甘氨酸-l-半胱氨酸-l-苯丙氨酸三肽及其在脑卒中药物制备中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体来说设及甘氨酸-1^-半脫氨酸-1^-苯丙氨酸（Gly-L-Cys-L-Phe,简称GCF)S肤在脑卒中药物制备中的应用。
【背景技术】
[0002] 脑卒中（S化Oke)，是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，临床上表现为一次 性或永久性脑功能障碍的症状和体征。脑卒中按其性质分为缺血性脑卒中和出血性脑卒 中。脑卒中是严重危害人类生命安全的难治性疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率的 特点，在2008年我国卫生部公布的死因顺位中，脑卒中在城市中排名第=位，在农村中为第 二位的致死原因，其中缺血性脑卒中占卒中病人综述的75%-85%。因此，研发出一种抗缺 血性脑卒中的药物具有广阔的医学应用前景。
[0003] 目前临床上缺血性脑卒中治疗方式有W下几类：（1)溶栓药物。在急性超早期即复 流时间窗内，如果患者的条件符合溶栓的要求，可使用溶栓药物进行溶栓，运在临床上是缺 血性脑卒中急性期采取的最有效治疗措施之一。但是，溶栓药物的剂量W及有效时间窗等 研究仍然不成熟，还有待于进一步的探索研究。（2)神经保护药物。大多数的神经保护药物 是在细胞损伤瀑布级联效应启动前阻断神经元损伤或调亡的多个环节发挥保护作用，或对 神经元具有营养作用能够促使神经元的修复。近年来关于神经保护药物的研究主要集中在 已上市药物依达拉奉，NMDA受体阻断剂和Ca 2+通道阻断剂等。几乎所有运些神经保护药物在 动物实验中都被证明具有神经保护作用，但是临床试验却被证实无效或者是效果很差，甚 至有些药物具有明显的毒副作用，产生患者无法忍受的中枢神经系统不良反应或其他脏器 毒性，使得神经保护的研究停滞不前。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种新的化合物甘氨酸A-半脫氨酸-L-苯丙氨酸=肤，简称GCF，它是由甘氨酸，半脫氨酸，苯丙氨酸=种天然氨基酸为原料脱水缩 合而成.置结抬^ ?
[0005]
[0006] 本发明的目的之二是提供甘氨酸-1^-半脫氨酸-1^-苯丙氨酸S肤在脑卒中药物制 备中的应用。
[0007] 本发明用培养12天的原代皮层神经元作为实验对象，用不同浓度GCF处理神经元 后，用CCkS的方法评价细胞活力，从而判断GCF细胞毒性;检测Akt憐酸化水平(P-Akt)判断 GCF对神经细胞是否具有保护作用，Akt憐酸化水平越高保护作用越强。
[000引结果可见，用不同浓度GCF处理神经元12h，GCF浓度低于I OmM时，GCF对于神经元具 有保护作用，并且随着GCF浓度增大保护作用愈加明显；当浓度在IOmM水平时保护作用最 强。同时，用细胞外液(ECS)处理原代神经元化，目的是降低细胞内P-Akt基础表达水平，再 用不同浓度GCF处理神经元，收集细胞蛋白用western比较各组之间Akt憐酸化程度，发现 GCF浓度高于200測时P-Akt表达增加，并且当GCF浓度在SOOiiM水平时，Akt憐酸化水平最高， 具有统计学意义(**卸<0.01)。（见附图2)
[0009] 本发明用SD大鼠作为实验对象，采用脑中动脉阻断法(MCAo)制备脑缺血大鼠模 型，缺血3小时后静脉注射药物，1小时后取脑，脑组织冰冻切片，在巧光显微镜下观察脑片 中巧光物质强度。
[0010] 采用静脉注射FITC(异硫氯酸巧光素，紫外激发可发绿色巧光;如mol/kg)标记大 鼠脑神经细胞，结果可见未缺血大鼠脑组织中未见巧光标记的神经细胞;缺血大鼠脑组织 中镜下可见极少量FITC标记的绿色巧光神经细胞;脑缺血后注射FITC-GCF(祉mol/kg)，镜 下可见大量巧光标记的神经细胞，并且巧光强度高(见附图3)，表明GCF在大鼠缺血情况下， 可W通过静脉注射方式透过血脑屏障进入大脑。
[0011] 本发明用SD大鼠作为实验对象，静脉注射给予GCF( lOmg/kg)、依达拉奉(临床脑卒 中治疗药物;6mg/kg )，采用MCAo脑缺血大鼠模型，缺血后化，静脉一次性注射上述药物。24h 后，处死动物，取脑，后TTC染色，梗死体积用（[(VC-化VV C]表示，VC是对照半球体积，，化 是损伤半球非梗死体积）。
[0012] 结果可见，注射生理盐水的脑缺血大鼠，梗死体积0.3369 ± 0.023;给予lOmg/kg GCF，梗死体积0.023 ± 0.004;注射6mg/kg依达拉奉，梗死体积为0.1373 ± 0.021;相对于静 脉给生理盐水和依达拉奉组，给GCFS肤药组有更低的梗死体积，并且有统计学意义（p< 0.05)(见表1，附图4)。
