特异性结合胰岛素样生长因子1的抗体的制作方法

特异性结合胰岛素样生长因子1的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及特异性结合如下表位的分离的抗体，该表位包含在对人胰岛素样生长因子1前体(SEQ?ID?NO:1)已知的范围为氨基酸76至氨基酸84的氨基酸区段中。新的抗体具有极大效用，因为它们允许甚至在存在高过量浓度的紧密相关的胰岛素样生长因子2的情况下灵敏且特异性检测胰岛素样生长因子1。可以例如在体液样品中检测胰岛素样生长因子1。
【专利说明】特异性结合胰岛素样生长因子1的抗体
[0001]发明背景
[0002]人胰岛素样生长因子KUniProtKB 条目 P05019，IGF1_ 人，(SEQ ID NO:1)),也称为生长调节素C和生长调节素A，处于其成熟形式，即一种70个aa的多肽(SEQ IDNO: 2)，其与IGF-2和胰岛素共享大段的序列同一性和高结构同源性(Rinderknecht，E.和 Humbel, R.E.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA73 (1976) 2365-2369 ; Rinderknecht, E.和Humbel, R.E.，J.Biological Chemistry253(1978)2769-2776)。人 IGF-2 以 IGF-1 的 500倍摩尔过量存在于人血清中(Jones, J.1.和 Clemmons, D.R., Endocr.Rev.16 (1995) 3-34)。IGF-2的较高血清浓度及其与IGF-1的序列同源性是对IGF-1特异性免疫检测的主要障碍。因此，生成清楚地在IGF-1和IGF-2之间进行区分的IGF-1特异性抗体(即没有与IGF-2的交叉反应性的抗体)是具有挑战性的，而且将构成对体液样品中IGF-1的特异性检测的基石。
[0003]与胰岛素类似，IGF-1多肽链可分成域。IGF-1包含4个域，分别为B (氨基酸残基1-29)、C (30-41)、A (42-62)和D (63-70)。域A和B分别是胰岛素B和A链的结构同源物，域C与胰岛素原的连接肽类似，而D域在胰岛素中没有对应物。
[0004]如Manes S.等，J.Endocrinol.154 (1997) 293-302 总结的，认为 IGF-1 介导生长激素(GH)的促生长活性(Sara, V.R.和 Hall, K.，Physiol Rev.70 (1990) 591-614)。在多种细胞类型中经由旁分泌或自分泌途径对细胞生长、分化和存活的局部控制中，它也被视为是关键的(Jones J.1.和 Clemmons, D.R., Endocrin.Rev.16 (1995) 3-34)。已提出 IGF-1的假定受体，即 I 型 IGF 受体 (IGF-1R) (Ullrich, A.等，EMBO J.，5 (1986) 2503-2512)在肿瘤发生中起着关键作用(Sell, C.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993) 11217-11221)。有足够证据指示许多肿瘤表达IGF-1R，且生成并向胞外环境分泌IGF-1或IGF-2 (Baserga, R.，Cell79(1994)927-930;Werner, H.等，Int.J.Biochem.Cell Biol.27 (1995)987-994)，由此以自分泌方式促进连续细胞生长。
[0005]IGF-1和IGF-12均在大量组织和细胞类型中表达且可具有自分泌、旁分泌和内分泌功能。成熟的IGF-1和IGF-2在人、牛和猪蛋白之间高度保守(100%同一性)，且还展现出跨物种活性。IGFL(胰岛素样生长因子样)家族包括在人中的4种小的(约IlkDa)、可能分泌的家族成员和小鼠中的I种。
[0006]鉴于IGF-1的重要作用，生成IGF-1特异性的抗体，即没有与IGF-2的交叉反应性的抗体，对于IGF-1的特异性检测既是挑战性的也是极为重要的。尽管事实上已知胰岛素样生长因子达超过30年，但迄今为止乃至今天在体液样品中特异性检测IGF-1或在组织样品中定位蛋白质胰岛素样生长因子I仍然是困难的。这可能是例如由于本领域已知抗体的不充足的结合亲和力和/或对相关分子的不同水平交叉反应性所致。
[0007]在IGF-1的血清检测中，大多数仪器使用严格的清洗步骤来降低并克服其中使用的特异性结合剂(例如抗体)的非特异性结合。通常，通过用天然IGF-1免疫形成的抗体以比其识别IGF-2更高的亲和力和抗原复合物稳定性识别其真正的免疫原，所述IGF-2以较低的亲和力和抗原复合物稳定性起交叉反应。例如，自用天然重组人IGF-1对小鼠的免疫活动衍生的鼠单克隆抗体<IGF-1>-M2.28.44显示对IGF-1的结合动力学特征(signature)(见图 8)为 KD=0.03xlCT9mol/L 亲和力，t1/2解离=92min,而 IGF-2 以 KD=5xlCT9mol/L 的亲和力和t1/2?w=5min结合。根本性差异在于抗原复合物稳定性。这类抗体对IGF-1特异性测定法的成功使用强烈依赖于仪器的清洗设置，因为需要相对于〈IGF-D-M2.28.44交叉反应性抗体消耗IGF-2。简言之，仅可以依靠复杂的清洗步骤来克服展现出与IGF-2的交叉反应性的IGF-1结合抗体的技术限制。
[0008]不言自明的是，对于在平衡条件下，特别是在不实施抗体-抗原免疫复合物的任何清洗或纯化规程的诊断系统中所应用的抗体，IGF-1特异性要求高得多。在其它实施方案中，体内情况原理上也以热力学平衡为特征。因此，在平衡条件下，证实缺乏任何IGF-2相互作用尤其具有最重要的意义。
[0009]本发明的任务是开发出克服本领域已知的这些问题的抗体。适合于在平衡条件下应用的IGF-1特异性抗体的关键要求不仅在于识别并以高亲和力结合IGF-1，而且即使在高IGF-2血清浓度时也没有可检出的IGF-2结合ka(l/Ms)。
[0010]从原理上讲，IGF-1和IGF-2之间的免疫学区分应仅在相应抗体靶向IGF-1表位，而该表位与IGF-2对应物在氨基酸序列或构象上明显不同时才是可行的。事实上，在IGF-1和IGF-2之间仅有一个显著的连续偏差，值得注意地在IGF-1氨基酸位置74-90处在IGF-1的转角-环基序中，其以信号和前肽(UniPiOtKB条目P05019，IGF1_A)开始编号。迄今为止，仍然不能使用天然IGF-1作为实验动物中的免疫原通过常规免疫策略来获得靶向作为表位的此IGF-1基序的抗体。
