一种水稻小穗发育调控蛋白、其编码基因ms1及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体的说，设及一种水稻小穗发育调控蛋白、其编 码基因 MSl (MALFORMED SPIKELET 1)及应用。
【背景技术】
[0002] 水稻(0巧Za sativa L.)是世界上重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物。 与双子叶模式植物相比，水稻花序具有禾本科植物独有的结构单元--小穗，深入研究水稻 生殖发育过程，不仅有助于深入理解水稻小穗或小花的形成机制，而且对丰富植物发育生 物学知识和提高水稻产量和品质都具有非常重要的意义。随着耕地面积的不断减少，提高 水稻产量乃当务之急。稻谷巧粒形状不仅是影响水稻产量的重要指标之一，也是影响稻米 的外观品质和加工品质的重要因素。随着分子标记和分子生物学的发展，人们逐渐克隆了 一些控制粒型的基因，并开始分析粒型的分子遗传机理。目前，国内外已被报道并克隆的粒 型基因有652、6胖2、6胖8、617/6胖7、61胖7和0561等。6胖2和6胖8主要通过影响颖壳横向细胞数目 的多少来控制粒宽;GLW7和DSGl主要通过影响颖壳细胞的长度来控制谷粒的大小;GS2和 GL7同时控制颖壳细胞的大小和数目，从而影响其产量。因此，利用已克隆的颖壳发育相关 基因，可实现稻米产量和相关品质的遗传改良。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种能影响水稻小穗特有颖壳发育和巧粒大小 的小穗发育调控蛋白质及其编码基因，W及由此获得的重组载体、转化体，和调控禾本科植 物小穗发育的方法及应用。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻发育调控蛋白，如(A)或(B)所示的 序列：
[0005] (A)Seq ID No:2或图10所示的氨基酸序列，其属于一类MADS-box转录因子；
[0006] (B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且 具有调控水稻小穗发育功能的由(A)衍生的蛋白质。
[0007] 本发明还提供了一种编码上述蛋白质的基因。
[000引进一步地，所述基因，如(a)或(b)所示的序列：
[0009] (a)SEQ ID No:l或图8所示的核巧酸序列；
[0010] (b)在(a)所限定的核巧酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个核巧酸而 生成的可编码具有相同功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。
[0011] 进一步地，所述基因的编码框序列如(a)或(b)所示的序列：
[0012] (a)SEQ ID N0:3或图9所示的核巧酸序列；
[0013] (b)在(a)所限定的核巧酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核巧酸而 生成的可编码具有相同功能的蛋白质的序列。
[0014] 本发明还提供了一种含有上述基因的重组载体，载体为PCAMBIA1301，该载体可W 有效地表达由上述基因编码的蛋白质或其同源类似物。
[0015] 本发明还提供了一种含有上述基因的转化体，该转化体的宿主细胞为大肠杆菌细 胞、农杆菌细胞或植物细胞。
[0016] 本发明还提供了一种调控禾本科植物小穗发育的方法，包括用上述基因转化禾本 科植物细胞，再将转化后的禾本科植物细胞培育成植株。
[0017] 本发明还提供了上述蛋白、基因、重组载体或转化体在改良禾本科植物产量、品质 中的应用。
[0018] 进一步地，上述基因通过转基因或分子标记辅助选择育种方法来改良禾本科植物 产量、品质。
[0019] 进一步地，所述禾本科植物为水稻。
[0020] 实现本发明的具体技术步骤如下：
[0021] 一、突变体msl的分离和遗传分析：
[0022] 本发明的水稻小穗颖壳和巧粒异常突变体msl来自梗稻品种中花Il(Japonica) EMS化thyl Met的1 Sulfonate)诱变产生的突变。通过与野生型的正反交实验，证明该突变 体受隐性单基因控制，如图1和图4所示。
[0023] 二、突变体msl与野生型小穗颖壳和巧粒的比较：
[0024] 突变体msl小穗的副护颖和护颖伸长，在大小和结构上类似于外釋或者内釋（图1、 图2和图3所示）。
[0025] 突变体msl花序二次枝梗上的巧粒的粒长和千粒重显著降低(如图4所示）。
[00%] S、MS1基因的图位克隆：
