专利名称：：一种重组多型汉逊酵母菌及其专用重组表达载体与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组多型汉逊酵母菌及其专用重组表达载体与应用。技术背景尿酸氧化酶(Urateoxidase，Uricase，EC.1.7.3.3)是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，催化尿酸氧化为尿囊素和过氧化氢，尿囊素是除人和猿类以外的其它哺乳动物嘌呤代谢的排泄物。但在高等哺乳动物(猿和人类)体内没有尿酸氧化酶，而以尿酸作为嘌呤代谢的终产物。尿酸及其盐类在血液中溶解度很低，如果体内嘌呤代谢紊乱，产生过量尿酸，或者尿酸排泄受阻，血液中尿酸浓度增高，形成高尿酸症，长期尿酸过高就会引起痛风。尿酸氧化酶是一种重要的医药用酶。在临床上，被广泛用于尿酸的检测及痛风、高尿酸血症和肿瘤溶解综合征的治疗。微生物是尿酸氧化酶的重要来源，目前来源于细菌、酵母菌和丝状真菌的尿酸氧化酶已被分离。但天然来源的尿酸氧化酶由于受产酶条件及产酶水平的影响，而限制了在商业化生产中的有效应用，因此尿酸氧化酶的异源表达逐渐成为研究的热点。已有不同来源的尿酸氧化酶在大肠杆菌和酿酒酵母中进行了异源表达，虽然都获得了有生物活性的蛋白质产物，但仍然存在酶产量低，分离纯化程序复杂的问题。更为重要的是天然来源的酶或在大肠杆菌和酿酒酵母中异源表达的酶抗原性高，必须经过修饰才能应用于临床治疗上。近年来，汉逊酵母作为外源基因表达系统越来越受到人们的重视。由于其表达的外源蛋白抗原性低而成为生产具有重要医用价值蛋白质的理想的微生物细胞工厂。但目前在国内外还没有尿酸氧化酶在汉逊酵母中表达的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种重组多型汉逊酵母菌及其专用重组表达载体与应用。本发明所提供的重组表达载体，是含有如下表达盒的重组酵母表达载体；所述表达盒从上游至下游依次包括甲醇氧化酶基因的启动子、尿酸氧化酶基因和转录终止子。其中，上述重组表达载体中的所述尿酸氧化酶基因为编码如下蛋白(a)或(b)的基因(a)由GenBankAcessionNo.BM06804的自氨基末端第1—303位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且具有尿酸氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明中所述尿酸氧化酶基因来源于产朊假丝酵母(Ai/"h's)CGMCC2.120(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。并且，所述表达盒还包括酿酒酵母a因子信号肽的编码序列，所述酿酒酵母a因子信号肽的编码序列位于所述甲醇氧化酶基因的启动子和所述尿酸氧化酶基因之间，且与所述尿酸氧化酶基因形成融合基因。其中，所述酿酒酵母a因子信号肽的编码序列是编码如下蛋白的DNA分子由GenBankAcessionNo.M55016的自氨基末端第1一89位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述重组表达载体中含有的所述甲醇氧化酶基因启动子为如下a)或b)的DNA分子a)GenBankAcessionNo.A11156的核苷酸序列自5'端1-1510位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；b)严格条件下与a)限定的DNA序列杂交的DNA分子；上述严格条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65T下杂交并洗膜。所述酵母表达载体具体可为pGAPZ-alpha-A，所述乙醇氧化酶基因的终止子序列来源于所述载体pGAPZ-alpha-A，所述载体pGAPZ-alpha-A上还带有Zeocin抗性基因。本发明提供的重组多型汉逊酵母也属于本发明的保护范围。本发明所述的重组多型汉逊酵母菌(^a/^e/^a/oJy/Hor/7力a)，是将所述重组表达载体导入多型汉逊酵母菌中得到重组菌。所述载体导入的酵母宿主优选为多型汉逊酵母(vfe/^朋"7apo/y迈orp力a)CGMCC2.2498。本发明得到的能稳定分泌表达尿酸氧化酶的重组多型汉逊酵母菌(泡/7se加7a/o7/历or/7力a)HPMU6，已于2008年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路)，保藏编号为CGMCCNo.2351。