； 图5本发明定量聚合酶链式反应测量装置的控制电路模块图。
图中1、第一芯片；2、第二芯片；3、第三芯片；4、第一模块；5、 第二模块；6、第三模块；7、第一封装插座；8、第三封装插座；9、 5控制电路模块；10、第一外壳；11、第三外壳。
具体实施例方式
本发明提出的定量聚合酶链式反应测量装置及其制备方法，结合 附图和实施例说明如下。
本发明是为克服传统定量聚合酶链式反应qPCR测量装置及目前
10已经存在的qPCR测量装置的缺点，提出一种新型的三模块微型化定 量聚合酶链式反应测量装置(后面简称3MW^PC7 )及其制备方法。 该装置中包括三个模块，这三个模块分别为用于提供PCR反应所需 温度的加热单元被集成制作后的第一模块4;用于加载及分配生物样 品溶液使其与生物样本DAN发生PCR反应的微流体单元被集成制作
15后的第二模块5;用于采集DAN扩增产量的电信号的测量单元被集成 制作后的第三个模块6，该三个模块釆用叠合结构连接并相互对准。 实施例l
本实施例中加热单元由微加热器及温度传感器阵列构成，微加热 器用于加热为PCR反应提供其所需温度，温度传感器阵列用于实时
20 进行温度釆集；微流体单元由集成微流体沟道及反应阵列构成，微流 体沟道中连接有微泵和阀，利用微流体沟道实现生物样品溶液的加 载、分离、混合，利用反应阵列实现进行PCR反应实现生物样本DAN 扩增；测量单元由微密封仓及电化学电极阵列构成，微密封仓由图形 化的PDMS ( Plant Design Management System )密封层构成，测量单
25元设置在微流体单元上方，微密封仓提供了装置闭合工作时的密封结 构(见图1)，用于防止生物样品溶液的污染和蒸发，电化学电极阵 列用于采集DAN扩增产量的电信号。如图3所示，三个模块釆用翻盖式叠合结构，集成加热单元的第 一模块4处于底层，集成微流体单元的第二模块5处于中间层，集成
测量单元的第三模块6处于顶层。该装置还包括控制电路模块9，控 制电路模块9与加热单元连接，用于对加热单元釆集的温度进行实时 5检测与控制，控制电路模块9与测量单元连接，用于根据测量单元采 集的电信号来获取DAN扩增产量。
如图1 4所示，本实施例中第一模块4包括集成微加热器及 温度传感器阵列的第一芯片1;封装第一芯片1的第一外壳10,第一 芯片1上的微电极通过引线与第一外壳10内的电极连接；安装第一
io外壳11的第一封装插座板7,该第一封装插座板7与控制电路模块 IO的温度控制电路连接。第二模块5包括集成微流体沟道及反应 阵列的第二芯片2;封装第二芯片2的第二外壳(图中未示出)，第 二芯片2上的微电极通过引线与第二外壳内的电极连接；安装第二外 壳的第二封装插座板(图中未示出)。第三模块3包括集成微密封
15仓及电化学电极阵列的第三芯片3;封装第三芯片3的第三外壳11， 第三芯片3上的微电极通过引线与第三外壳3内的电极连接；安装第 三外壳11的第三封装插座板8，第三封装插座板8通过排线与控制 电路模块9的电化学检测电路相连接。如图3所示，三个模块采用翻 盖式叠合结构连接，第一模块4处于底层，第二模块5处于中间层，
20第三模块6处于顶层，当三个模块层叠在一起时，便形成了一个微型 化qPCR测量装置(见图2),三个模块层叠在一起时，保证将三个模 块关闭时第一芯片1、第二芯片2和第三芯片3的位置相互对准。
本发明中三个模块的层叠方式不限于翻盖式层叠方式，三个模 块在实际应用中，也可分别固定在支架上，与相应的电学信号提取及
25控制电路模块9相连接，釆用翻盖及相应的多种对准方式，使三个模 块灵活地形成一体，从而形成一个3M、《尸Ci 系统，对样品进行处理、 取样和分析。在每次使用时，只要更换承载生物样品溶液的第二模块5即可。
