一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本专利属于生物工程技术领域，具体涉及一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌 及其应用。
【背景技术】
[0002] 产酯酵母又称生香酵母，不是酵母分类学上的名词，是指可生成较多量酯类物质 的酵母的通称，分属于汉逊酵母属、产肮酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属和酒香酵母属等。 酯属于一种有机化合物，低级酯是一类具有香气的挥发性液体。产酯酵母大多是一些野生 酵母，它们在自然界中分布较广，在酿造工业的原料、制造工序以及制成品中都有不同程度 的体现，在我国酿造行业中占有举足轻重的地位，被广泛用于白酒、黄酒、葡萄酒、酱油、豆 瓣、甜面酱、食醋等传统发酵食品，是产香的主要菌种之一。
[0003] 从20世纪60年代开始，产酯酵母便已用于白酒生产，弥补了白酒香气不足和后味 较淡的缺点。产酯酵母不但适于液体培养，也适于半固态和固态培养。据报道，当前大多产 酯酵母在温度为25~30°C，尤其是28°C时总酯生成量最高。专利号CN102199556A中公 开一种高产酯酿酒酵母基因工程及其构建方法，专利号CN102586125A中公开的一株高产 酯的东方伊萨酵母菌、其组合物及应用，专利号CN103184167A中公开的一株异常威克汉姆 酵母及其应用，这些专利中涉及的菌株均为高产乙醇、乙酸乙酯的菌株，但产酯温度都偏高 (25~28°C间），此外以上报道菌株的代谢产物种类多，在实际应用中，不利于突出产品的 特有风味。对于低温条件下产酯高、且代谢产物单一的酵母，尚未见报道。而在发酵食品生 产过程中，生产企业为了增加产品的风味物质含量，大多都采用提高发酵温度以创造有利 于在较高温度下才能合成酯类物质的微生物的生长环境，可见，产酯酵母发酵温度高，带来 的后果是增加工艺难度，能耗增加，生产成本高。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述发酵食品生产过程中发酵温度高带来的工艺难度大、能耗增加、生 产成本高、代谢产物种类多等问题，本发明提供一种耐酸、耐盐、耐乙醇、在低温条件下即能 高产乙酸乙酯的酵母菌，本发明目的通过下述技术方案来实现：
[0005] -株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述菌株为异常威克汉姆 酵母（Wickerhamomycesanomalus)，已于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0. 10370。
[0006] 作为本发明的一种优选，所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22 °C，耐酸性为 ρΗ2· 5~7. 0,耐盐性为0~15% (NaCl% )，耐乙醇性为0~10% (v% )。
[0007] 作为本发明的一种优选，所述菌株的筛选方式为：将曲药、酿造醅或酿造原料用研 钵研磨后称取l〇g至lOOmL无菌生理盐水，摇床150r/min震荡30min，稀释涂布于初筛培养 基，挑选透明圈直径和菌落直径之比较大菌落即产酯显著菌株，再将菌株转接，进行摇瓶发 酵复筛，测定发酵液酯含量，筛选获得产酯能力强的菌株。
[0008] 作为本发明的一种优选，所述产酯初筛培养条件为：初筛培养基：蛋白胨20%、葡 萄糖2%、酵母膏1 %，琼脂2%、三丁酸甘油酯0. 4%，用去离子水配制，自然pH，28~30°C 培养1~3天，根据透明圈直径和菌落直径之比判断产酯性能。
[0009] 作为本发明的一种优选，所述摇瓶发酵培养条件为：将大米或麦芽糖化液与麸皮 浸提液按照体积比为5-9:3的比例进行配置，调节PH至5. 0,在25-35Γ，150rpm条件下摇 瓶培养24-120h。
[0010] 作为本发明的一种优选，所述大米或麦芽糖化液的制备为：50g大米或麦芽样品 经粉碎后，加2-6倍体积的水，蒸煮0. 5-2h，呈糊状，冷却后以每克原料4~8U的量加入糖 化酶α-淀粉酶，于60°C水浴0. 5-2h，液化完成后用lmol/L的盐酸调节pH至4. 0,然后以 每克原料40~100U的量加入糖化酶，60°C水浴，糖化完全，过滤、离心，收集上清液即为大 米汁或麦芽汁。
[0011] 作为本发明的一种优选，所述麸皮浸提液的制备为：称取400g麸皮并加入1-5倍 水，90 °C水浴1 _2h，冷却过滤，滤液即为麸皮浸提液。
[0012] 本发明还公开了所述菌株在传统发酵行业和食品工业中的应用。
[0013] 作为本发明的一种优选，所述菌株在食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制 酒等行业中的应用。
[0014] 本发明的有益效果：本发明所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22°C，耐酸性为 pH2. 5~7. 0 ;耐盐性为0~15%(NaCl% );耐乙醇性为0~10% (v% )，在低温条件下即 能使产酯量达到最大，且发酵产生的代谢产物仅有乙酸乙酯和少量乙醇，不含杂醇油。本发 明菌株可作为重要功能菌应用于食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒等传统发 酵行业及食品工业中，降低传统生产的发酵温度，优化生产工艺，降低生产能耗及成本，同 时增加产品乙酸乙酯含量，改善产品风味，提高产品品质，具有可观的经济效益。
【附图说明】