其菌落呈凸起状、乳白色、有光泽、边缘整齐，细胞呈椭圆形，该菌株的最适生长温度为37。C，生长最适pH为5.5。本发明中构建所述重组多型汉逊酵母的方法包括以下步骤1)构建适用于外源基因在多型汉逊酵母中进行表达的载体pMOXZ-alpha-A;2)将产朊假丝酵母尿酸氧化酶的编码序列WZw插入到载体pMOXZ-alpha-A的多克隆位点，获得表达载体pMOXZ-alpha-U0Xu。3)线性化的表达载体pMOXZ-alpha-UOXu电转化多型汉逊酵母(泡/7se/whpWy/z/or/^a)CGMCC2.2498，获得产尿酸氧化酶的重组多型汉逊酵母菌株。本发明所述重组多型汉逊酵母菌可在生产尿酸氧化酶中的应用。重组多型汉逊酵母菌发酵生产尿酸氧化酶具体过程包括斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养、发酵罐发酵培养。其中所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基为分别含有lml/100ml、2ml/100ml、4ml/100ml甘油的YPG培养基，pH为5.5-7.0。在生产过程中，向发酵罐发酵培养基中流加0.5ml/100ml甲醇诱导所述尿酸氧化酶的表达。尿酸氧化酶是重要的医学用酶，有效地提高尿酸氧化酶的产量和降低其免疫原性对尿酸氧化酶在医学领域的广泛应用至关重要。多型汉逊酵母是医用蛋白进行异源表达的理想的宿主系统。本发明在国内外首次实现了尿酸氧化酶在多型汉逊酵母中的表达，利用甲醇氧化酶基因启动子和酿酒酵母a因子信号肽序列实现尿酸氧化酶的诱导性分泌表达，利用甲醇氧化酶基因启动子序列为同源整合位点使尿酸氧化酶多拷贝整合到多型汉逊酵母染色体上，获得遗传稳定的重组菌株。重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351的生理生化特性与常规的多型汉逊酵母没有明显差异，对发酵培养基和发酵条件没有特殊要求，通过在简单培养基中的高密度发酵可以实现尿酸氧化酶的高效表达。图1为甲醇氧化酶基因启动子序列PCR产物的电泳2为ct信号肽序列PCR产物的电泳3为载体pMOXZ-alpha-A的构建过程示意4为尿酸氧化酶编码序列Z/OJw的PCR产物电泳5为重组表达载体pMOXZ-alpha-UOXu的构建过程示意6为重组多型汉逊酵母的Zeocin抗性筛选图图7为重组多型汉逊酵母的PCR分析8为重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351在摇瓶实验中产尿酸氧化酶的时间曲线图9为重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351高密度发酵产尿酸氧化酶时间曲线图10为高密度发酵实验中重组多型汉逊酵母产尿酸氧化酶的SDS-PAGE检测具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、构建产尿酸氧化酶的重组多型汉逊酵母(J7朋s朋"7apWj^orp力a)一、含有尿酸氧化酶编码序列的重组表达载体pMOXZ-alpha-U0Xu的构建1、甲醇氧化酶基因抓J启动子序列的PCR扩增根据文献报导的MOXl启动子的核甘酸序列(GenBankAccessNo.A11156自5'末端第1-1510位的脱氧核糖核苷酸所示的序列)，设计引物M0Xp-L:5，-TCAAGATCTTCGACGCGGAGAACGATCT-3，MOXp-R:5，-CCGAAGCTTTGTTTTTGTACTTTAGATTGATG-3'划线部分分别是^^II和历'/7din识别位点。PCR反应以M0Xp-L、MOXp-R为引物，以多型汉逊酵母CGMCC2.2498的基因组DNA为模板，在50ji1PCR反应混合液中含25plPfuMix，10(imol/l引物各2nL，0.3ng/(xl模板DNAlO(il，加无菌水llpl调整至50^d。反应条件为94。C，变性5min，循环参数94。C变性40s;56。C退火lmin;72。C延伸2min;30个循环；72。C延伸15min使产物延伸完全。将得到的PCR产物进行O.8%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图l所示，得到一条约1.5kb的特异性条带，其大小与预期相当。图1中，泳道1为DNA分子量标准(4500，3000，2000，1200,800，500，200bp)，泳道2为PCR扩增MM启动子序列的产物。