专利名称：一株利用木糖发酵产乙醇的代谢工程酵母菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一株高效利用木糖发酵产乙
醇的酿酒酵母(&cc/w/w^c^cwev/w'"e)工程菌菌株E33及其应用。
背景技术：
随着石油资源的日渐枯竭，乙醇作为清洁燃料已替代部分汽油，需 求逐年增长。目前生产乙醇的原料主要是来自粮食的淀粉，原料成本占 整个生产成本的一半以上，成为燃料乙醇大规模推广的一个瓶颈。生物 质是地球上最丰富的可再生资源。利用生物质生产燃料乙醇是国际上竞 相开发的热点。生物质中碳水化合物彻底降解成单糖后有近三分之一是 木糖，高效转化木糖生产乙醇不仅环保而且有利于降低成本。酿酒酵母 广泛应用于大规模乙醇发酵工业，但其不能利用木糖，因此许多科学家 企图构建能发酵木糖的酿酒酵母工程菌。通常的构建方法是将外源木糖 还原酶、木糖醇脱氢酶(来自毕赤酵母(尸&/^幼>跑))基因在酿酒酵母 中异源表达，同时过量表达内源木酮糖激酶(来自酿酒酵母)。这样的 重组酿酒酵母能够低效率地发酵木糖产乙醇(Kuyper等，FEMS Yeast Research, 4:655-664， 2004)，同时分泌大量的副产物木糖醇。由于木 糖发酵过程中重组酿酒酵母细胞中毕赤酵母来源的木糖还原酶优先利用 还原型辅酶II而木糖醇脱氢酶只能特异性利用氧化型辅酶I，导致了还原 型辅酶II枯竭和还原型辅酶I的积累。氧化还原辅酶的不平衡造成了木 糖利用率低和木糖醇的积累，目前国内外构建的工程菌在发酵木糖产乙 醇时，木糖对乙醇的转化率较低(Gnansounou等，Bioresource Technology, 96:985-1002,2005),这问题已成为生物质发酵产乙醇的技术关键
发明内容
本发明的目的是提供能够高效利用木糖发酵产乙醇的工程菌，及其 利用生物质发酵产乙醇的应用。
在本发明的一个方面，提供了一株新的利用木糖发酵产乙醇的酿酒
酵母(&cc/zaram;;c&y cwev/w'ae) E33工程菌菌株，所述菌株于2006年6 月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北 京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCCNo.1746。
在本发明的又一个方面，提供所述酿酒酵母E33工程菌菌株利用木 糖发酵产乙醇的应用。
与现有技术比较，该工程酵母菌的特点是不仅具有来自假丝酵母的 辅酶II特异性木糖还原酶活性，而且还有可溶性转氢酶活性。在木糖发 酵过程中能自动再生辅酶保持辅酶平衡，因此能高效利用木糖发酵产乙 醇，木糖对乙醇的转化率达到88 %，为利用生物质生产燃料乙醇奠定了
:S石出。
图l是酵母载体pY2(a)和pGH3(b)的物理性图谱。
图l(a) 醇脱氢酶(ADH1)启动子；"ZW/: ADH1终止子；
甘油3磷酸脱氢酶启动子；^TC7:细胞色素c等位l终止子；^D/7: 来自毕赤酵母的木糖醇脱氢酶的基因；URA3(尿嘧啶)和LEU2(亮氨酸) 酵母选择标记；
图l(b)」Z)/i7; :醇脱氢酶(ADH1)启动子；^D/fh: ADH1终止子； G尸Z)7户甘油3磷酸脱氢酶启动子；CTC":细胞色素c等位1终止子; CmZ)T7 :来自麦芽糖假丝酵母(。^^fl w"/加a)的编码木糖还原酶的基 因；^KS7:来自酿酒酵母的编码木酮糖激酶的基因；w^^:来自大肠杆菌 (五.co/0的编码转氢酶的基因；LEU2:酵母选择标记
本发明所构建的酿酒酵母0S"cc/2araw;;cM ce"WWae)工程菌菌株E33 己于2006年6月28日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(CGMCC)保藏，保藏中心地址为北京市海淀区中关村北一条13号。 保藏号为CGMCCNo. 1746。以下是几个实施例，参考下列实施例可以更好地理解本发明。这些实施例意味着本发明具体实施方案的体现，但不限制本发明的范围。
实施例
