一种猪源口蹄疫病毒非结构蛋白3abc的单链抗体及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设一种猪源口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单链抗体及其制法。生物医药技 术领域。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)属于小RNA病毒科，基因组为 8.5化的单链正向RNA，编码单一的多聚蛋白。多聚蛋白在体内酶解成不同的结构蛋白（SP) 和非结构蛋白（NSP)，结构蛋白￥口1、￥口2、￥口3、￥口4组成病毒的衣壳，非结构蛋白171^9、24、28、 2(：、34、38、3(：、30负责病毒复制和蛋白酶解剪切。
[0003] 口蹄疫是一种影响全球经济、动物贸易和肉类食品安全的重要的偶蹄类动物传染 病，疫苗免疫可经济、高效防控口蹄疫。根据流行国家FMD疫情，FMD的控制主要依赖将FMDV 流行株经化学灭活后制备成灭活疫苗用于动物免疫W及持续不断的监测。疫苗免疫防控口 蹄疫爆发，取决于能否准确、可靠区分感染动物中已经免疫的动物(discriminate between infected and vaccinated animals，DIVA) JMDV疫苗经灭活、纯化除去了大部分的非结构 蛋白。动物对疫苗的反应主要针对病毒结构蛋白，因此，通过血清学方法检测非结构蛋白， 特别是多聚蛋白3ABC，来区别感染的动物和疫苗免疫的动物。非结构蛋白的存在意味动物 体内存在活病毒的复制，即说明动物遭受了病毒感染。
[0004] 区别动物免疫化IVA)和感染诊断是控制和根除口蹄疫最重要的手段。目前DIVA的 检测所用抗体多为单克隆或多克隆抗体，其制备、质量保证困难，在疾病暴发后的疾病检测 难W定量分析。重组抗体用抗体工程技术生产且能保证抗体批次稳定一致、试剂性质成份 明确，其生产不依赖动物免疫、也不需要不同骨髓瘤细胞的培养、维持。
[0005] 可识别和区别非结构蛋白和结构蛋白的抗体血清学方法的建立是FMDV诊断方面 重要的一环节，已经发展了许多人工合成、大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒系统表达的重组 抗原W及多克隆、单克隆抗体，用间接或直接竞争化ISA方法作为DIVA诊断。
[0006] 抗体工程生产制备重组抗体相对常规抗体制备方法具有经济、可大规模生产的优 点。抗体基因片段文库可克隆到表达载体，在丝状嗜菌体表面呈现单链抗体片段或单链可 变区片段，因此可利用隧菌体展示技术筛选重组抗体基因和其表达的融合蛋白产物，通过 筛选不同文库或体外突变，进行抗体生物学活性如亲和性、特异性的富集。
[0007] 重组抗体可来源于不同的动物种属，猪由于特异免疫球蛋白基因多样性，建立多 样性文库较其他种属动物容易。猪的免疫球蛋白有重链可变区、轻链可变区，使用功能基因 上游的无功能假性基因，通过免疫球蛋白基因的重排。可W产生重组多样性。假基因缺乏功 能元件如启动子区、但含功能基因的保守序列。因此通过设计针对独特功能可变基因二侧 保守区的引物，用PCR扩增重排可变片段的完整谱可克隆得到具有高度多样性的猪免疫球 蛋白胆存库。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种抗口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单链抗 体，该单链抗体能够用于区分口蹄疫病毒自然感染动物W及口蹄疫疫苗免疫动物。
[0009] 本发明所要解决的技术问题是通过W下技术手段实现的：
[0010] 本发明通过使用口蹄疫病毒重组非结构蛋白3ABC免疫猪，建立了抗口蹄疫病毒非 结构蛋白3ABC单链可变区片段（single chain variable fragments,scFv)隧菌体展示文 库，经过进一步筛选获得了3条重组单链抗体，分别命名为PRAb-scFv-2Al、PRAb-scFv-3B2 W及PRAb-scFv-4Hl，序列测定结果表明：S者具有相同的重链序列，但轻链序列明显差异。 重链决定抗原结合特异性，实验发现，该=条重组单链抗体均能够与口蹄疫病毒非结构蛋 白3ABCW及3C区片段特异性结合。
[0011] 进一步研究发现：PRAb-scFv-2Al、PRAb-scFv-3B2、PRAb-scFv-4H13 抗体中，PRAb-scFv-4m和 PRAb-scFv-2Al、PRAb-scFv-3B2 比较，有较高的非特异结合性。PRAb-scFv-2Al、 PRAb-scFv-3B2在竞争化ISA中都能有效区别感染和未感染猪血清，但PRAb-scFv-3B2更能 明显区分感染猪和未感染猪血清，且对阳性血清阻抑水平高、对阴性血清的背景低。且 PRAb-scFv-3B2对ABC蛋白有较高的亲和性，PRAb-scFv-2Al必须稀释1:80才能达到PRAb-SCFV-3B2稀释1:1600所对应的OD值，但巧巾抗体在大肠杆菌的表达水平一样。
[0012] 使用口蹄疫病毒重组非结构蛋白3ABC作为包被抗原，WPRAb-scFv-SAUPRAb-scFv-SBS 或 PRAb-scFv-4Hl 作为竞争抗体通过竞争化 ISA 法 (C-ELISA) 测试 W 上 S条单链抗 体对口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC、3A、3BW及3C抗体的阻抑率，结果发现PRAb-scFv-3B2特 异结合3C与3ABCe3ABC/PRAb-scFv-3B2和3C/PRAb-scFv-3B2组合竞争化ISA结果有明显区 分，3ABC/PRAb-scFv-3B2优于3C/PRAb-scFv-3B2，说明检测抗体由于位阻效应而不是由于 对相同结合位点直接竞争而使待检血清抗体结合的3A或3B表位完全阻断。
