与人血管内皮生长因子受体-3(vegfr-3)蛋白特异性结合的多肽，其筛选方法，鉴定和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体设及一种多肤的筛选及其应用，尤其设及一种能 与人血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)特异性结合的多肤及上述多肤的衍生产品在肿瘤 祀向给药领域的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，针对肿瘤细胞特有的分子信号通路的开发的分子祀向药物，层出不穷。但 是随着研究的深入，其局限性开始突显，基因突变产生的耐药性问题的存在限制了其在临 床的应用。祀向给药系统（targeted化Ug deliveiT system,TDDS)，是指载体将药物通过 局部给药或全身血液循环而选择性地浓集定位于病变组织、器官、细胞或细胞内结构的新 型给药系统，可使病变部位的药物浓度明显提高，从而减少用药量，增加用药安全性，是目 前较有前景的研究方向。其中，祀向给药系统按作用方式不同，可分为被动祀向（passive 1:argeting)和主动祀向（active targeting);被动祀向是一种基于肿瘤组织的EPR(增强渗 透和滞留）效应使递药系统祀向分布于肿瘤组织的策略，但是不均匀的粒径分布使得微粒 进入血液循环后，易被网状内皮系统(RES)摄取而蓄积于肝、脾等器官产生毒性，而致密的 肿瘤细胞外基质W及较高的肿瘤间质压极大地阻碍了药物进入肿瘤深层，造成肿瘤内药物 的不均匀分布，为肿瘤的治愈又增加了难度。因而，借助肿瘤组织高表达的特异性受体的介 导作用，增加递药系统在肿瘤组织、细胞或细胞器内分布的主动祀向给药系统的开发显得 尤为重要。
[0003] 小分子多肤具有相对分子质量小、活性高、免疫原性低、易于制备等特点，近年来 广泛应用于肿瘤主动祀向治疗。利用肿瘤组织某些异常表达的蛋白，研究人员筛选出能特 异性识别肿瘤组织的高活性小分子肤段，通过氨基酸侧链的功能基团连接于药物载体，能 够显著提高肿瘤药物治疗的疗效。例如，祀向整合素受体的RGD多肤，祀向血管生成受体的 K237多肤，对肿瘤转移和淋己管生成影响较大的Lyp-I多肤等修饰的多肤祀向给药系统在 癌症治疗领域研究较为深入。肿瘤祀向多肤不仅在祀向治疗中具有重要的应用价值，其还 可W通过与分子成像试剂偶联，应用于肿瘤分子成像，提高肿瘤诊断的灵敏度和特异性。
[0004] 目前，小分子多肤的发现主要有组合化学肤库，表面展示技术和基于结构的计算 机辅助设计，其中，组合化学肤库的筛选合成周期长，效率较低，不易纯化，不适合大规模筛 选;表面展示技术应用较多的有隧菌体展示，酵母展示，细菌展示等，W隧菌体展示技术为 例，它是一种将编码多肤的外源基因或随机序列的DNA分子群与负责表达隧菌体外壳蛋白 的基因融合后，使外源DNA所编码的蛋白质W融合蛋白形式表达在隧菌体外壳表面，导入各 种外源基因的一组隧菌体集合构成一个展示各种外源多肤的隧菌体展示肤库，之后，将隧 菌体集合与其各种祀分子(细胞表面受体、荷瘤小鼠等)进行多轮淘选(panning)，实现高通 量亲和筛选活性多肤的方法。但构建库容量大、具有更多生物学意义的氨基酸序列仍需进 一步的改进，且筛选过程繁琐，费时。计算机模拟筛选方法是一种计算机辅助筛选和化学合 成筛选相结合的方法，基于肿瘤过度表达的蛋白的晶体结构，选取可能具有活性的氨基酸 片段组成多肤库，用分子对接的方法进行评估虚拟筛选，缩小实验对象、提高实验筛选命中 率。利用化学合成多肤，通过实验的手段进行验证，为寻找肿瘤祀向分子治疗药物或输送导 向"弹头"开辟一条新颖、快捷、经济的途径。
