一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的分离纯化方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的分离纯化方法及其应用，属 于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎（简称乙肝）疫苗已大规模使用愈20年，但乙型肝炎病毒化epatitis Bvirus,皿V)感染仍是最为严重的全球性健康问题之一。据世界卫生组织报道，全世界约20 亿人有现状或既往乙肝病毒感染标志，每年约有60万人死于皿V感染引起的肝衰竭、肝硬化 和肝细胞癌。我国乙肝病毒携带者超过1亿，现有患者超过2000万，南方流行重于北方，农村 重于城市。目前并无特异性治疗乙肝的药物，最有效的手段就是接种乙肝疫苗。
[0003] 第一代乙肝疫苗为血源疫苗，采用无症状带毒者化BsAg阳性)血浆为原料制备。由 于提取方法不同，所得成分也有差别，但均含提纯的22皿小颗粒乙型肝炎表面抗原。80年代 W来开始研制第二代乙肝疫苗，系将S基因编码的226个氨基酸产物装配而成的抗原颗粒， 采用基因工程方法在哺乳动物细胞和重组酵母中均能表达。重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母） 乙肝疫苗是最新一代基因工程乙肝疫苗，是继血源疫苗、酿酒酵母疫苗之后的第=代疫苗， 系国家863重大科技攻关成果，已有2000万名受种者验证了其安全性。对皿SAg阳性母亲所 生新生儿，本市已将母婴阻断率较高的重组(汉逊酵母）乙肝疫苗纳入免疫规划，在出生12 小时内给予免费接种;在本地的临床观察中，健康成人全程接种后1个月，97.46%的受种者 抗体阳转;全程接种后半年，59.8%的受种者抗体水平在lOOOmlU/mLW上，因而保护期更 长。按照世界卫生组织资料，不同乙肝疫苗的相对效力不W皿SAg含量来判断，IOug重组(汉 逊酵母)疫苗适用于任意年龄的易感人群，能提供全面高效持久的免疫保护屏障。免疫预防 为主，有效遏制乙肝的高流行状态，基因重组(汉逊酵母)技术为乙型肝炎的免疫预防提供 了一种全新的选择。
[0004] 多形汉逊酵母(化nsenula化lymo;rpha)，又称作Pichia augusta，是当前公认的 最为理想的外源基因表达系统之一。汉逊酵母也是一种甲醇营养型酵母，与毕赤酵母类似。 汉逊酵母中甲醇代谢的主要途径有两种化odeboerA.M.，etal.，1985):-种是在过氧化物 酶体中进行，甲醇在甲醇氧化酶(methanoloxidase，M0X)作用下生成甲醒和也化，甲醒再经 甲醒脱氨酶（formaldehyde dehy化Ogenase)和甲酸脱氨酶（formate dehy化Ogenase，FMD) 作用下生成C〇2，也化在过氧化氨酶(catalase，CAT)的作用下生成也0和化；甲醇的另一个代 谢途径发生在过氧化物酶体外，甲醇在细胞质中经过一系列酶的催化作用最后转变为糖 类，其中二径丙酬合成酶(dihydro巧acetone synthase,DHAS)是运一过程的关键酶。甲醇 代谢过程中的各种关键酶，包括M0X、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们 受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0.1%时，阻遏 作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80%，M0X和DHAS 可占细胞总蛋白的15%，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用 作外源基因在酵母中表达的常用启动子。汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生 物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵 母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如 酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长W及毕赤酵 母(Pichia Pastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产 的药物(如膜岛素，商品名Wo SU1 i n)及皿V疫苗(商品名化pa vax-Gene)均已上市销售。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗 原的分离纯化方法及其应用，适用于规模化生产皿SAg重组蛋白。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗 原的方法，包括W下步骤：