[0011]本发明涉及分离的抗体，其特异性结合在人胰岛素样生长因子I前体(SEQ IDNO:1)中范围为氨基酸76至氨基酸84的氨基酸区段内的此真正的IGF-1表位。
[0012]新抗体具有极大效用，因为它们允许甚至在存在大量过量的紧密相关的IGF-2的情况下灵敏且高度特异性检测胰岛素样生长因子I。
[0013]令人惊讶地，已发现可以利用人胰岛素样生长因子I前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸76至氨基酸90 (SEQ ID NO: 5)的氨基酸区段并将其工程化改造成替代免疫原，由此为生成特异性结合天然IGF-1的C域的抗体铺平道路。我们还发现，在IGF-1的免疫学检测中使用结合包含在人胰岛素样生长因子I前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸76至氨基酸84内的表位的分离抗体可以具有极大的优点。
[0014]发明概述
[0015]令人惊讶地，已发现结合胰岛素样生长因子I(IGF-1)的相当短的部分序列，即由SEQ ID NO:1代表的IGF-1前体的氨基酸76至84 (SEQ ID NO: 3)的抗体具有相当有利的特性且能克服至少一些本领域中已知的问题。
[0016]在一个实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其结合包含在胰岛素样生长因子I前体的氨基酸76-84(SEQ ID NO:3)内的表位。
[0017]在本发明的一个实施方案中，公开了结合包含在SEQ ID NO: 3中的表位，或在此氨基酸区段内的部分序列(SEQ ID NO:4)(例如范围为IGF-1前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸77至84)的单克隆抗体。
[0018]本发明还涉及特异性结合IGF-1的抗体的部分序列和免疫测定方法，所述方法包括下述步骤，将液体样品与依照本发明的抗体一起温育，由此发生所述抗体对所述样品中胰岛素样生长因子I的结合，并检测所述样品中结合至抗胰岛素样生长因子I抗体的IGF-1。
[0019]发明详述
[0020]成熟的人胰岛素样生长因子I (IGF-1)具有约SkDa的分子量并由70个氨基酸组成。IGF-1包含4个明确限定的区域，分别是SEQ ID NO: 2的B (氨基酸残基1_29)、C (30-41)、A (42-62)和 D (63-70)。
[0021]本发明涉及一种分离的抗体，其结合包含在胰岛素样生长因子I的环区(SEQ IDNO:5)内的表位。
[0022]在一个实施方案中，本发明涉及一种分离的抗体，其在胰岛素样生长因子I前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基76-84 (SEQ ID NO: 3)内结合。换言之，依照本发明的分离的抗体结合包含在SEQ ID NO:3中的表位。
[0023]除非另外解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本文公开的发明所属领域中普通技术人员的理解具有相同的意义。
[0024]冠词“一个/ 一种”用于本文指一个/种或超过一个/种(即至少一个/种)冠词语法对象。举例而言，“一个/ 一种抗体”意指一个/种抗体或超过一个/种抗体。
[0025]“表位”是靶分子(例如抗原，如蛋白质或核酸分子)上与抗原结合分子(例如抗体、抗体片段、含有抗体结合区的支架蛋白质或适体)结合的位点。表位既可以从靶分子的连续残基形成，也可以从邻近的不连续残基(例如氨基酸残基)形成。从连续残基(例如氨基酸残基)形成的表位通常也称为线性表位。表位通常包含至少5个且多达约12个残基，大多数介于6个和10个残基(例如氨基酸残基)之间。“分离的”抗体是已鉴定并与其天然环境的组分分开和/或从其回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，且可以包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至按抗体重量计大于70%，如通过例如Lowry方法测定的，且在一些实施方案中，纯化至按重量计超过80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在一个优选的实施方案中，将依照本发明的分离的抗体纯化至超过90%纯度，如通过还原性条件下的SDS-PAGE使用用于蛋白质检测的考马斯蓝染色测定的。
[0026]在一个实施方案中，依照本发明的抗体是多克隆抗体。结合包含在SEQ ID NO:3中的序列的多克隆抗体能够例如通过免疫吸附获得，其使用含有此序列的亲和柱作为免疫吸附材料进行。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是单克隆抗体。
[0027]显而易见的是，通过现有技术方法根本不可能生成针对IGF-1C域的抗体。实际上，用天然重组的IGF-1免疫以及用自IGF-1衍生的肽免疫(Manes S.等，J.Endocrinol.154(1997)293-302)不能生成针对所述表位区域的单克隆抗体。最突出地，用包含胰岛素样生长因子I前体的氨基酸76至84的线性多肽序列来免疫实验动物不能生成既不对天然构象性IGF-1，也不对其线性肽基序展现出结合活性的抗体。
[0028]早期为了免疫实验动物而试图合成充足量的包含胰岛素样生长因子I前体的氨基酸序列76至84的约束性IGF-1肽是不成功的。
[0029]基于本文中公开的新方法，现在可以以可再现方式生成这类难以获得的抗体。简言之，本文中显示的方法包括工程化嗜热栖热菌(Thermus thermophilus) SlyD的使用。SlyD IF (Insert-1n-Flap)底物结合域用来自胰岛素样生长因子I前体的氨基酸序列76至84替换，由此构成具有嫁接的肽免疫原的热稳定性支架模块。
[0030]氨基酸嫁接物由嗜热栖热菌SlyD FKBP域以约束性、焓有利的方式呈现，其保留IGF-1插入基序的天然样二级结构。将此嵌合多肽用作免疫原以免疫实验动物。针对完整多肽的体液免疫应答也靶向插入基序。通过例如相对于野生型伴侣或相对于天然成熟的IGF-1进行比较筛选，可以选出特异性识别IGF-1插入基序的抗体。如此，此嵌合多肽充当天然IGF-1的替代多肽，且令人惊讶地，使得我们第一次能够将免疫应答导向预选择的表位以生成高亲和力抗体。