[0013] 对大量猪血清用C-化ISA检测显示对阴性血清低阻抑百分比，而对阳性血清较高 水平的阻抑率。
[0014] PRAb-scFv-3B2作为竞争抗体和3ABC作为抗原的C-HJSA中，可区分猪、牛、羊的感 染、未感染血清和疫苗免疫血清。不同的动物检测有显著区别，羊疫苗免疫血清背景较深。 检测结果显示PRAb-scFv-3B2比较适合检测猪和牛血清。
[0015] 在上述研究基础上，本发明提出了一种猪源口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单链抗 体，命名为PRAb-scFv-3B2,其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0016] 编码所述的单链抗体的核巧酸序列也在本发明的保护范围之内。
[0017] 进一步的，本发明还提出了所述的单链抗体在制备检测口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC或3C蛋白试剂中的用途。
[0018] 其中，优选的，所述的试剂可用于区分口蹄疫病毒自然感染动物W及口蹄疫疫苗 免疫动物。
[0019] FMD爆发或流行，疫苗免疫对疾病防控起到重要作用。对免疫动物和自然感染的区 别是建立无口蹄疫地区最重要的考量。需要大量爆发或流行后口蹄疫病毒非结构蛋白抗体 的检测。运种方法应有高敏感性、高特异性且适合大规模的筛选。
[0020] 为使口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测方法标准化和优化，检测试剂应批与批质量 稳定、能经济和简单生产，重组抗原和重组抗体生产技术满足W上的生产要求。
[0021] 本发明进一步使用重组口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC单链抗体，建立了区别动物感 染与免疫（differentiate infected 打om vaccinated animals ,DIVA)的检测方法。
[0022] 更进一步的，本发明提出了一种用于区分口蹄疫病毒自然感染动物W及口蹄疫疫 苗免疫动物（differentiate infected from vaccinated animals,DIVA)的口蹄疫病毒 3ABC抗体竞争ELISA检测试剂盒，包括包被口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的酶标板W及本发 明所述的单链抗体PRAb-S CFV-3B2。
[0023] 其中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、封闭液、显色液和洗涂液。
[0024] 其中，优选的，用于区分口蹄疫病毒自然感染动物W及口蹄疫疫苗免疫动物时，按 照W下方法进行：
[0025] (1)取出包被口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的酶标板，W洗涂液洗板；
[0026] (2)向酶标板中加入封闭液稀释的待测动物血清，37°C解育30分钟，并不断摇动， 加入所述的单链抗体PRAb-scFv-3B2，37 °C解化60分钟并不断摇动，W洗涂液洗板；同时加 入阴性血清和阳性血清作对照；
[0027] (3)然后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗3ABC单链抗体的I gG抗体；
[00%] (4)得到的加酶标记抗体后的酶标板中加入TMB溶液，振荡混合后37°C显色，2M硫 酸溶液终止反应；
[0029] (5)检测在0D4日日皿处的吸光值A450nm。
[0030] 其中，优选的，所述阴性对照为未感染口蹄疫病毒也未接种口蹄疫疫苗的阴性血 清；阳性对照为口蹄疫病毒阳性血清;所述封闭液为含有1 %牛血清白蛋白的PBST缓冲液； 所述洗涂液为PBST缓冲液。
[0031 ] 使用本发明的试剂盒，可从免疫动物中区别感染动物(differentiate infected from vaccinated animals ,DIVA)。该试剂盒的优点是检测抗体和包被抗原都来自大肠杆 菌系统，包含完整3ABC，无需传染性FMDV病毒、安全、经济，无需传统抗体生产中大量多种骨 髓瘤细胞培养W及试验动物饲养。
【附图说明】
[0032] 图1为WPRAb-scFv-3B2作为检测抗体检测不同FMDV血清样本的竞争化ISA结果；
[0033] 图2为WPRAb-scFv-2Al作为检测抗体检测不同FMDV血清样本的竞争化ISA结果。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应 该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和形式进行修 改或替换，但运些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0035] 实施例1.3ABC重组单链抗体基因的构建、筛选
[0036] 1.1 材料：
[0037] 中国主要流行的口蹄疫病毒有A型、亚洲1型W及0型。采集感