回收该约1.5kb的DNA片段，进行测序，结果表明扩增得到的抓W启动子具有GenBankAccessNo.A11156的自5'端第1一1510位脱氧核糖核苷酸所示的序列。2、酿酒酵母ct信号肽序列的PC財广增根据文献报道的酿酒酵母a信号肽序列设计引物。-L5，-CACAAGCTTCGMACGATGAGATTTCCTTC-3，,和"-R5'-CGTGAATTCAGCTTCAGCCTC-3';划线部分分别为历'"dni和fcoRI识别位点。以载体pGAPZ-alpha-A(Invitrogen，USA)为模板进行PCR扩增。在50(ilPCR反应混合液中含25plPfuMix,10(omol/l引物各2^iL，0.3fig/pl模板DNAlOpl，加无菌水llfil调整至50(n。反应条件为94'C，变性5min，循环参数94'C变性40s;56'C退火lmin;72"C延伸lmin;30个循环；72'C延伸15min使产物延伸完全。将得到的PCR产物进行2。/。的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，扩增产物约270bp，其大小与预期一致。图2中，泳道l为DNA分子量标准(4500，3000，2500，2000,1500，1000,800，500，400，200,100bp)，泳道2为PCR扩增a信号肽序列的产物。回收该约270bp的DNA片段，进行测序，结果表明扩增得到的酿酒酵母a信号肽序列具有GenBankAccessNo.M55016自5'端第293—560位脱氧核糖核苷酸所示的序列，编码由GenBankAcessionNo.AAA34778.1自氨基末端第1一89位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。3、载体pM0XZ-alpha-A的构建用^^II和fcoRI酶切载体pGAPZ-alpha-A(InvitrogenUSA)，用万Wn和^z'/2dlII酶切PCR扩增的MZi启动子序列(M0Xp)，用历'/dni和AcoRI酶切PCR扩增的酿酒酵母a信号肽序列(alpha-MF)。低烙点琼脂糖凝胶电泳回收酶切的各DNA片段，然后在T4-DNA连接酶的作用下，将上述三个DNA片段连接，得到载体pMOXZ-alpha-A(图3)。4、重组表达载体pMOXZ-alpha-U0Xu的构建根据GenBankAccessNo.D32043中报道的产朊假丝酵母尿酸氧化酶的核甘酸序列设计引物UOXu-L5'-CTGGAATTCATGTCAACAACGCTCTCATC-3'，和UOXu-R5'-GCCTCTAGATTACAACTTGGTCTTCTCCT-3'，划线部分分别为AcoRI和必al识别位点。以UOXu-L和UOXu-R为引物，以产朊假丝酵母CGMCC2.120总DNA为模板，进行PCR扩增。在50|alPCR反应混合液中含25plPfuMix,10(imol/l引物各2pL，0.3jigAi1模板咖AlOpl，加无菌水ll|il调整至50nl。反应条件为94。C，变性5min，循环参数94。C变性40s;56。C退火lmin;72。C延伸1.5min;30个循环；72。C延伸15rain使产物延伸完全。将得到的PCR产物进行iy。的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示，扩增产物约909bp，其大小与预期一致。回收该约909bp的DNA片段，进行测序，结果表明扩增得到的产朊假丝酵母尿酸氧化酶基因序列具有GenBankAccessNo.D32043自5'末端第356—1264位脱氧核糖核苷酸所示的序列，编码由GenBankAcessionNo.BAA06804自氨基末端第1—303位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。图4中，泳道1为DNA分子量标准(4500，3000,2000，1200,800，500，200bp)，泳道2为PCR扩增尿酸氧化酶编码序列的产物，命名为WJ"。用&oRI和化al酶切载体pMOXZ-alpha-A和WJw，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切的DNA片段，然后在T4-DNA连接酶的作用下，将上述两个DNA片段连接，得到重组表达载体pM0XZ-alpha-U0Xu(图5)。二、重组多型汉逊酵母的构建分别用5bal酶切载体pMOXZ-alpha-A，用&cll酶切载体pMOXZ-alpha-U0Xu，使载体线性化。