[0031]提供的方法及由此生成的抗体在研究和常规事务(例如对于治疗和诊断性应用两者)中分别具有重大价值。
[0032]如本文中使用的，术语“结合人IGF-1”或“抗IGF-1抗体”是可交换的。优选地，依照本发明的结合人IGF-1抗原的抗体具有于25 V为1.0xlO^mo 1/1或更低的Kd值，在一个实施方案中，于25°C为1.0X10_9mol/l或更低的Kd值。用标准的结合测定法如表面等离振子共振技术(BIAcore?, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)测定结合亲和力。用于测
定结合亲和力的Kd值的方法记载`于实施例部分。如此，如本文中使用的，“结合人IGF-1的抗体”指于 25°C 以至少 1.0xl(T8mol/l 或更低的 Kd,优选 KD1.0xl(T9mol/l 至 KD10xl(T12mol/I结合人IGF-1抗原的抗体。
[0033]本文中描述的抗体于25°C对IGF-2不显示任何可测量的结合速率常数ka(l/Ms)。该抗体对IGF-1显示从至少ka9X105(l/Ms)或更快(在扩散限附近)的结合速率常数匕(1/Ms)。如此，在一个实施方案中，依照本发明的抗体于25°C对IGF-2不显示可测量的结合速
率常数。
[0034]在一个实施方案中，依照本发明的抗体于25°C显示从至少kd2xl0_3(l/s)至kd3xl0_5(l/s)或更缓慢的抗原复合物稳定性。
[0035]如熟练技术人员会领会的，术语“特异性”用于指示样品中存在的其它生物分子不显著结合特异性结合例如胰岛素样生长因子I的抗体。优选地，结合胰岛素样生长因子I以外的生物分子的水平导致可忽略的，即依靠ELISA或例如使用BiaCore4000仪的亲和力测定测量不到的结合亲和力。
[0036]“特异性结合胰岛素样生长因子I”的抗体不会结合胰岛素样生长因子_2。更准确地，使用高度灵敏性Biacore T200仪的动力学测量不显示这类抗体对IGF-2的任何可测量的结合速率常数匕(腿8)，即使在高分析物浓度时(见例如图7)。此外，“特异性结合胰岛素样生长因子I”的抗体的特征在于在25°C对IGF-1的全功能性化学计量结合，其以一个抗体能够同时结合两个IGF-1多肽的方式进行，该方式由从MR=L 7到MR=2.0的摩尔比(MR)值指示(见图8)。
[0037]使用T200 仪(GE Healthcare, Biacore)测定结合亲和力 KD。
[0038]Biacore T200仪(GE Healthcare)用于对杂交瘤培养上清液动力学评估对IGF-1肽的结合特异性。将CM5系列S传感器嵌入系统并依照制造商用法说明书在HBSN缓冲液(IOmM HEPES pH7.4, 150mM NaCl)中标准化。将系统缓冲液变为 HBS-ET(IOmM HEPESPH7.4，150mM NaCl, 0.05%TWEEN20)。所述样品缓冲液是补充有lmg/ml CMD (羧甲基葡聚糖，Sigma#86524)的系统缓冲液。系统于25°C运行。
[0039]将10000个RU RAMIgGFC(相对单位的相应小鼠免疫球蛋白G亚类的家兔抗小鼠F(c) Y片段/Jackson Laboratories)依照制造商用法说明书固定化,其在流动池FCl (亚类I的抗小鼠F(C) Y )、FC2、FC3和FC4上使用EDC/NHS化学进行。使用IM乙醇胺将传感
器失活。
[0040]动力学测试抗体对例如SEQ ID N0:3(IGF-176-84)的肽的结合活性。通过将在样品缓冲液中以1:3稀释的粗制杂交瘤上清液以10 μ 1/min注射I分钟来捕捉抗体。
[0041]流速设定为100 μ 1/min。将例如SEQ ID NO: (IGF-1前体位置76-84)的肽以OnM、
1.1ηΜ、3ηΜ、10ηΜ、30ηΜ和90nM的不同浓度步骤分别注射3分钟。使用Kinject命令监测解离达600秒。实现传感器表面的酸性再生,其使用IOmM甘氨酸pHl.5以30 μ Ι/min连续注射3次达30秒进行。
[0042]在一个实施方案中，依照本发明的抗体以于25V为1.0xl0_8mol/l或更低的Kd值特异性结合包含在SEQ ID NO:3的氨基酸序列内的表位，即包含在胰岛素样生长因子I前体(SEQ ID NO:1)氨基酸76至84内的表位。如上文提述的，依照本发明的多克隆抗体，即结合包含在SEQ ID N0:3中的表位的多克隆抗体可例如通过使用SEQ ID N0:3的肽进行免疫吸附的免疫吸附从免疫后动物的血清中分离。
[0043]可以以恒定质量且以几乎不受限制的数量生产单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，结合SEQ ID NO:3中包含的表位的抗体是单克隆抗体。
[0044]在一个实施方案中，结合SEQ ID NO: 3的抗体是由杂交瘤细胞系10.07.09 (生成MAb<h-1GF-l>M-10.07.09)生成的单克隆抗体。
[0045]新生成的两种〈IGF-1〉单克隆抗体(分别是生成MAb〈h-1GF-l>M-l1.11.17的
I1.11.17 和生成 MAb〈h-1GF-l>M-ll.09.15 的 11.09.15)结合 SEQ ID NO:3 内包含的甚至更小的表位，即它们结合由SEQ ID N0:4代表的表位。
[0046]在一个实施方案中，本发明的抗体结合包含胰岛素样生长因子I前体的氨基酸76至84的表位，即结合成熟IGF-1的氨基酸28至36 (SEQ ID N0:4)。在一个实施方案中，本发明的抗体结合SEQ ID N0:43到SEQ ID N0:49的合成的15聚体肽，即结合那些包含由胰岛素样生长因子I前体的氨基酸76至84(SEQ ID NO:3)组成的表位的肽。
[0047]在一个实施方案中，本发明的抗体结合包含胰岛素样生长因子I前体的氨基酸77至84(SEQ ID N0:4)的表位。在一个实施方案中，本发明的抗体结合SEQ ID N0:43到SEQ IDNO:50的合成的15聚体肽，即结合那些包含由胰岛素样生长因子I的氨基酸77至84(SEQID NO:4)组成的表位的肽。
[0048]优选地，如实施例部分描述的，通过PepScan分析评估抗体是否结合在SEQ IDN0:3或SEQ ID N0:4中分别给出的氨基酸序列的表位。例如，如果包含SEQ ID N0:3序列的各种PepScan肽在这类分析中用研究的抗体测试呈阳性，那么就承认对SEQ ID N0:3的表位的结合。
[0049]本发明还涉及特异性结合IGF-1的抗体，其特征在于包含SEQ ID NO: 15的⑶R3区作为重链可变域⑶R3区。