本实施例中的控制电路模块9具体采用单片机实现，如图5所示 为本实施例中控制部分结构，第一模块4中的温度传感器阵列和微加
热器阵列通过模拟信号选通电路接入单片机，通过i/o扩展选通电路
5连接A/D釆样芯片和D/A釆样芯片，该装置工作时由第一芯片l上 的温度传感器对第二芯片上反应阵列的温度进行釆样和AD转换，将 测量结果Tx送入单片机，单片机将输入的温度值一方面通过接口电 路送入上位机，另 一方面与内部指定单元的给定温度值T进行比较。 如果Tx不等于T,则按照设计好的PID算法对偏差(Tx-T)进行运
io算、处理，得到一个调节量，单片机再将此调节量通过DA转换得到 矩形波脉冲，送入微加热器，控制第二芯片2上反应阵列的温度。第 三芯片2上的电化学电极阵列将釆集的电信号AD转换后发送到单片 机，单片机根据所釆集的电信号获取PCR反应中扩增的DAN产量， 根据不同情况发出控制信号经AD转换后，通过控制微泵和阀来控制
15第二芯片2上的集成微流体沟道。
本实施例中定量聚合酶链式反应测量装置的制备方法包括以下 步骤将构成加热单元的微加热器及温度传感器阵列集成到第一芯片 1;利用第一外壳IO封装第一芯片1,并将第一芯片l上的微电极通 过引线与第一外壳10内的电极连接；将构成微流体单元的集成微流
20体沟道及反应阵列集成到第二芯片2;利用第二外壳封装第二芯片2, 并将第二芯片2上的微电极通过引线与第二外壳内的电极连接；将构 成测量单元的微密封仓及电化学电极阵列集成到第三芯片3;利用第 三外壳12封装第三芯片3，并将第三芯片3上的微电极通过引线与 三外壳11内的电极连接；将第一外壳10、第二外壳和第三外壳111
25分别对应安装在第一封装插座板7、第二封装插座板和第三封装插座 板9上；将安装第一外壳10的第一封装插座7与控制电路模块9的 温度控制电路连接；将安装第二外壳11的第二封装插座通过排线与控制电路模块9的电化学检测电路相连接；将第一封装插座板7、第
二封装插座板和第三封装插座板9釆用翻盖式叠合结构叠合连接，使
三个芯片相互对准。
本实施例中软件系统包括单片机软件系统和上位机软件系统。单
5片机软件系统釆用多中断处理技术、定时中断复用技术、PID控制 算法、USB接口通讯技术等多种相应的技术手段对反应仓的温度进 行实时控制，检测DNA扩增的产量，并与上位机PC进行通信。
上位机软件系统使用Visual Bask 6.0软件，利用其强大可视化编 程功能和Windows的图形交互界面，使用户能够更方便的控制 io3MW^PCi 芯片测量系统，并实时了解系统的工作情况，及获取测量 参数。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关 技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明 15的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
权利要求
1、一种定量聚合酶链式反应测量装置，其特征在于，该装置中用于提供PCR反应所需温度的加热单元、用于加载及分配生物样品溶液使其与生物样本DAN发生PCR反应的微流体单元、用于采集DAN扩增产量的电信号的测量单元被集成为三个模块，所述三个模块采用叠合结构连接并相互对准。
2、 根据权利要求l所述的定量聚合酶链式反应测量装置，其特征 在于，所述三个模块釆用翻盖式叠合结构，集成所述加热单元的模块 处于底层，集成所述微流体单元的模块处于中间层，集成所述测量单io元的模块处于顶层。
3、 根据权利要求l或2所述的定量聚合酶链式反应测量装置，其 特征在于，该装置还包括控制电路模块，其与加热单元连接用于对所 述温度进行实时检测与控制，所述控制电路模块与测量单元连接，用 于根据测量单元釆集的所述电信号来获取DAN扩增产量。