线性化的载体通过电转化法(Bio-RadGene-Pulser仪，1.5kV，50uF，200Q，3mSec)转化多型汉逊酵母(泡/^朋〃hpWi^arpAg)CGMCC2.2498。在含有lOOug/mlZeocin的YEPDS(含1M山梨醇的YEPD)培养基平板上筛选转化子。获得Zeocin抗性转化子。在含有不同浓度Zeocin(100-1000ug/ml)的YEPD培养基平板上，检测不同转化子的Zeocin抗性，获得分别抗100、200、500和1000ug/mlZeocin的转化子(图6)。提取不同转化子的基因组DNA，以此为模板，用U0Xu-L和UOXu-R为引物进行PCR扩增，结果从重组转化子中均扩增出约909bp的DNA片段，而以空载体转化的对照菌的基因组DNA为模板时，没有PCR产物(图7)。说明尿酸氧化酶基因已整合到多型汉逊酵母染色体上。图7中，泳道l:阳性对照；泳道2:PC財广增空载体转化子基因组的产物；泳道3:PCR扩增抗100ug/mlZeocin的重组多型汉逊酵母基因组DNA的产物；泳道4&5:PC財广增抗200ug/mlZeocin的重组多型汉逊酵母基因组DNA的产物；泳道6&7:PCR扩增抗500ug/mlZeocin的重组多型汉逊酵母基因组DNA的产物；泳道8:PCR扩增抗1000ng/ralZeocin的重组多型汉逊酵母基因组DNA的产物。三、重组多型汉逊酵母产尿酸氧化酶能力的比较将分别抗IOO、200、500和1000ug/mlZeocin的重组转化子和作为对照的空载体转化子接于10mlYPG培养基(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甘油)中，37°C，200rpm培养20小时，离心收集细胞，无菌水洗两次后，细胞重悬于10mlYPM培养基(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甲醇)中，37°C，200rpm进行诱导培养，每24小时补加甲醇至终浓度为0.5ml/100ml。每12小时取发酵液，测定尿酸氧化酶活性，尿酸氧化酶的活性测定按照辣根过氧化物酶方法进行，具体方法如下溶液的配制尿酸溶于O.1M，pH8.5的硼酸盐缓冲液中，尿酸终浓度为2mmol/l;30mmol/l的4-氨基安替比林(4-AAP)水溶液；体积百分数l.5%苯酚水溶液；20U/ml的辣根过氧化物酶水溶液；分别配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.Ommol/1的过氧化氢水溶液；标准曲线的制备反应体系含O.3ral过氧化氢水溶液，2.lml2mM尿酸溶液，0.3ml30mM4-AAP，0.15ml体积百分数1.5%苯酚，0.15ml20U/ml辣根过氧化物酶，25°C，反应20min，测定505nm的吸光值；实验设三次重复，求平均值。分别测定反应体系含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mmol/l的过氧化氢水溶液的反应液在505nm的吸光值。制作505nm的吸光值相对于过氧化氢浓度的标准曲线。发酵液中尿酸氧化酶活性测定在3ml酶反应体系中，含有2mmol/l的尿酸溶液2.2ml，30ramol/l的4-AAP溶液O.3ml，体积百分数l.5%苯酚溶液0.15ml，20U/ml的辣根过氧化物酶水溶液O.15ml，待测样品液0.2ml;反应液快速混匀，25°C，反应20分钟，测定505nm的吸光值(A)，实验设三次重复，每个重复测定O.2ml发酵液；发酵液中尿酸氧化酶活性按如下函数关系式计算酶活(U/ml)=0.369XA—0.0054。一个酶活力单位定义为在上述反应条件下每分钟产生l^imol过氧化氢所需要的酶量。不同转化子发酵液中尿酸氧化酶测定结果见表l。_表l不同转化子发酵液中尿酸氧化酶活性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表1是转化子在YPM培养基中诱导培养60小时的测定结果，T100-l和T100-2分别表示抗100iig/mlZeocin的两个重组转化子，T200-l和T200-2分别表示抗200ug/ralZeocin的两个重组转化子，T500-1和T500-2分别表示抗500ug/mlZeocin的两个重组转化子，T1000-l和T1000-2分别表示抗1000ug/mlZeocin的两个重组转化子。