[0050]优选地，特异性结合IGF-1的抗体的特征在于，重链可变域包含SEQ ID NO: 15的CDR3 区和 SEQ ID NO: 16 的 CDR2 区。
[0051]优选地，特异性结合IGF-1的抗体的特征在于，重链可变域包含SEQ ID NO: 15的CDR3 区、SEQ ID NO: 16 的 CDR2 区和 SEQ ID NO: 17 的 CDRl 区。[0052]本发明还涉及结合人IGF-1的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQ ID NO: 15的CDR3H 区、SEQ ID NO: 16 的 CDR2H 区和 SEQ ID NO: 17 的 CDRlH 区，轻链可变域包含 SEQ IDNO: 18 的 CDR3L 区、SEQ ID NO: 19 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO:20 的 CDRlL 区。
[0053]本发明还涉及一种抗体或其人源化型式，所述抗体特征在于重链可变域VH是SEQID NO: 21 ;且轻链可变域VL是SEQ ID NO: 22。
[0054]本发明还涉及特异性结合人IGF-1的抗体，其特征在于包含SEQ ID NO: 23的CDR3区作为重链可变域⑶R3区。
[0055]优选地，特异性结合IGF-1的抗体的特征在于，重链可变域包含SEQ ID NO:23的CDR3 区和 SEQ ID NO:24 的 CDR2 区。
[0056]优选地，特异性结合IGF-1的抗体的特征在于，重链可变域包含SEQ ID NO:23的CDR3 区、SEQ ID NO:24 的 CDR2 区和 SEQ ID NO:25 的 CDRl 区。
[0057]本发明还涉及结合人IGF-1的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQ ID NO: 23的CDR3H区、SEQ ID NO:24的CDR2H区和SEQ ID NO:25的CDRlH区，且轻链可变域包含SEQID NO:26 的 CDR3L 区、SEQ ID NO:27 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO:28 的 CDRlL 区。
[0058]本发明还涉及一种抗体或其人源化型式，所述抗体特征在于重链可变域VH是SEQID NO: 29 ;且轻链可变域VL是SEQ ID NO: 30。[0059]本发明还涉及一种抗体或其人源化型式，所述抗体特征在于重链可变域VH是SEQID NO: 31 ;且轻链可变域VL是SEQ ID NO: 32。
[0060]在一个实施方案中，依照本发明的抗体是单克隆的。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是人源化的或人的。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是IgGl或IgG4亚类的。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是IgGl亚类的单克隆人源化抗体。
[0061]本发明还涉及嵌合的或人源化的抗体，其包含分别为SEQ ID N0:15或SEQ IDNO:23 的 HCDR3。
[0062]术语“抗体”涵盖抗体结构的各种形式，包括但不限于全抗体和抗体片段。优选地，依照本发明的抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或者是另外的经遗传工程化的抗体，只要保留依照本发明的特征性特性。
[0063]“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选是其可变域，或至少是其抗原结合位点。抗体片段的例子包括双抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体例如记载于 Huston, J.S.，Methods in Enzymol.203 (1991) 46-88。另外，抗体片段包含单链多肽，其具有结合IGF-1的Vh域或\域的属性，所述Vh域能与\域装配在一起，所述\域能与Vh域装配在一起，从而形成功能性抗原结合位点并由此提供依照本发明的抗体的特性。
[0064]如本文中使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。
[0065]术语“嵌合抗体”指包含来自小鼠的可变区(即结合区)和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体，其通常通过重组DNA技术制备。特别优选包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。这类小鼠/人嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包含编码小鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是那些其中类或亚类已从原始抗体修饰或改变的形式。这类“嵌合”抗体也称为“类转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本领域中现在公知的常规的重组DNA和基因转染技术。参见例如Morrison, S.L.等，Proc.Natl.Acad Sc1.USA81(1984)6851-6855;US5, 202，238 和 US5, 204，244。