4、根据权利要求1或2所述的定量聚合酶链式反应测量装置，其特征在于，集成所述加热单元的模块包括集成微加热器及温度传感 器阵列的第一芯片；封装所述第一芯片的第一外壳；其中所述第一芯 片上的微电极通过引线与第一外壳内的电极连接。
5、 根据权利要求4所述的定量聚合酶链式反应测量装置，其特征 20在于，集成所述微流体单元的模块包括集成微流体沟道及反应阵列的第二芯片；封装所述第二芯片的第二外壳；其中所述第二芯片上的 微电极通过引线与第二外壳内的电极连接。
6、 根据权利要求5所述的定量聚合酶链式反应测量装置，其特征 在于，集成所述测量单元的模块包括集成微密封仓及电化学电极阵25列的第三芯片；封装所述第三芯片的第三外壳；其中所述第三芯片上 的微电极通过引线与第三外壳内的电极连接。
7、 根据权利要求6所述的定量聚合酶链式反应测量装置，其特征在于，该装置还包括控制电路模块，所述第一外壳、第二外壳和第三 外壳分别被安装在不同封装插座板上，其中安装第一外壳的封装插座与控制电路模块的温度控制电路连接； 安装第三外壳的封装插座通过排线与控制电路模块的电化学检测 5电路相连接。
8、 根据权利要求2或7所述的定量聚合酶链式反应测量装置，其 特征在于，所述控制电路模块内存储有设定温度T，若提供给加热单 元的温度Tx与T不相等，所述控制电路模块利用PID算法对偏差Tx-T进行运算得到调节量，利用所述调节量对提供给加热单元的温度进行 io调节。
9、 一种定量聚合酶链式反应测量装置的制备方法，其特征在于， 该方法包括以下步骤将用于提供PCR反应所需温度的加热单元、用于加载及分配生物 样品溶液使其与生物样本DAN发生PCR反应的微流体单元、用于釆 15集DAN扩增产量的电信号的测量单元集成为三个模块； 将所述三个模块釆用叠合结构连接并相互对准。
10、 根据权利要求9所述的定量聚合酶链式反应测量装置的制备 方法，其特征在于，所述集成为三个模块的步骤包括以下子步骤将构成加热单元的微加热器及温度传感器阵列集成到第一芯片； 20 利用第一外壳封装所述第一芯片，并将第一芯片上的微电极通过引线与第一外壳内的电极连接；将构成微流体单元的集成微流体沟道及反应阵列集成到第二芯片； 利用第二外壳封装所述第二芯片，并将第二芯片上的微电极通过 引线与第二外壳内的电极连接； 25 将构成测量单元的微密封仓及电化学电极阵列集成到第三芯片； 利用第三外壳封装所述第三芯片，并将第三芯片上的微电极通过 引线与第三外壳内的电极连接；将第一、第二和第三外壳分别安装在三个不同封装插座板上； 将安装第一外壳的封装插座板与控制电路模块中的温度控制电路 连接；将安装第三外壳的封装插座通过排线与控制电路模块中的电化学 检测电路相连接。
全文摘要
本发明涉及一种定量聚合酶链式反应测量装置，该装置中用于提供PCR反应所需温度的加热单元、用于加载及分配生物样品溶液使其与生物样本DAN发生PCR反应的微流体单元、用于采集DAN扩增产量的电信号的测量单元被集成为三个模块，且这三个模块采用叠合结构连接并相互对准，该制备方法的制备过程为利用微纳米加工技术将上述三个单元集成到三个不同的芯片，并对芯片封装后安装到不同封装插座上，最后对封装插座采用翻盖式结构叠合连接。本发明降低了传统加工方法的难度，降低了设备的成本，每次使用仅需更换其中一个模块即可，所采用的整体结构也非常适于便携。
文档编号C12Q1/68GK101429560SQ20081024037
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者刘泽文, 国石磊, 健 秦 申请人:清华大学