[0027] 1)MS1基因的初步定位：
[0028] 为了分离MSl基因，本发明首先构建了一个定位群体，由msl与釉稻品种NJ06杂交 组配成F2定位群体，再通过图位克隆的方法，利用多种分子标记对MSl位点进行初步定位， 将其初步定位在第3染色体上，并介于M7与M29标记之间（图5所示）。
[00巧]2)MS1基因的精细定位：
[0030] 通过对M7与M29两个标记之间的序列进行分析，发展新的多态性标记将MSl基因精 确定位在〇J112_G08的BAC P上，介于S8和S21标记之间，大约78化范围之内（图5所示），通过 分析此区段开放阅读框(OR巧预测候选基因。
[0031] 3)MS1基因的鉴定和功能分析：
[0032] 通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻 (图7)，证明了本发明正确克隆了MSl基因，氨基酸序列分析表明MSl编码一个具有MDS-box 结构域的蛋白（图10)。
[0033] 综上所述，本发明利用小穗异常的突变体，通过图位克隆技术首先克隆到了 MSl基 因，该基因编码一个MADS-box结构域蛋白（0SMADS34)，影响了副护颖和护颖的特征，首次提 出了副护颖、护颖和外釋是同源器官的假说，同时还通过影响颖壳细胞的大小控制了水稻 巧粒大小。MSl基因的克隆和深入的功能解读，进一步阐明了水稻小穗颖壳和巧粒发育的遗 传机制及其作用机理，为生产实践打下了基础。随着我国人口的不断增长、耕地面积持续减 少形势下，高产育种一直是水稻研究的主题。粒型包括粒长、粒宽和长宽比是水稻产量和品 质的重要组成部分，也是当前超高产水稻育种关注的重点。因而，本发明对水稻的产量和品 质的改良具有重要的意义。
【附图说明】
[0034] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0035] 图1是野生型和msl突变体抽穗期小穗的表型对比图；
[0036] 图2是野生型和msl突变体早期小穗的表型对比图；
[0037] 图3是野生型和msl突变体颖壳的表面结构对比图；
[0038] 图4是野生型和msl突变体巧粒的表型对比图；
[0039] 图5是MSl基因的定位图；
[0040] 图 6是pCAMBIA1301(S65T)-MSl 载体图谱；
[0041] 图7是功能互补实验转基因水稻与野生型、突变体巧粒的表型对比图；
[0042] 图8是]?別基因的DNA序列；
[0043] 图9是MSl基因的编码框序列；
[0044] 图10是MSl基因编码的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0045] 实施例1:
[0046] 1、水稻材料：
[0047] 水稻（Oiyza sativa L.)突变体msUmalformed sp;Lkelet 1)，原始野生型材料为 梗稻品种"中花lTemsl突变体来自中花11的EMS化thyl Meth5d Sulfonate)诱变产生的突 变(如图1所示）。
[004引2、分析和定位群体：
[0049]通过msl突变体与"中花11"的正反交实验，表明该突变体受隐性单基因控制。纯合 的msl突变体和釉稻品种NJ06号进行杂交，Fi代自交，并从F2群体中挑选出962株同时具有颖 壳异常和小粒表型的个体作为定位群体。在抽穗期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。 [(K)加]3、DNA 提取
[0051]采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。 取大约〇.3g水稻叶片，经液氮速冻，在直径5cm的小研鉢中磨成粉状，转移到1.5ml离屯、管里 提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于50化1超纯水中。每一个PCR反应用化IDNA样品。
[0化2] 4、MS1基因的初步定位
[0053] 从msl突变体与NJ06号杂交组合的F2群体962个隐性个体中随机选取160个隐性个 体，组成的小群体进行多态性分析，根据本实验室均匀分布于12条染色体上的引物，按照已 知的反应条件进行PCR扩增进行连锁分析。PCR扩增条件如下:PCR反应总体系为IOiil:其中 IOOngAU 水稻基因组 DNA 化1，10 XPCR Buffer 化l，，2mM dNTP 化1，IOuM 引物化 1 ,WAil rTaqO. OSiil，d地2〇 4.95山。PCR扩增条件具体为:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，55°C退 火30秒，72