[0066]术语“人源化抗体”或“抗体的人源化型式”指其中框架或“互补决定区”(CDR)已经经过修饰以包含相比于亲本免疫球蛋白的特异性具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将VH和VL的CDR嫁接到人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。参见例如 Riechmann, L.等，Nature332 (1988) 323-327 ;和 Neuberger, Μ.S.等，Nature314 (1985) 268-270。重链和轻链可变框架区可自相同或不同的人抗体序列衍生。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列。人重链和轻链可变框架区列于例如Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology(2000)-AppendixlPA.1P.1-A.1P.37中且可经由IMGT,国际ImMunoGeneTics信息系统? (http://imgt.cines.fr)或经由http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk获得。任选地,可通过进一步突变来修饰框架区。特别优选的⑶R对应于那些代表识别上文针对嵌合抗体所记载的抗原的序列的⑶R。优选地，这类人源化型式嵌合有人恒定区。如本文中使用的，术语“人源化抗体”还包括在恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性(尤其是关于Clq结合和/或FcR结合方面)的这类抗体，例如通过“类转换”，即改变或突变Fe部分(例如从IgGl变为IgG4和/或IgGl/IgG4突变)实现。 [0067]如本文中使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk, Μ.Α.和van deffinkel, J.G.，Curr.0pin.Chem.Biol.5 (2001) 368-374)。人抗体还可在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫后在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下能生成人抗体的完整全集或选择。人种系免疫球蛋白基因阵列在这类种系突变体小鼠中的转移将导致抗原攻击时人抗体的生成(参见例如Jakobovits, A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993) 2551-2555;Jakobovits,A.等，Nature362 (1993)255-258;Brueggemann, M.D.等，Yearlmmunol.7 (1993) 33-40)。人抗体还可以在卩遼菌体展示文库中生成(Hoogenboom, H.R.和 Winter, G.，J.Mol.Biol.227 (1992) 381-388; Marks, J.D.等，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。还可使用Cole, A.等和Boerner，P.等的技术来制备人单克隆抗体(Cole, A.等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.R.(1985) p.77;和Boerner, P.等，J.1mmunol.147(1991)86-95)。如已对依照本发明的人源化抗体提述的，如本文中使用的，术语“人抗体”还包括在恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性(尤其是关于Clq结合和/或FcR结合方面)的这类抗体，例如通过“类转换”，即改变或突变Fe部分(例如从IgGl变为IgG4和/或IgGl/IgG4突变)实现。
[0068]如本文中使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的所有人抗体，如从宿主细胞如NSO或CHO细胞或从对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体，或者使用转染到宿主细胞中的重组表达载体所表达的抗体。这类重组的人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。依照本发明的重组人抗体已进行过体内体细胞高突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，尽管其自人种系VH和VL序列衍生并与之相关，但可能不天然存在于体内人抗体种系全集内。
[0069]已证实依照本发明的抗体在借助于免疫测定法从液体样品检测胰岛素样生长因子I中极为有用。
[0070]免疫测定法是熟练的技术人员公知的。用于实施这类测定的方法以及实际应用和规程汇总在相关教科书中。相关教科书的例子是Tijssen, P.，Preparation ofenzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, 于:Practice andTheory of Enzyme Immunoassays, pp.221-278, Burdon, R.H.和 v.Knippenberg, P.H.(eds.), Elsevier, Amsterdam(1990),和涉及免疫学检测方法的 Methods inEnzymology, Colowick, S.P.和Caplan, N.0.(编)，Academic Press 的多个卷,特别是卷70、73、74、84、92 和 121。[0071]在依照本发明的方法的一个实施方案中，在免疫测定规程中测量IGF-1蛋白。
[0072]在某些实施方案中，在酶联免疫吸附测定法(ELISA)或基于电化学发光的免疫测定法(ECLIA)中检测IGF-1。
[0073]在一个实施方案中，在夹心式测定法(夹心型测定法形式)中检测IGF-1。在一个实施方案中，IGF-1的测量在夹心式免疫测定法中实施，其采用与至少两种不重叠表位反应性的至少两种抗体进行。
[0074]在一个实施方案中，本发明涉及用于经由夹心式免疫测定法检测体液样品中的IGF-1的方法，该方法包括以下步骤:将样品与依照本发明的抗体一起温育，由此发生所述抗体对所述样品中胰岛素样生长因子I的结合，将样品与结合不包含IGF-1的氨基酸76至84的表位的针对IGF-1的二抗一起温育，由此发生二抗的结合，并测量在步骤(a)和(b)中形成的免疫夹心式复合物，由此检测样品中的IGF-1。
[0075]夹心式测定法是最有用的且普遍使用的测定法之一。存在许多夹心测定技术的变化，且所有均意图为本发明涵盖。简言之，在一种典型的正向测定法中，将未标记的抗体固定化于固体基底(或固相)上，并使要测试的样品与结合的分子接触。此捕获抗体的固定化可通过直接吸附于固相，或例如经由特异性结合对，例如经由链霉亲合素-生物素结合对间接吸附于固相实现。在合适的温育期后，达到足以允许形成抗体-抗原复合物的时段，然后，添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的、结合该抗原的二抗，并温育，允许足以形成抗体-抗原-经标记的抗体的夹心式复合物的时间。洗掉任何未反应的材料，并通过观察由报告分子产生的信号来测定IGF-1的存在。结果可以是定性的，即通过简单观察可见信号，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品比较来定量。