[0005] 血管内皮生长因子受体3(vascuLar endothelia growth factor recepto;r-3， VEGFR-3，又称化T4)属于HI型受体酪氨酸激酶(RTKs)亚家族，是血管内皮生长因子受体家 族的一员，目前该家族已发现的血管内皮生长因子受体还有VEGFR-UVEGFR-2,人们普通认 为，VEGFR-I主要介导细胞骨架重排引起细胞迁移，并引起单核细胞趋化，调节VEGF与 VEGFR-2的结合;VEGFR-2则主要介导与肿瘤有关的内皮细胞增殖和迁移，引起血管通透性 升高，并有抗内皮细胞调亡、维持内皮细胞存活的作用，在诱导肿瘤新血管的形成过程中发 挥着最为重要的作用；而VEGFR-3主要介导淋己内皮细胞的增殖和迁移，与淋己血管的生成 和和肿瘤细胞的扩散转移密切相关。与RTK家族其它成员类似，VEGFR-3结构上有如下特征： (1)胞外区由7个免疫球蛋白（Immunoglobulin)样区构成，其中第1~3个Ig样区之间为其与 配体VEGF的结合位点，第4~7个Ig为受体二聚化位点，与激酶活性有关；（2)单次跨膜区； (3)胞内区分为近膜区，催化区酪氨酸激酶域，激酶插入域和C末端激酶自身憐酸化区。Kari ALi化Lo等人在2013年解析了 VEGFR-3胞外区化1-D2，D4-D5 )，胞外结构域中第5个免疫球蛋 白样折叠在合成时被切割，切割后由一个二硫键连接。两个单体的VEGFR-3通过第四个免疫 球蛋白域相互形成同源或异源二聚体，发挥生理活性。随着研究的深入，发现VEGFR-3在许 多肿瘤中过度表达，如肺癌、乳腺癌、Kaposi^ S肉瘤、肝癌和鼻咽癌、结肠癌和卵巢癌等。由 于肿瘤细胞遗传的不稳定性，传统的细胞毒类抗肿瘤药物极易产生耐药性;已经证实，肿瘤 的生长和转移必须依赖于新血管和淋己管的形成，因此祀向抑制介导肿瘤的血管和淋己管 生成为抗肿瘤治疗和防止肿瘤转移提供了一个非细胞毒性的重要途径，同时血管内皮细胞 在遗传学上是稳定的，不易产生变异而导致耐药性。目前已有许多公司正在运方面进行积 极祀向治疗的尝试，并取得了积极的结果。抓D073抗体通过抑制VEGFR3的作用，成功抑制了 皿L细胞的增殖。除了抗体之外，针对VEGFR-3信号转导通路设计的小分子激酶抑制剂的研 究也在进行之中，比如AZD2171 ,BIBF 1120等正在进行临床实验，但是无论是抗体还是小分 子，均不是VEGFR-3特异性抑制剂，治疗效果不佳，临床进展缓慢。
[0006] 针对VEGFR-3目前分子祀向药物研究的缺陷和局限性，可W对其研究思路进一步 拓宽和改造，充分利用VEGFR-3胞外区晶体结构提供的S维信息，进行基于祀标结构的合理 祀向多肤设计，将祀向多肤与生物相容性好，载药量高的聚合物胶束相结合，W多肤为祀头 将活性药物输送至肿瘤细胞内部，提高药物的选择性和安全性。运一理念与近年来抗肿瘤 新药研究的最新思路不谋而合，可谓是殊途同归。但是运一策略的研究关键依赖于多肤的 特异性和高亲和力。目前已有针对VEGFR-3的多肤的出现，并在细胞水平上有效的祀向 VEGFR-3信号通路，但并未有进一步的体内实验报道，因此，本领域迫切需要进一步的新型 祀向多肤和多肤给药系统的开发和研究，也可能为肿瘤的成像和诊断提供新的手段。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术的不足，利用计算机辅助设计和化学合成相结合的 方法，合理筛选出与VEGFR-3高亲和力，分子量小，容易到达肿瘤组织部位的特异性多肤，并 进行部分体外生物学实验验证。在肿瘤祀向给药、癌症诊断等方面彰显出较强的优越性，为 WVEGFR-3为祀点的多肤抗肿瘤祀向药物系统的开发和设计提供有效的开发途径。
[0008] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现的：WVEGFR-3的晶体结构（4BSJ)为基 础，全面分析其作用模式，利用FTmap软件寻找潜在的结合位点，并在远离VEGFR-3天然配体 的潜在结合口袋附近，考虑氨基酸的理化性质和空间位置排序，构建倾向性多肤库，利用多 种对接软件进行虚拟筛选，互为验证，同时综合考虑对接排名顺序、氨键成键能力、空间构 象、静电互补、疏水作用和合成难易程度等因素，最终选出9条代表性的多肤进行合成并投 入生物亲和力实验，其中有3条多肤表现出较强的细胞亲和活性。本发明氨基酸序列通式为 CXXPFXP，X为20种天然氨基酸中的任一种或其D型氨基酸，优选