包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明设及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明设及白喉毒素无毒突变体CRM197或其片段在融合蛋白中作为分子内佐剂增强与其融合的目的蛋白（例如皿V衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本发明还设及增强目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段）的免疫原性的方法，其包括将CRM197或其片段与目的蛋白融合表达，形成融合蛋白。本发明还设及包含CRM197或其片段W及目的蛋白（例如皿V衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段）的融合蛋白，其中CRM197或其片段增强了目的蛋白的免疫原性。本发明还设及编码所述融合蛋白的分离的核酸，包含所述核酸的构建体和载体，W及包含所述核酸的宿主细胞。本发明还设及所述融合蛋白的用途，其用于制备药物组合物或疫苗。【
背景技术：
】[0002]已对白喉毒素(diphtheriatoxin,DT)进行了深入的研究。结构研究显示，白喉毒素由S个结构域组成:N端的催化结构域C(aa1-190，Cdomain)(其也称为A片段），中间转膜结构域了（日日201-384，了（1〇111日111)，^及(：端的受体结合位点结构域1?(日日386-535，1?domain)(化oeS,BennettM,FujiiG,etal.，化ture.1992.357:216~222)。利用白喉毒素的前两个结构域与白介素2(化-2)融合而制备的0NTAK(DAB389-化-2)在1999年被美国FDA批准上市，用于成人皮肤T细胞淋己瘤的治疗。运证实白喉毒素的S个结构域可W进行拆分并发挥其各自的功能。[0003]CRM197(Cross-ReactingMaterials197)是白喉毒素的一种无毒突变体(Uchida，T.，A.M,Pappenheimer,Jr.，R.Gregory，etal.,J.Biol.Qiem.1973.248:3838-3844)，其与编码DT的野生型基因相比存在单个核巧酸突变，导致第52位的氨基酸残基由G1y变为G1U(G.Giannini，R.Rappuo1i，G.Ra11ietal.,NucleicAcidsResearch.1984.12:4063-4070)〇[0004]研究表明，CRM197虽然具有与野生型DT类似的结构（即，具有上述3个结构域），但其A片段丧失了与MD结合的能力，不能结合EF2并因而丧失了天然DT所具有的细胞毒性，运表明第52位氨基酸残基Gly在DT与NAD的结合中起着重要作用化.Moyner，G.化ristiansen，ActapathmicrobialimmunolscandsectC.1984,92:17-23)〇CRM197虽然丧失了细胞毒性，但其却保留了与野生型DT相当的、极强的免疫原性，因此其常被用作蛋白载体，用于与其他半抗原交联从而制备结合疫苗。[0005]早在1985年，Porter等人就将化b表面的多糖分别交联至CRMl97和DT蛋白载体并制成疫苗，并且研究两者的免疫原性的差异。实验结果表明，两种交联疫苗的免疫效果没有显著差异，二者都能刺激幼儿机体产生较强的免疫反应和免疫记忆(PorterAnderson,MichealE.Pichicheroand!RichardA.J.Clin.Invest.1985:52-59)。在比较与各种蛋白载体交联的肺炎球菌结合疫苗后发现，WCRM197为蛋白载体的疫苗在动物实验和临床试验中均能产生较好的免疫效果，且CRM197安全，无毒负作用（Black，S.，H.化inefield，etal.PediatrInfectDisJ，2000，19(3);187-195)。目前WCRM197为蛋白载体的肺炎球菌结合疫苗主要有:PCV7、PCV9，PCV13等。临床试验结果证明，运些疫苗在2岁W下的儿童中均具有较好的免疫原性和安全性（Barricai^te,A.,J.Castilla,etal.ClinInfectDis,2007，44(11):1436-1441;Madhi，S.，P.Adrian，etal.化ccine，2007，25(13):2451-2457;Duggan，S.T.DrugS,2010,70(15):1973-1986)。将CRM197与脑膜炎奈瑟氏菌(N.menigitidis)表面多糖交联可制备流行性脑膜炎的结合疫苗。例如，WCRM197为蛋白载体的Meningitec(WyethPharmaceuticals)、Menjugate(Novartisvaccines)、Menveo(Novartisvaccines)等疫苗已经上市。[0006]CRM197虽然失去酶活性和细胞毒性，但仍可与DT的特异受体HB-EGF^eparin-bindingEGF-I化egrowthfactor,肝素结合性表皮生长因子)结合。因为运种受体一般在癌变组织中表达上调，所WCRM197与DT-样具有抗肿瘤效应（Buzzi，S.，D.RulDboli，etal.Immunotherapy,2004,53(11))。研究还发现，CRMl97能透过血脑屏障（Blood-Brain-BarrierBBB)，从而可W用作脑部药物投递的载体(Gaillard,P.J.,andA.G.deBoer.JControlRelease,2006,116(2):60-62)〇[0007]虽然已报道CRM197具有多种功能，尤其是具有较强的免疫原性而可用作免疫佐剂，但是迄今为止从未报道过，CRM197可W用作分子内佐剂在融合蛋白中增强与其融合的目标蛋白的免疫原性。本发明W戊型肝炎衣壳蛋白为例，首次证实了CRM197或其片段在融合蛋白中能够增强与其融合的蛋白的免疫原性，从而可用作分子内佐剂。【
发明内容】[0008]在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。[0009]根据本发明，术语乂RM197"是指白喉毒素的一种无毒突变体，其与野生型白喉毒素相比，差异在于第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini，R.Ra卵Uoli，G.Rattietal.,NucleicAcidsResearch.1984.12:4063-4070)。白喉毒素是本领域技术人员熟知的（参见例如，QioeS,BennettMiF'ujiiG,etal.，Na1:ure.1992.357:216-222)，其氨基酸序列可见于例如GenBank登录号AAV70486.1。[0010]在本发明中，CRM197的示例性氨基酸序列提供于SEQIDN0:2中。因此，在本发明中，当设及CRM197的序列时，其使用SEQIDNO:2所示的序列来进行描述。例如，表述乂RM197的第1-190位氨基酸残基"中的第1-190位氨基酸残基是指，SEQIDN0:2的第1-190位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，可在SEQIDN0:2中天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加），而不影响CRM197生物学特性。