[0076]在典型的夹心式测定法中，第一抗体共价或非共价结合于固体表面。固体表面通常是玻璃或聚合物，最通常使用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以以管、珠、微板的盘或任何其它适用于进行免疫测定法的表面的形式。结合过程是本领域中公知的，且一般由交联、共价结合或物理吸附组成。通常对经抗体包被的固体表面(“固相复合物”)进行处理以封闭非特异性结合并清洗，为测试样品做准备。然后，向固相复合物添加要测试的样品的等分试样，并在合适的条件(例如从室温到400C，如介于25°C和32°C之间，包含端点)下温育足够的一段时间(例如2_40分钟或者若更方便的话，过夜)，所述条件和时间段容许第一抗体或捕获抗体与相应抗原之间结合。在该温育期后，清洗包含第一抗体或捕获抗体及与其结合的抗原的固相，并与结合抗原上另一表位的二抗或经标记的抗体一起温育。该二抗与报告分子连接，其用于指不二抗对第一抗体和感兴趣抗原的复合物的结合。[0077]测定法的变化包括同时测定法，其中向结合的抗体或能够结合至固相的抗体同时添加样品和经标记的抗体两者。这些技术是本领域中技术人员公知的，其包括如会容易显而易见的任何次要变化。
[0078]—种备选的竞争性方法牵涉将IGF-1固定化于固相上，然后将此固定化的靶物连同样品一起暴露于针对IGF-1的特异性抗体(其可以用或不用报告分子标记)。根据靶物的量和报告分子信号的强度，靶分子的竞争经由这类经标记的抗体可以直接可检测。或者，可以将特异性结合IGF-1的抗体固定化且可经由样品中的IGF-1与经标记的IGF-1的竞争来测定IGF-1。
[0079]在一个优选的实施方案中，使用体液作为样品材料来实践依照本发明的方法。在一个别的实施方案中，体液样品选自全血、血清或血衆。在一个别的实施方案中，所述样品材料是血清或血浆。在一个实施方案中，用于测量IGF-1的免疫测定法使用血清作为样品材料。在一个实施方案中，用于测量IGF-1的免疫测定法使用尿液作为样品材料。
[0080]对于在IGF-1检测中的使用，本发明还提供试剂盒或制品。这些试剂盒可包含载体手段，其区室化为在紧密约束中接受一个或多个容器手段如管形瓶、管等，每个容器手段包含要在所述方法中使用的不同要素之一。例如，一个容器手段可包含依照本发明的抗体。试剂盒还可具有包含报告手段，如与报告分子(如酶、荧光或放射性同位素标记物)结合的结合IGF-1的二抗的容器。这类试剂盒将通常包含如上文描述的容器和一个或多个包含从商业和用户观点而言期望的材料的其它容器，所述材料包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。容器上可存在标签以指示该组合物用于特定应用，且还可指示使用指导。
[0081]在一个别的具体的 实施方案中，对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可包含例如:
(I)特异性结合IGF-1的第一抗体(例如附接于固体支持物或能够结合固体支持物)和(2)结合IGF-1的第二不同抗体。优选地，后一抗体用报告分子标记。当然，在设计此类测定法时，还可以将第一抗体交换为第二抗体或反之亦然。
[0082]提供以下实施例、序列表和图以帮助对本发明的理解，其真实范围在所附权利要求书中列出。应理解可在不背离本发明的精神的前提下对所列规程进行修改。
[0083]序列表的描述
[0084]SEQ ID NO:1 人胰岛素样生长因子I前体的序列
[0085]SEQ ID NO:2 成熟人胰岛素样生长因子I的序列
[0086]SEQ ID NO: 3 人胰岛素样生长因子I前体的部分序列(位置76至84)
[0087]SEQ ID NO:4 人胰岛素样生长因子I前体的部分序列(位置77至84)
[0088]SEQ ID NO: 5 人胰岛素样生长因子I前体的部分序列(位置74至90)
[0089]SEQ ID NO:6 人工序列:(gly-gly-gly-ser)
[0090]SEQ ID NO:7 人工序列:(His 标签)
[0091]SEQ ID NO:8 人工序列:FkBP-1GF-1 (M-9O)融合蛋白
[0092]SEQ ID NO:9 人工序列:SlyD-FkBP-1GF-l (74-90)融合蛋白
[0093]SEQ ID NO: 10人工序列:嗜热栖热菌-SlyD-1GF-l (74-90)融合蛋白
[0094]SEQ ID NO: 11 人工序列:嗜热栖热菌(Thermus thermophile)野生型SlyD蛋白
[0095]SEQ ID NO: 12人工序列:缺少IF域的嗜热栖热菌SlyD[0096]SED ID NO: 13 人工序列:Thermococcus gammatolerans SlyD-1GF-1 (74-90)融合蛋白
[0097]SED ID NO: 14 人工序列:Thermococcus gammato lerans SlyD-1GF-2 (53-65)融合蛋白
[0098]SEQ ID NO: 15 MAbl0.07.09 的重链 CDR3H
[0099]SEQ ID NO: 16 MAb 10.07.09 的重链 CDR2H
[0100]SEQ ID NO: 17 MAbl0.07.09 的重链 CDRlH
[0101]SEQ ID NO: 18 MAb 10.07.09 的轻链 CDR3H
[0102]SEQ ID NO: 19 MAb 10.07.09 的轻链 CDR2H
[0103]SEQ ID NO:20 MAb 10.07.09 的轻链 CDRlH
[0104]SEQ ID NO: 21 MAbl0.07.09 的重链可变域 VH
[0105]SEQ ID NO:22 MAbl0.07.09 的轻链可变域 VL
[0106]SEQ ID NO: 23 MAbll.11.17 的重链 CDR3H
[0107]SEQ ID NO: 24 MAbll.11.17 的重链 CDR2H [0108]SEQ ID NO: 25 MAbll.11.17 的重链 CDRlH
[0109]SEQ ID NO: 26 MAbll.11.17 的轻链 CDR3H