[0007] 1)取常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养液，通过离 屯、并洗涂用于表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞，然后置于高压匀破碎直至细胞破碎率达 到90 %，向破碎液中加0.05~1.0 % (v/v)的表面活性剂吐溫20，调节pH值至8.5，2~8°C下 揽拌4~16小时，得悬浮液；
[0008] 2)将步骤1)制备的悬液pH值调节至8.5后，离屯、除去细胞碎片，调整电导率小于 5 . OmS/cm，0.45叫1或0.化m微滤，然后进行阴离子交换层析，层析介质为DEAE Sepherose FF，收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性的流穿；
[0009] 3)将步骤2)得到的悬液使用缓冲液稀释2~4倍，吐溫20终浓度0.05~0.9% ;
[0010] 4)将步骤3)得到的稀释液进行阳离子交换层析，所述的阳离子交换层析介质的配 基为横丙基或季锭盐，上样结束后，使用含有吐溫20终浓度0.05~O . 9 %的缓冲液再平衡， 收集含汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原活性的流穿；
[0011] 5)对经步骤4)中阳离子交换层析所得组分，采用截留分子量为100~500KD的超滤 膜将样品一次或多次重复浓缩，直至样品中蛋白质浓度为1.0~2. Omg/ml;
[0012] 6)将步骤5)得到的浓缩液使用凝胶过滤柱进行凝胶过滤，去除部分乙肝表面抗原 病毒样颗粒形成的聚集物，最后得到纯度大于99% W上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗 原。
[0013] 另外，本发明还提供一种上述方法分离纯化得到重组乙肝表面抗原在生产乙肝疫 苗上的应用。
[0014] 采用本发明所述方法，可W将汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原高效的分离和纯 化，适用于规模化生产皿SAg重组蛋白，同时能有效的用于生产乙肝疫苗。
【附图说明】
[0015] 图1为甲醇诱导型汉逊酵母高效表达载体pHPZFl.O的构建全过程；
[0016] 图2为乙型肝炎病毒表面抗原皿sAg高效表达重组载体pHPZFl. O-ZS的构建全过 程；
[0017] 图3为SDS-PAGE电泳检测不同重组子皿sAg重组蛋白表达情况：
[0018] M为标准分子量蛋白（PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder part No.26616 10~170邸a,Thermo Scientific公司产品）；
[0019] I为阴性对照，pHPZFl. 0空载体转化的重组酵母菌株培养120小时破碎液；
[0020] 2~9分别源自pHPZFl .O-ZS转化酵母不同重组子培养120小时破碎液；
[0021] 图4为Western-Blot电泳检测不同重组子皿sAg重组蛋白表达情况；
[0022] M为标准分子量蛋白（PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder part No.26616 10~170邸a,Thermo Scientific公司产品）；
[0023] I为阴性对照，pHPZFl. 0空载体转化的重组酵母菌株培养120小时破碎液；
[0024] 2~9分别源自pHPZFl. O-ZS转化酵母不同重组子培养120小时破碎液；
[00巧]Western-Blot使用的一抗为抗皿sAg的鼠源原抗化ep B皿sAg(1023):sc-53299， SANTA CRUZ公司产品）。
[0026] 图5为发酵过程中菌体湿重和SDS-PAGE电泳检测抗原表达的变化情况：
[0027] M为标准分子量蛋白（PierceTM unstained Protein Molecular Wei曲t Marker part No.26610 14.4~116邸a,Thermo Scientific公司产品）；
[002引I~10分别为源自工程菌皿sAgl .0-38G1不同发酵时间点菌体的破碎液，对应的时 间点分别为24、48、54、60、66、72、78、84、90和96小时，皿sAg重组蛋白的分子量20~25kD; [0029 ]图6为重组蛋白皿sAg层析纯化后的蛋白检测：
[0030] M为标准分子量蛋白（PierceTM unstained Protein Molecular Wei曲t Marker part No.26610 14.4~116邸a,Thermo Scientific公司产品）；
[0031] 其中，I为破碎液上清；2为阴离子交换层析产物；3为阳离子交换层析产物；4为 300K中空纤维柱浓缩后产物;5为分子筛产物；
[0032] 图7为纯化后的重组蛋白皿sAg的HPSEC检测图谱。
【具体实施方式】
[0033] 下面W汉逊酵母组成型表达皿SAg蛋白为例，描述一些优先的实施方案，但本发明 的应用不仅限于此。本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请 要求W及为了解释和说明本