测定结果表明，空载体转化子的发酵液和细胞中都没有检测到尿酸氧化酶活性；重组转化子的发酵液均有尿酸氧化酶活性，经过60小时诱导培养后，发酵液中的尿酸氧化酶活性大小为O.15-0.6U/ml发酵液(表l)。在重组转化子中产尿酸氧化酶活性最高的是抗200ug/mlZeocin的重组转化子，经过60小时诱导培养后，发酵液中尿酸氧化酶活性为O.6U/ml发酵液，该重组转化子被命名为重组多型汉逊酵母(#朋"/2￡/"/o77//ar;A3)HPMU6，已于2008年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.2351。四、重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351遗传稳定性检测将重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351接于5mlYEPD培养基中，37。C培养，每24小时转接于新鲜YEPD培养基中，连续传代培养240小时后，将菌液适当稀释，涂于YEPD平板上，37。C培养至长出单菌落，PCR检测单菌落，结果所有检测的单菌落中都有尿酸氧化酶基因存在，没有出现目标基因丢失现象，因此重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351是遗传稳定的。实施例2、重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351产尿酸氧化酶条件的优化在摇瓶中，采用单因子发酵实验和多因子正交实验进行重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351产尿酸氧化酶条件的优化。确定最优条件为以YPG(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甘油)为培养基，培养基pH为7.0;细胞湿重为6克湿细胞/升时加入甲醇(终浓度为lml/100ml)诱导产尿酸氧化酶，每12小时补加一次甲醇至终浓度为lml/100ml;37°C、200rpm诱导培养72小时。在此最优条件下，实验重复3次，每次接种3个摇瓶，每个摇瓶(200ml)中装有20ml培养基，发酵培养72小时，测定尿酸氧化酶活性。实验设三次重复，每个重复测定2ml发酵液。标准曲线的制备方法，以及尿酸氧化酶活性的测定方法和计算公式同实施例l，测定结果见表2。表2优化条件下重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351产尿酸氧化酶分析重复次数发酵液稀释倍数平行样品的A值及(平均值)酶活(U/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2是在优化条件下，诱导培养72小时，测定的发酵液中尿酸氧化酶活性。结果表明尿酸氧化酶产量达最高，为2.6U/ml发酵液(图8)。图8中，(參)表示重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351的生物量，(△)表示重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351尿酸氧化酶的产量。对上述发酵液上清进行SDS-PAGE分析，发现从48小时开始可以检测到尿酸氧化酶的蛋白带，72小时蛋白带浓度明显提高。SDS-PAGE分析扫描结果表明，最优条件下，重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351在摇瓶中诱导培养72小时，尿酸氧化酶的产量为63mg/L发酵液。上述实验结果为三次重复实验的平均值。实施例3、产尿酸氧化酶的重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351的高密度发酵重组多型汉逊酵母HPMU6CGMCC2351在YPG(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甘油)培养基中，37°。培养18小时，按10。/。接种量转接于400mlYPG中，37t:摇床培养至0D6。。为10-12，该菌液即为种子液。种子液接于装有甘油浓度为4%(v/v)的2LYPG的发酵罐中，37。C培养，pH控制在6.5，溶氧为20%。在甘油将被消耗完时(培养24小时后)，以20ml/l/h的速度流加甘油3小时，使细胞干重达50g/L发酵液。然后流加甲醇使发酵液中甲醇浓度保持在0.5%左右，每隔12小时取样，测定细胞生物量(细胞干重)和尿酸氧化酶活性。