实施例中所用的载体除另有说明之外，均购自Invitrogene公司。实施例一 酿酒酵母"flcc/zarawyc^ce Ww'ae) E33工程菌的构建酿酒酵母W303-1B a(Pearce, A.K.等Micobiology 147, 391-401.， 2001)
作为构建工程菌的出发菌株。在构建过程中所用到的菌株还包括毕赤酵母CBS 6054(Wahlbom， C. F.等FEMS Yeast Res 3， 319-26., 2003),麦芽糖假丝酵母(Cam^/a ma/ 仍a) XU316 (C. Guo,等M/craZ>,101， 139—150， 2006)和大肠杆菌(E. co")JM 109 (Invitrogene)。根据标准方法(Ausubel, F.M,等Current protocols in molecular biology. Wiley,Toronto, 1987)分别提取酵母毕赤酵母CBS 6054 ，酿酒酵母W303-1B a、麦芽糖假丝酵母XU316和大肠杆菌E Co//JM109基因组DNA。以毕赤酵母CBS 6054基因组DNA为模板,利用引物Pxdhs (5 ' -GCAGGATCCATGACTGCTAACCCTTCCTTG-3 ')禾口Pxdha (5 ' -GCACTCGAGTTACTCAGGG CCGTCAATGAG-3 ')PCR扩增，PCR混合液
(1) 模板DNA
(2) 引物Pxdhs
(3) 引物Pxdha
1 pi (10ng)1 pi (10mM)1 ial(lOmM)(4) dNTPs: 1 |il(10mM)
(5 ) Taq DNA聚合酶0.5 |il(5U/Vl)
(6) IOX缓冲液 5 Ml
(7) 重蒸水 40.5^
PCR条件94。C变性5min后开始以下循环，94。C变性反应30 sec;55"C退火反应30 sec; 72。C延伸反应1 min;进行30个循环；最后72°C反应5min; 4 "C冷却恒定。得到其木糖醇脱氢酶基因(i^Y7ZJ)。将木糖醇脱氢酶基因(AXKL2)克隆到表达载体pRULU9(van den Berg, M.A.和Steensma， H.Y. 1997. Yeast 13, 551-559.)上从而使其获得酿酒酵母组成型表达启动子G尸Z)/和C7C/终止子。将该表达盒启动子Z^lYIX2的ORF和CTC7终止子进一步克隆到多拷贝整合质粒pSAK068中，得到质粒pY2。该质粒以ura3(尿嘧啶)为选择性标记。以麦芽糖假丝酵母XU316基因组DNA为模板，利用引物
Pxrs (5 ' -GCAGGATCCATGACTACTTCTTCTACTATT-3 ')禾口Pxra (5 ' -GCACTCGAGTTAAACGAAAATTGGAATGTTGTC-3 ')PCR扩增，得到其木糖还原酶基因(CmZ7丄7)。以酿酒酵母W303-1B a基因组DNA为模板，利用引物Pxks (5 ' -GCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGACAG-3 ')禾卩Pxka (5 '陽CGGTCGACGCTACAGTATACGAAACATACAAGG-3 ' ) PCR得到扩增其木酮糖激酶基因0Sc^KS7)。同样分别将外源的木糖还原酶基因(CmXIX/)以及内源的木酮糖激酶基因(&;o:57)克隆到表达载体pRUL129上，使其获得真核表达所需要的启动子G/ID7和CTC7终止子。通过DNA重组技术构建两个基因串联表达的共表达盒(启动子G尸D/， CmZ7Z/和终止子C7C7，启动子GPD/，Sc^XS7和终止子CTC/)。新型的型表达载体pGH，来自克隆载体pbluescript SK (Invitrogene)禾口表达载体pAD-GAL4-4.1(Invitrogene)并以leu2为选择性标记。以五.Co// JM109基因组DNA为模板,利用引物Pths (5'-AGGGATTCCATGCCACATTCCTACGATTAC-3 ')禾口 Ptha (5 '-CCCTCGAGTTAAAACAGGCGGTTTAAACC-3 ' ) PCR扩增得到其可溶性的转氢酶基因(z^/^)。转氢酶基因(^Z/l4)被克隆在型表达载体pGH上。同时插入上述木糖还原酶基因(CmXr")木酮糖激酶基因"c^KS/)共表达盒，形成质粒pGH3。用LiAc酵母转化方法(Gietz，R.D.,等，Yeast，11: 355-360， 1995)，将质粒pY2转化受体菌S. W303-1B a。
