°C延伸30秒，35个循环，经4%琼脂糖凝胶电泳分离和Gelred核酸染料染色，检测 PCR产物的多态性，将艦1基因初步定位在第3号染色体上M7和M29标记之间。
[0化4] 5、MS1基因的精细定位
[0055]利用msl突变体与NJ06号组合的F2群体中剩余的802株隐性个体，在初定位的基础 上继续设计分子标记，最终将MSI基因精确定位在标记S8和S21之间大约78化的区间内。引 物序列如表1所示：
[0化6] 表1 MSl基因的定位标记序列 [0化7]
[
[UUDV J 0、巷囚观测卿〔[牧分仍：
[0060] 根据精细定位的结果，在78kb范围内根据Rice Genome Annotation Pro ject http: //rice. plantbiology .msu. edu/)的预测，发现在此区间内共有10个候选基因。通过 设计测序引物，采用PCR方法分别从msl突变体和野生型品种中花11基因组中扩增候选基因 进行测序分析。最终发现msl突变体在L0C_0s03巧4170基因组上发生了 IOHbp碱基的缺少， 导致氨基酸翻译的提前终止。将运些结果分别重复验证3次，都得到相同结果，证明了其准 确性。根据BAC克隆0J1112_G08序列的基因注释信息(NCBI)，预测此基因编码了一个MADS-box蛋白（0SMADS34)，该基因与其它物种的MADS-box家族基因有很高的同源性。该MSl基因 具有SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列，其编码的蛋白质具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序 列。PCR反应体系为：100ngAU水稻基因组DNA 化1，化imeSTAR?GXL Buffer 10iU，2.5mM dNTP 化iaOiiM引物化l，PdmeSTAR?GXL DNA Polymerase 4山，d地2〇 2化 1，总体系为50y 1。PCR扩增条件具体为:94 °C预变性2分钟;98 °C变性10秒，60°C退火15秒，68 °C延伸70秒，30 个循环，经1%的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收转入大肠杆菌后挑选阳性单克隆测序。MSl基 因测序引物如下：M34CX-1F : CACAGCTTGAGCAGATCAGC( SEQ ID NO : 20)和M34CX-1R: CGGTACCATATCACGCACC(SEQ ID N0:21)。
[0061 ] 实施例2
[0062] 植物转化：
[00创利用同源重组和PCR技术将Sal I酶切位点引入到扩增引物中，扩增引物为： M340RF-1F:ATGGGGCGAGGCAAGGTGGTG(SEQ ID N0:22)，M：M0RF-1R:CTAGGCCATCCACTCAGGAGG (SEQ ID NO: 23)，退火溫度为60°C。其中前后引物含有Sal I酶切位点。用该引物PCR扩增中 花11的cDNA，电泳后回收纯化720bp的片段，同时也用5曰11单酶切355-6。？（5651')-^8 (PCA1301)载体，再将回收纯化的片段大小正确的产物连接到酶切后的载体上进行大肠杆 菌转化，挑选阳性单克隆测序。获得正确转化载体PCA1301-35S-MS10RF(如图6所示），通过 电击的方法转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中转化水稻msl突变 体。我们利用突变体种子诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤 用作转化的受体。用含有重组质粒载体的LBA4404菌株侵染水稻愈伤，在黑暗和25°C条件下 共培养3天后，在含有300mg/LG418的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/L G418预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照和25°C条件 下培养。一个月左右获得到抗性转基因植株，再将其移植到大田中继续生长。在抽穗期和成 熟期对植株进行表型鉴定和观察，发现异常的小穗和种子恢复正常。通过上述转基因的结 果表明本发明获得了使msl突变体恢复正常表型的转基因水稻(如图7所示）。
[0064] 由上述实验结果可W确定，SEQ ID No:2所示的蛋白质序列具有调控水稻小穗颖 壳发育和巧粒大小的功能。通过常规方法在上述氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一 个或几个氨基酸而得到的具有相同功能的由上述序列衍生的蛋白质，本领域技术人员可W 合理预期其也属于本发明的保护范围。
[0065] 上述蛋白质编码的基因可为如SEQ ID No: 1所示的基因序列或如SEQ ID No:3所 示的编码基因序列。通过常规方法在上述SEQ ID No: 1或SEQ ID No:3所示的核巧酸序列中 添加和/或取代和/或缺失一个或多个核巧酸而得到的可编码具有相同功能的蛋白质的突 变基因、等位基因或衍生物，本领域技术人员可W合理预期其也属于本发明的保护范围。