实验设三次重复，每次同一种子液接种2个发酵罐，尿酸氧化酶活性测定每次每个重复测2ml发酵液。标准曲线制备方法，以及尿酸氧化酶活性的测定方法和计算公式同实施例l。结果表明在甲醇诱导培养69小时后，即总发酵时间为96小时，发酵液中尿酸氧化酶活性达最高，为52.3U/ml发酵液(图9)。图9中，(■)表示重组多型汉逊酵母HPMU6的生物量，(△)表示重组多型汉逊酵母HPMU6尿酸氧化酶的产量。SDS-PAGE分析及凝胶扫描结果表明，重组蛋白浓度为2.lg/L发酵液(图10)。与摇瓶实验相比，尿酸氧化酶活性提高了22.7倍，重组蛋白产量提高了33.3倍。上述实验结果为三次重复实验的平均值。图10中，M:蛋白分子量标准(97.4、66.2、43、31、20.1KDa);泳道1-5:重组多型汉逊酵母发酵24、48、72、84、96小时的培养液上清液；泳道6:空载体转化子培养液上清液。权利要求1.一种重组表达载体，是含有如下表达盒的重组酵母表达载体；所述表达盒从上游至下游依次包括甲醇氧化酶基因的启动子、尿酸氧化酶基因和转录终止子。2、根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于所述尿酸氧化酶基因为编码如下蛋白(a)或(b)的基因；(a)由GenBankAcessionNo.BAA06804的自氨基末端第l一303位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且具有尿酸氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。3、根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于所述表达盒还包括酿酒酵母a因子信号肽的编码序列，所述酿酒酵母a因子信号肽的编码序列位于所述甲醇氧化酶基因的启动子和所述尿酸氧化酶基因之间，且与所述尿酸氧化酶基因形成融合基因。4、根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于所述甲醇氧化酶基因启动子为如下a)或b)的DNA分子a)GenBankAcessionNo.A11156的核苷酸序列自5'端1-1510位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；b)严格条件下与a)限定的DNA序列杂交的DNA分子。5、根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于所述酵母表达载体为pGAPZ-alpha-A。6、一种重组多型汉逊酵母菌，是将权利要求1-5所述的任一重组表达载体导入多型汉逊酵母菌中得到的重组菌。7、根据权利要求6所述的重组多型汉逊酵母菌，其特征在于所述多型汉逊酵母出发菌株为多型汉逊酵母CGMCC2.2498。8、根据权利要求6或7所述的重组多型汉逊酵母菌，其特征在于所述重组多型汉逊酵母菌为重组多型汉逊酵母菌HPMU6CGMCCNo.2351。9、权利要求6或7或8所述重组多型汉逊酵母菌在生产尿酸氧化酶中的应用。10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于用于生产所述尿酸氧化酶的所述重组多型汉逊酵母菌的培养基为含lml/100m1-4ml/100ml甘油的YPG培养基，优选为含4ml/100ml甘油的YPG培养基；在生产过程中，用0.5ml/100ml甲醇诱导所述尿酸氧化酶的表达。全文摘要本发明公开了一种重组多型汉逊酵母菌及其专用重组表达载体与应用。本发明公开的重组多型汉逊酵母菌，是将产朊假丝酵母的尿酸氧化酶基因导入多型汉逊酵母CGMCC2.2498中，得到能分泌表达尿酸氧化酶的重组菌；所述尿酸氧化酶的编码基因插入到载体pMOXZ-alpha-A中的MOX启动子和AOX1终止子之间获得重组表达载体，然后通过转化，使尿酸氧化酶表达盒整合到多型汉逊酵母染色体上。本发明的重组多型汉逊酵母菌通过高密度发酵，可以高水平生产尿酸氧化酶，其尿酸氧化酶产量是目前已报道产量的8.6倍。利用本研究构建的重组多型汉逊酵母菌生产的尿酸氧化酶，产量高、免疫原性低，非常有利于尿酸氧化酶在医药领域的广泛应用。文档编号C12N15/53GK101255440SQ20081010180公开日2008年9月3日申请日期2008年3月12日优先权日2008年3月12日发明者何秀萍,张博润,王肇悦,郭雪娜,陈志禹申请人:中国科学院微生物研究所