在尿嘧啶缺陷的SC选择性培养基(0.67%,酵母氮碱;2%,葡萄糖；1.5%,琼脂，适量的腺嘌呤和必需氨基酸(亮氨酸，组氨酸，色氨酸))上筛选得到携带木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母菌株E3。以重组酿酒酵母菌株E3为受体菌，转化(LiAc酵母转化方法(Gietz， R.D.,等，Yeast， 11: 355-360，1995))质粒pGH3，在尿嘧啶和亮氨酸缺陷的SC选择性培养基(0.67%,酵母氮碱;2%，葡萄糖；1.5%,琼脂，适量的腺嘌呤和必需氨基酸(组氨酸，色氨酸))上筛选得到酿酒酵母E33工程菌菌株。
实施例二，酿酒酵母E33工程菌的木糖还原酶和转氢酶活性重组工程菌E33和出发菌株W303-1B a分别接种于5 ml的SC培养基(0.67%,酵母氮碱;2%,葡萄糖；适量的必需氨基酸(组氨酸，色氨酸))中，培养(3(TC， 250rpm摇床培养)过夜。出发菌株W303-1B a做为对照。离心(5000 rpm， 3分钟)收集菌体。利用玻璃珠法(《酵母遗传学方法实验指南》，87-88)裂解细胞，高速离心(13000 rpm， 40分钟)收集蛋白上清。根据Bruinenberg所描述的测定方法(Bruinenberg， P.M.,等，J. Gen.Microbiol., 129: 953-964， 1983)测定细胞抽提物中的木糖还原酶和转氢酶比活力。在出发菌株W303-1B a中只检测到微弱的辅酶II相关的木糖还原酶活性，没有检测到转氢酶活性。酿酒酵母E33由于引入了假丝酵母的木糖还原酶基因(OwZ7丄7)和细菌的转氢酶基因(i^/zvO具有了明显的木糖还原酶活性(0.251 Umg"，特异性以辅酶II为辅酶，检测不到辅酶I相关的酶活性)和转氢酶活性(6.288 Umg")。木糖还原酶活性单位定义为每分钟催化还原1 mmol木糖时所需要的酶量；转氢酶活性单位定义为每分钟催化还原1 nmoltNAD的酶量。
实施例三，酿酒酵母E33工程菌菌株发酵木糖产乙醇重组工程菌菌株E33接种于装在250 ml摇瓶中的100 ml YPD培养基(酵母抽提物10gl-';胰蛋白胨20gl";葡萄糖20g l")中。30°C ， 250 rpm摇床培养24小时。离心收集菌体(5000rpm， 5分钟)，用等体积的0.9%生理盐水洗涤细胞两次。细胞重悬于装在250ml摇瓶中的100mlYPX培养基中(酵母抽提物10gl";胰蛋白胨20gl";木糖30gl-1)，于3(TC、100rpm摇床培养。84小时后取样测得消耗木糖的浓度为22.2gr1，乙醇的浓度为9.0gr1，木糖对乙醇的产率为0.405 gg-1，转化率为88%。
权利要求
1、一株发酵木糖产乙醇的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌菌株E33，其保藏号为CGMCC1746。
2、 权利要求1的酿酒酵母工程菌菌株E33在发酵木糖产乙醇中的应用。
全文摘要
发酵木糖产乙醇是利用生物质生产乙醇的关键技术之一。用代谢工程的方法构建了一株酿酒酵母工程菌。该菌株不仅能发酵木糖产乙醇，而且能自动平衡氧化还原辅因子，是一株副产物少、能高效利用木糖发酵产乙醇的代谢工程酵母菌。该菌株发酵木糖产乙醇的转化率达到88％，为利用生物质生产燃料乙醇奠定了基础。
文档编号C12N1/16GK101463328SQ20071017986
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者卢大军, 宁 江, 安 沈, 鹏 贺, 郭长缨 申请人:中国科学院微生物研究所