[0110]SEQ ID NO: 27 MAbll.11.17 的轻链 CDR2H
[0111]SEQ ID NO: 28 MAbll.11.17 的轻链 CDRlH
[0112]SEQ ID NO: 29 MAbll.11.17 的重链可变域 VH
[0113]SEQ ID NO: 30 MAblL IL 17 的轻链可变域 VL
[0114]SEQ ID NO: 31 MAbll.09.15 的重链可变域 VH
[0115]SEQ ID NO: 32 MAbll.09.15 的轻链可变域 VL
[0116]SED ID NO:33-62表位分析中使用的人胰岛素样生长因子I前体的部分序列。
【专利附图】

【附图说明】
[0117]图1嗜热栖热菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽的SDS PAGE (考马斯染色)和抗his标签Western印迹(10秒暴露)。M-Novex Sharp标准品；1_2.5 μ g嗜热栖热菌 SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽;2_5.0yg 嗜热栖热菌 SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽；3-10 μ g 嗜热栖热菌 SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽；M*_Magic Mark。
[0118]图2嗜热栖热菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽的分析性HPLC层析谱(上方线:分子量标准品；下方线:融合多肽)。
[0119]图312周免疫后通过ELISA测定的小鼠中的血清滴度，其分别使用嗜热栖热菌SlyD-1GF-1 (74-90)和人IGF-1 (=IGF-1)作为捕捉抗原进行(mE=毫吸光度)。
[0120]图4对原代培养物的ELISA筛选，其显示对IGF-1、嗜热栖热菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽和嗜热栖热菌野生型SlyD多肽的结合信号(mE=毫吸光度，IGF-1=人IGF-1)。
[0121]图5原代培养物〈IGF-DM-11.0.15对IGF-1、IGF-2、嗜热栖热菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽和嗜热栖热菌野生型SlyD多肽的例示性BIAcore动力学筛选。(该原代培养物称为11.0.15，而在最终克隆后名称是11.10.15)。
[0122]图6克隆培养上清液对IGF-1、嗜热栖热菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽和嗜热栖热菌野生型SlyD多肽的ELISA筛选。用IGF-1和嗜热栖热菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽检测到指示改进的结合亲和力的升高的吸收信号。
[0123]图 7〈IGF-1>M-11.11.17-1gG 对 IGF_1、IGF_2、嗜热栖热菌 SlyD-1GF-1 (74-90)融合多妝、嗜热栖热菌野生型SlyD多妝、Thermococcus gammato lerans野生型SlyD多妝嗜热栖热菌 SlyD- Δ IF 融合多妝和 Thermococcus gammato I eransSlyD-1GF-2 (53-65)融合多肽的BIAcore测量。
[0124]图8具有新开发的抗IGF-1抗体的结合动力学的表。mAb:单克隆抗体；RU:传感器上捕获的单克隆抗体的相对应答单位；抗原:溶液中抗原；kDa:作为溶液中分析物注射的抗原的分子星；ka:结合速率常数；kd:解尚速率常数;t"2解离:依照公式ti/2解离=In (2)/60xkd计算的抗体-抗原复合物半衰期；KD:解离常数:90nM分析物注射结合阶段结束时的结合信号；MR:摩尔比；X2:测量的卡方检验；n.d.:未检出。
实施例
[0125]实施例1
[0126]生成单克隆抗体的通用规程
[0127]将预配制的融合 多肽免疫原以不同剂量对实验动物腹膜内施用，所述实验动物如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或仓鼠。在收集B细胞前，实施加强免疫。可依照Koehler和Milstein (Koehler, G.和 Milstein, C.，Nature256 (1975) 495-497)的方法获得 B 细胞杂交瘤。将获得的杂交瘤作为单一克隆或细胞存储在多孔板的孔中。用动力学筛选方法进一步筛选分泌的抗体就抗体结合而言测试呈阳性的原代杂交瘤培养物。
[0128]实施例2
[0129]使用SlyD/FKBP12-1GF_l (74-90)融合多肽生成针对胰岛素样生长因子I的抗体
[0130]在针对IGF-1的单克隆抗体的生成中，可将包含氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQ ID NO:5)的融合多肽用于免疫实验室动物。
[0131]为了改进免疫原性多肽的呈现，SEQ ID NO:5的IGF-1转角-环基序侧翼可以有在该氨基酸序列N端和C端的GGGS接头(SEQ ID NO: 6)，或者有在IGF-1氨基酸序列N端的HG 二肽以及有在IGF-1氨基酸序列C端的GA 二肽。
[0132]将SlyD/FKBP12-1GF_l (74-90)融合多肽用作免疫原以及也用作开发抗IGF-1抗体的筛选试剂，该抗IGF-1抗体特异性结合由NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQ ID NO:5)组成的IGF-1氨基酸序列。
[0133]还包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列标签的FKBP12-1GF-1 (74-90)融合多肽具有以下氨基酸序列:
[0134]MGVQVETISP⑶GRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSNKPTGYGSSSRRAPQTGGGSTLVFDVELLXLEGGGSKKHHHHHHHH(SEQ IDNO: 8)