[0066] 上述实施例中仅列举了PCAMBIA1301作为重组载体的表达载体，W及W农杆菌株 系LBA4404作为转化体的宿主细胞的优选实施例，实际上，上述表达载体可W选择现有较为 成熟的PCAMBIA1300或其他衍生植物表达载体等。上述转化体的宿主细胞还可选择大肠杆 菌细胞或植物细胞等。
[0067] 在生产实践中，可将上述基因转化植物细胞，再将转化后的植物细胞培育成植株。 通过该转基因方法，利用植物表达载体转化植物细胞W影响水稻小穗的发育，进而可W改 良水稻或其他禾本科植物的产量、品质。
[0068] 在生产实践中，还可将上述基因通过分子标记辅助选择育种方法来改良水稻或其 他禾本科植物的产量、品质。
[0069] W上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。有必要指出，本发明不局限于W上 实施例，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变 形，均应认为是本发明的保护范围。
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076]
[0077]
[007引
【主权项】
1. 一种水稻小穗发育调控蛋白，其特征在于，如(A)或(B)所示的序列： (A) Seq ID N〇:2所示的氨基酸序列； (B) 在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有 调控水稻小穗发育功能的由(A)衍生的蛋白质。2. -种编码如权利要求1所述蛋白质的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，如(a)或(b)所示的序列： (a) SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列； (b) 在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个核苷酸而生成 的可编码具有相同功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。4. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的编码框序列如(a)或(b)所示的 序列： (a) SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； (b) 在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成 的可编码具有相同功能的蛋白质的序列。5. -种含有权利要求2-4任一项所述基因的重组载体。6. -种含有权利要求2-4任一项所述基因的转化体。7. -种调控禾本科植物小穗发育的方法，其特征在于，包括用如权利要求2-4任一项所 述的基因转化禾本科植物细胞，再将转化后的禾本科植物细胞培育成植株。8. 权利要求1所述蛋白、权利要求2、3或4所述基因、权利要求5所述重组载体或权利要 求6所述转化体在改良禾本科植物产量、品质中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，权利要求2、3或4所述的基因通过转基因或 分子标记辅助选择育种方法来改良禾本科植物产量、品质。10. 根据权利要求7所述的方法或权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述禾本科 植物为水稻。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻小穗发育调控蛋白，如(A)Seq ID No：2所示的氨基酸序列；或(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有调控水稻小穗发育功能的由(A)衍生的蛋白质。本发明还公开了编码上述蛋白质的基因，如SEQ ID No：1、SEQ ID No：3所示等，还公开了含有该基因的重组载体、转化体，以及利用该基因转化细胞调控禾本科植物小穗发育的方法、以及上述蛋白、基因、重组载体、转化体在改良禾本科植物产量、品质中的应用。本发明利用图位克隆技术分离了一个水稻影响小穗发育MS1基因，并利用转基因互补实验鉴定该基因的功能，可利用该基因研究水稻颖壳和种子大小的分子机制用以提高禾本科植物的产量和品质。
【IPC分类】C12N15/29, A01H5/00, C07K14/415, C12N15/82
【公开号】CN105693837
【申请号】CN201610266040
【发明人】任德勇, 余海平, 钱前, 郭龙彪, 曾大力, 吴立文, 徐乾坤, 邱振南, 李自壮
【申请人】中国水稻研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月26日