因此，在本发明中，术语乂RM197"意欲包括所有此类多肤和变体，包括SEQIDNO:2所示的多肤W及其天然或人工的变体，所述变体保留了CRM197的生物学特性，即，具有强免疫原性且无细胞毒性。并且，当描述CRM197的序列片段时，其不仅包括SEQIDN0:2所示的多肤的序列片段，还包括该多肤的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述乂RM197的第1-190位氨基酸残基"意欲包括，沈QIDNO:2的第1-190位氨基酸残基，W及SEQIDNO:2所示的多肤的变体(天然或人工）中的相应片段。[ocm]根据本发明，戊型肝炎病毒(胎patitisEvirus，HEV)衣壳蛋白是指由皿V0RF2编码的蛋白。皿VORF2的序列是本领域公知的（参见，例如DDBJ数据登录号:D11092)。在本发明中，当设及皿V0RF2的序列时，其使用DDBJ数据登录号:D11092所示的序列来进行描述。例如，表述"HEV0RF2编码的多肤的第368-606位氨基酸残基"中的第368-606位氨基酸残基是指，D11092编码的多肤的第368-606位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在皿V0RF2或其编码的多肤中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加），而不影响其生物学功能(例如抗原性，免疫原性等等）。因此，在本发明中，术语"HEV0RF2"应包括所有此类序列和其变体，包括例如Dl1092所示的序列W及其天然或人工的变体。并且，当描述皿V0RF2(或其编码的多肤）的序列片段时，其不仅包括011092(或其编码的多肤）的序列片段，还包括011092(或其编码的多肤）的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述"HEV0RF2编码的多肤的第368-606位氨基酸残基"包括，D11092编码的多肤的第368-606位氨基酸残基，W及D11092编码的多肤的变体(天然或人工）中的相应片段。HEV衣壳蛋白的示例性氨基酸序列（Dl1092中的0RF2所编码的多肤）描述于SEQIDN0:31中。[0012]根据本发明，流感病毒（Influenzavi;ruses)M2蛋白是指由A型或B型流感病毒基因组第屯节段编码或C型流感病毒基因组第六节段编码的蛋白。流感病毒M2蛋白的示例性氨基酸序列描述于SEQIDNO:32中。[0013]根据本发明，表述"相应序列片段"或"相应片段'是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对W获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。[0014]根据本发明，当在蛋白/多肤的背景中使用时，术语"变体"是指运样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肤（例如，本发明的CRM197)的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换），或者具有至少60%，80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%，或99%的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肤的必要特性。在本发明中，CRM197的必要特性可W指，具有强免疫原性且无细胞毒性;肥V衣壳蛋白和流感病毒M2蛋白的必要特性可W指其抗原性和/或免疫原性。[0015]根据本发明，术语"同一性"用于指两个多肤之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时（例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嚷岭占据，或两个多肤的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据），那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的"百分数同一性"是由运两个序列共有的匹配位置数目除W进行比较的位置数目X100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么运两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配）。通常，在将两个序列比对W产生最大同一性时进行比较。运样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序（DNAstar，Inc.)方便地进行的Needleman等人（1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序（版本2.0)的E.MeyerS和W.MiIler(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(wei曲tresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包（可在WW.gcg.com上获得）的GAP程序中的Needleman和WunschQMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵W及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapwei曲t)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。[0016]如本文中使用的，术语"保守置换"意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肤的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氨键的能力等）的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。运些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、色氨酸）、非极性侧链(例如丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、e分支侧链(例如，苏氨酸、鄉氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的（参见，例如，Brumme11等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文）。[0017]根据本发明，术语"免疫原性（immunogenicity)"是指，能够刺激机体形成特当前第1页1 2 3 4 5 6