[0135]包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列标签的SlyD/FKBP12_IGF_l (74-90)融合多肽具
有以下氨基酸序列:
[0136]MKVAKDLWSLAYQVRTEDGVLVVESPVSAPLDYLHGHGSLISGLEIALLGHEV ⑶ KFDVA VGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRPLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISP⑶GRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVSQRAKLTISPDYAYGGGGSNKPTGYGSSSKRAPQTGGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SLQ ID NO:9).[0137]使用ELISA分析从用SlyD/FKBP12-1GF_l (74-90)融合多肽免疫过的NMRI小鼠获得的细胞。将 Nunc Maxisorb F 多孔板用 SlyD/FKBP12_IGF_l (74-90)或 SlyD/FKBP12 对照(缺少SEQ ID NO:5的肽)包被，其通过应用包含每ml0.41 μ g多肽的溶液进行。随后，通过在室温应用包含PBS中1%RPLA的溶液I小时来封闭游离结合位点。将孔用包含0.9%(w/V)氯化钠和0.05%(w/v) Tween的溶液清洗3次。将化学生物素化的IGF-1 (Peprotech,人IGF-1，Cat.#100-11)和包含SEQ ID NO:5的氨基酸3至15的生物素化IGF-1肽环分别固定化于StreptaWell High Bind SA多孔板的孔中，其通过分别应用包含90ng/ml生物素化的IGF-1或500ng/ml生物素化的IGF-1肽环的溶液进行。该环肽开始于与SEQ ID NO:5的位置2对应的半胱氨酸，且另外含有对应于SEQ ID NO: 5的位置16的半胱氨酸。这两个半胱氨酸已经用于环化该肽，由此形成肽环。N端半胱氨酸进一步用于生物素化。
[0138]作为样品，使用用PBS以1:50稀释的小鼠血清。以1:4阶梯实施任选的进一步稀`释直至最终稀释为1:819，200`。温育时间为室温I小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和
0.05%(w/v) Tween的溶液清洗3次。作为检测抗体,使用与过氧化物酶缀合的针对祀抗体的恒定域的多克隆抗体(PAK〈M-Fc Y >S-F(ab’)2-P0D)。以包含 l%(w/v)RSA 的 PBS 中 80ng/ml的浓度应用检测抗体。温育时间为室温I小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v) Tween的溶液清洗3次。然后，将孔与ABTS溶液在室温温育15分钟。用光度计测定显现颜色的强度。例示性结果在下表呈现。
[0139]表
[0140]
【权利要求】
1.一种分离的抗体，其结合包含在胰岛素样生长因子I前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸76 至 84(SEQ ID NO:3)内的表位。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求2的抗体，其中所述抗体的特征在于重链可变域包含SEQID NO: 15的⑶R3区。
4.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体的特征在于重链可变域包含SEQID NO: 15的CDR3 区、SEQ ID NO: 16 的 CDR2 区和 SEQ ID NO: 17 的 CDRl 区。
5.权利要求2的抗体，其中所述抗体的特征在于重链可变域包含SEQID N0:15的CDR3H区、SEQ ID NO: 16的CDR2H区和SEQ ID NO: 17的CDRlH区，且轻链可变域包含SEQID NO: 18 的 CDR3L 区、SEQ ID NO: 19 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO: 20 的 CDRlL 区。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合包含在胰岛素样生长因子I前体(SEQIDNO:1)的氨基酸77至84 (SEQ ID NO:4)内的表位。
7.权利要求6的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
8.权利要求7的抗体，其中所述抗体的特征在于重链可变域包含SEQID NO:23的⑶R3区。
9.权利要求7的抗体，其中所述抗体的特征在于重链可变域包含SEQID NO:23的⑶R3区、SEQ ID NO:24 的 CDR2 区和 SEQ ID NO:25 的 CDRl 区。
10.权利要求7的抗体，其中所述抗体的特征在于重链可变域包含SEQID NO:23的CDR3H区、SEQ ID NO:24的CDR2H区和SEQ ID NO:25的CDRlH区，且轻链可变域包含SEQID NO:26 的 CDR3L 区、SEQ ID NO:27 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO:28 的 CDRlL 区。
11.一种用于经由夹心式免疫测定法检测体液样品中的IGF-1的方法，所述方法包括以下步骤: a)将所述样品与依照权利要求1至10中任一项的抗体一起温育，由此发生所述抗体对包含在所述样品中的胰岛素样生长因子I的结合`， b)将所述样品与结合不包含IGF-1前体的氨基酸76至84的表位的针对IGF-1的第二抗体一起温育，由此发生所述第二抗体的结合，并 c)测量在步骤(a)和(b)中形成的免疫学夹心复合物，由此检测所述样品中的IGF-1。
【文档编号】C07K16/22GK103649119SQ201280033255
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年5月4日 优先权日:2011年5月5日
【发明者】H.安德雷斯, H.杜菲尔, M.格格, F.科瓦列威斯基, C.肖尔茨, M.施雷姆尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司