sp在进化树一个分枝上，与Wickerhamomyces anomalus种的菌株在一个类群内而与其他种处于不同的分枝。因此该菌株为异常威克汉姆 酵母。
[0035] 实施例3酵母菌株的耐酸性能试验
[0036] 调节YH)液体培养基pH至1. 0-7. 0,以pH0. 5梯度递增，每个梯度做三个平行，接 种10% (V/V)酵母菌悬液，在30°C，150r/min，培养24h后，用酶标仪在600nm波长条件下 测定培养基的浊度，确定菌体生长情况。菌株耐酸性结果如下表1所示。
[0037] 表1菌株耐酸性能（0D6。。值）
[0038]
[0039] 表1表明菌株在pH2. 5时0D6。。达到1. 085,说明在pH2. 5的环境下菌株能正常生 长，
[0040] 且随着pH的增大，菌株在酸性环境下仍能很好的生长。但当pH为2. 0时，0D6。。值 为0. 002,菌株生长受到限制。从本实施例得出本发明酵母菌菌株的耐酸性为pH2. 5~7. 0。 [0041 ] 实施例4酵母菌株的耐盐性能试验
[0042] 调节￥?0液体培养基恥(：1浓度为2%、4%、9%、12%、15%、18%(111/￥)，每个梯度 做三个平行，接种10% (V/V)酵母菌悬液，在30°C下，150r/min，培养24h后，用酶标仪在 600nm波长条件下测定培养基的浊度，确定菌体生长情况。以未添加NaCl的YH)液体培养 基为空白，菌株耐盐性能如下表2所示。
[0043] 表2菌株耐盐性能（0D6。。值）
[0044]
[0045] 表2 ^明，在盐度为0%~菌"能正嘁生长i当盐S大于15%后0D6。。减小 到0.008,说明当盐度大于15%，菌株不能很好的生长。本实施例得出本发明酵母菌耐盐范 围为 0%~15% (NaCl% )。
[0046] 实施例5酵母菌株的耐乙醇性能试验
[0047] 调节YH)液体培养基乙醇浓度为0%，2%，4%，6%，8%，10%，12% (V/V)，并接种 10% (V/V)酵母菌悬液，每个梯度做三个平行，并做一个空白，加入等体积的无菌水代替菌 悬液，在30°C，150r/min，培养24h后，用酶标仪在600nm波长条件下测定培养基的浊度，确 定菌体生长情况。菌株耐乙醇性能如下表3所示。
[0048] 表3菌株耐乙醇性能（0D6。。值）
[0049]
[0050] ^表3表明，当乙醇浓度在0%~10%
时，0D_有吸光度值，菌株能正常生长。当乙 醇浓度大于10%上升为12%使，0D6。。降低为0.046,说明当乙醇浓度大于10%时，会使菌株 的生长受到限制。本实施例表面本发明菌株的耐乙醇范围为0%~10%。
[0051] 实施例6酵母菌株温度耐受性试验
[0052] 接种10% (V/V)酵母菌悬液于Yro液体培养基，分别于25°C、30°C、35°C、40°C、 45°C，150r/min条件下培养24h，用酶标仪在600nm波长条件下测定培养基的池度，确定菌 体生长情况。菌株温度耐受性如下表4所示。
[0053] 表4菌株温度耐受性试验（0D600值）
[0054]
[0055] 表4表面，当温度在25~40°C时，0D_有吸光度值，菌株能正常生长。当温度大 于40°C达到45°C时，0D_降低为0. 015,说明当温度大于40°C时，会使菌株的生长受到限 制。本实施例表面能使本发明菌株生长的最高温度为40°C。
[0056] 实施例7酵母菌株产酯条件的确定
[0057] 1.最适产酯温度的确定：
[0058] 灭菌大米培养基（50mL)中接种10% (V/V)酵母菌悬液，分别放于16°C、19°C、 22°(：、25°(：、28°(：、31°(：、34°(：静置培养4(1，将发酵液用于产酯测定。不同温度下菌株的产酯 量如下表5所示。
[0059] 表5不同温度下菌株的产酯量
[0060]
[0061] 通过在16 °C、19 °C、22 °C、25 °C、28 °C、31°C、34 °C不同温度下菌株产酯量的对比可 以看出，菌株在22°C时的产酯量达到最大，所以菌株的最佳产酯温度为22°C。
[0062] 2.最适产酯pH的确定：
[0063] 灭菌大米培养基（50mL)加入已灭菌的lmol/L的盐酸或者强氧化钠溶液调节pH， 使其pH分别为2. 5、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0,并接种10% (V/V)酵母菌悬液，于22°C置培养 4d，将发酵液用于产酯量测定。不同pH值下菌株的产酯量如下表6所示。
[0064] 表6不同pH值下菌株的产酯量
[0065]