[0013] 本发明提供的=肤可W通过常规静脉给药方式，透过血脑屏障，进入大脑组织和 细胞，明显改善大鼠脑梗死体积，起到治疗脑卒中的作用，该=肤作用明显优于现有临床使 用药物。
【附图说明】
[0014] 图1:甘氨酸A-半脫氨酸A-苯丙氨酸S肤的HPLC图谱W及质谱图，该S肤由本实 验室自主合成。
[001引图2 :GCF对皮层神经元存活的影响。
[0016] 图3:FITC-GCF在大鼠脑缺血情况下，透过血脑屏障，进入大脑。
[0017] 图4:缺血大鼠静脉注射GCF，可明显改善缺血大鼠脑梗死体积，发挥脑保护作用。
【具体实施方式】
[0018] 通过结合附图可W进一步理解本发明的特点和优点。提供的实施例仅是对本发明 方法的说明，而不W任何方式限制本发明掲示的其余内容。
[0019] 【实施例1】甘氨酸寸-半脫氨酸A-苯丙氨酸立肤仙厂Cys-Phe)的制备过程如下：
[0020] 一、复合物I FmocA-Phe-树脂的合成：
[0021] 本专利S肤用固相合成的方法，称取取代度为0.4mmol/g的2-氯S苯甲基氯树脂 U-Chlorotrityl Chloride Resin) 10.7g，将树脂放入多肤反应管中，加入二氯甲烧(；DCM) 160.5ml，震荡30分钟;通过沙忍抽滤掉DCM溶剂，加入12mmol的FmocA^he-OH氨基酸，再加 入40mmol的N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酯胺(DMF)溶解，振荡化。用 DMF和DCM交替清洗6遍。加160.5ml 20%赃晚(赃晚溶解在DMF溶液中），5分钟后抽掉赃晚， 再次加入160.5ml 20%赃晚，等15分钟后抽掉赃晚溶液，从管中取反应后的树脂十几粒，用 乙醇洗S次，加入巧S酬，氯化钟溶液，苯酪溶液各一滴，105 °C -110°C加热5min，变深蓝色 为阳性反应，说明FmocA-Phe-OH与树脂联接成功，形成复合物I FmocA-Phe-树脂。
[0022] 二、复合物II Fmoc-Cys(Trt)A-Phe-树脂的合成：
[0023] 多肤反应管分别用160.5ml DMF洗两次，160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两 次;后在Fmoc-kPhe-树脂复合物上联接第二个氨基酸，在反应管中加入少量用DMF溶解的 12mmo Wmoc-切S (化t) -OH和12mmo 1苯并S氮挫-N，N，N '，N ' -四甲基脈六氣憐酸盐化BTU)， 后立即加入N-甲基吗嘟（匪MMOmmol，反应30min，反应管分别用160.5ml DMF洗一次， 160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两次。加160.5ml 20 %赃晚（赃晚溶解在DMF溶液 中），5分钟后抽掉赃晚，再次加入160.5ml 20%赃晚，等15分钟后抽掉赃晚溶液，从管中取 反应后的树脂十几粒，用乙醇洗=次，加入巧=酬，氯化钟溶液，苯酪溶液各一滴，105°C-110°C加热5min,变深蓝色为阳性反应，说明Fmoc-切S (化t)-〇H与Fmoc-k^e-树脂联接成 功，形成新的复合物II Fmoc-CyS(ht)-L-Phe-树脂。
[0024] S、复合物III Fmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-树脂的合成：
[0025] 多肤反应管分别用160.5ml DMF洗两次，160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两 次;后在Fmoc-切S(Td) A-^e-树脂上联接第S个氨基酸，在反应管中加入少量用DMF溶解 的12mmo 1 Fmo C-G1厂OH和12mmo化BTU，后立即加入N-甲基吗嘟（NMM) 40mmo 1，反应3 Om i n，反 应管分别用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两次。加 160.5ml 20%赃晚(赃晚溶解在DMF溶液中），5分钟后抽掉赃晚，再次加入160.5ml 20%赃晚，等15分 钟后抽掉赃晚溶液，从管中取反应后的树脂十几粒，用乙醇洗=次，加入巧=酬，氯化钟溶 液，苯酪溶液各一滴，105 °C -110°C加热5min，变深蓝色为阳性反应，说明Fmoc-Gly-OH与复 合物II联接成功，形成新的复合物I