[0015] 图1为酵母菌Njsys-HDl的26SrDNADl/D2区序列系统发育树；
[0016] 图2为酵母菌Njsys-HDl代谢产物图；
[0017] 图3乙酸乙酯质谱图。
【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0019] 实施例1产酯酵母菌的筛选
[0020] 将曲药、发酵醅用研钵研磨后分别称取10g至100ml无菌生理盐水，摇床150r/ min震荡30min即为菌悬液，进行十倍系列稀释，将稀释液涂布于初筛培养基，挑选透明圈 直径和菌落直径之比较大菌落即产酯显著菌株。再将菌株转接，进行摇瓶发酵复筛，采用 HS-SPME-GC-MS方法测定发酵液酯种类，利用GB/T10345- 2007规定的白酒总酯的测定方 法测定发酵液乙酸乙酯含量，筛选获得产乙酸乙酯能力强的菌株。
[0021] 产酯初筛培养条件为：初筛培养基：蛋白胨20% (质量百分比，下同）、葡萄糖 2%、酵母膏1%，琼脂2%、三丁酸甘油酯0. 4%，用去离子水配制，自然pH，28°C培养2天， 根据透明圈直径和菌落直径之比判断产酯性能。
[0022] 摇瓶发酵培养的具体过程如下：
[0023] ①、大米汁发酵培养基的制作：50g大米经粉碎后，加入4. 5倍体积的水，蒸煮lh， 呈糊状，冷却后以每克原料6U的量加入α-淀粉酶，于60°C水浴lh，液化完成后用lmol/L 的盐酸调节pH至4. 0,然后以每克原料80U的量加入糖化酶60°C，60°C水浴，直至碘试不显 蓝色为止，后煮沸灭酶，糖化完全，过滤、离心，收集上清液即大米汁备用。
[0024] ②、麸皮浸提液的制备：称取400g麸皮并加入5倍水，90°C水浴lh，冷却过滤，收 集滤液备用，滤液即为麸皮浸提液。
[0025] ③、摇瓶发酵培养：将麸皮浸提液添加到大米汁发酵培养基中，大米汁与麸皮浸提 液的体积比为7:3,调节PH至5. 0,在28°C，150rpm的条件下，摇瓶培养24h。
[0026] 发酵液酯种类的测定：采用HS-SPME-GC-MS方法测定，15mL顶空瓶中加入5~ 10mL澄清发酵液及1~5gNaCl，进行顶空固相微萃取。顶空固相微萃取的条件为：三相 (Car/DVB/PDMS)萃取头，60°C预热 5 ~lOmin，萃取吸附 30 ~50min，GC解吸 3 ~lOmin。 发酵液酯种类的测定结果如图2,图3所示。
[0027] 实施例2产乙酸乙酯酵母菌及其分子生物学鉴定
[0028] 对获得的产乙酸乙酯酵母菌进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物分 别扩增菌株的26SrDNA片段，经凝胶电泳检测。随后进行测序比对，确定所筛得酵母的种 属。将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，酵母种属及保藏编号 为：异常威克汉姆酵母（Wickerhamomycesanomalus)CGMCCNO:10370。
[0029] 酵母菌的种属确认过程如下：
[0030] 分离菌株的26SrDNA序列同源性鉴定：酵母菌DNA的提取：将酵母菌活化后接种 在液体YTO培养基中，28°C摇床培养12h后，取少量菌体到灭菌的1. 5mLEP管中，加入500ul CBTA缓冲液和50ul蜗牛酶（100mg/ul)，37°C，225r/min，震荡2h后，加入lOOulSDS，接着在 65°C水浴15min和-80°C冰浴20min，反复冻融3次之后，加等体积氯仿酚异戊醇（25:24:1， v/v/v)震荡lmin，静置10min，12000g离心10min，取上清液到新的无菌EP管中，取上清 液450ul到新的EP中，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，常温静置lh后，20°C，13000g离心 20min，完成后，弃上清液，加入lml70%乙醇，静置10min后4°C，13000g离心15min，弃乙 醇溶液（重复洗涤2次），吹干至无醇味，加入50ul无菌双蒸水，65°C水浴lh，最后琼脂糖 电泳检测DNA有无。
[0031] 26SrDNA基因的扩增：对所提的总DNA进行26SrDNA的PCR扩增，扩增反应的引 物为一对通用引物，正向引物为NL-1 (5' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'），反向引物为NL -4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。
[0032] ?0?反应体系（50此）为：无菌超纯水33.5111，10\?0?81^€615111，（1犯134111， Mg2+3ul，两个引物各lul(10uM/ul)，Taq酶 0· 5ul，模板lul。
[0033]PCR反应条件：94°C预变性 5min，94°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸 90s，共 35个循环，最后72°C延伸10min，最后通过140V电泳20min检测结果。并寄往上海杰李生 物技术公司测序。
[0034] 数据分析：将扩增序列与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行比 对，找出与克隆子序列同源性最高的序列，用于构建系统发育树和确定其分类地位。DNA MAN软件对齐序列，Mega6.0软件的邻位法（Neighbor-joining)构建系统发育树，系统 发育树采用Neighbor-Joining(邻位相接）算法、Boottrap1000次计算，结果如图1所 不。Njsys-HDl菌株与Wickerhamomyces·