[0066] 通过在2. 5、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0不同pH值下菌株产酯量的对比可以看出，菌株 在pH为3. 0时产酯量达到最大，所以菌株的最佳产酯pH为3. 0
[0067] 3.最适的产酯供氧量确定：
[0068] 灭菌大米培养基（50mL)中接种10% (V/V)酵母菌悬液，在22°C、pH为3. 0的条 件下，分别放于〇r/min、60r/min、120r/min、180r/min、240r/min条件下摇床培养4d，分别 测定各发酵液产酯情况。菌株在不同供氧量条件下的产酯量如下表7所示。
[0069] 表7菌株在不同供氧量下的产酯量
[0070]
[0071] 通过在 0r/min、60r/min、120r/min、180r/min、240r/min不同供氧量下菌株产酯 量的对比可以看出，菌株在供氧量为〇r/min，即静置条件下的产酯量最好。
[0072] 从上述产酯温度、PH及供氧量可以看出，当菌株在温度22°C，pH3.0,静置条件下 其产酯量能够达到最好，为最佳产酯条件。
[0073] 实施例8异常威克汉姆酵母Njsys-HDl在生产中的应用
[0074] 以生产米酒和制醋酒化阶段所用的酿酒酵母为对照：在大米汁培养基（pH3. 0)中 分别接种1 % (v/v)的酿酒酵母菌悬液和本发明异常威克汉姆酵母Njsys-HDl菌悬液，放置 于22°C的培养箱，静置培养4d，分别测定发酵的总酯含量。
[0075] 结果表明异常威克汉姆酵母Njsys-HDl的发酵液与酿酒酵母菌发酵液中的总酯 含量分别为7. 89g/L和0. 23g/L，本发明异常威克汉姆酵母Njsys-HDl的产酯量能达到常规 酿酒酵母的34. 4倍，具有优良的产酯效果。
[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述菌株为异常威克汉姆酵 母（Wickerhamomycesanomalus)，已于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO. 10370。2. 如权利要求1所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述菌株 产乙酸乙酯的最佳温度为22°C，耐酸性为pH2. 5~7. 0,耐盐性为0~15%(NaCl% )，耐乙 醇性为〇~10% (v% )。3. 如权利要求1所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述菌株 的筛选方式为：将曲药、酿造醅或酿造原料用研钵研磨后称取l〇g至l〇〇mL无菌生理盐水， 摇床150r/min震荡30min，稀释涂布于初筛培养基，挑选透明圈直径和菌落直径之比较大 菌落即产酯显著菌株，再将菌株转接，进行摇瓶发酵复筛，测定发酵液酯含量，筛选获得产 醋能力强的囷株。4. 如权利要求3所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述产酯 初筛培养条件为：初筛培养基：蛋白胨20%、葡萄糖2%、酵母膏1%，琼脂2%、三丁酸甘油 酯0. 4%，用去离子水配制，自然pH，28~30°C培养1~3天，根据透明圈直径和菌落直径 之比判断产酯性能。5.如权利要求3所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述摇瓶 发酵培养条件为：将大米或麦芽糖化液与麸皮浸提液按照体积比为5-9:3的比例进行配 置，调节PH至5. 0,在25-35°C，150rpm条件下摇瓶培养24-120h。6. 如权利要求5所述一种低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述大米 或麦芽糖化液的制备为：50g大米或麦芽样品经粉碎后，加2-6倍体积的水，蒸煮0. 5-2h，呈 糊状，冷却后以每克原料4~8U的量加入糖化酶α-淀粉酶，于60°C水浴0. 5_2h，液化完 成后用lmol/L的盐酸调节pH至4. 0,然后以每克原料40~100U的量加入糖化酶，60°C水 浴，糖化完全，过滤、离心，收集上清液即为大米汁或麦芽汁。7. 如权利要求5所述一种低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述麸皮 浸提液的制备为：称取400g麸皮并加入1-5倍水，90°C水浴l_2h，冷却过滤，滤液即为麸皮 浸提液。8. 如权利要求1所述一种低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌的应用，其特征在于，所 述菌株在传统发酵行业和食品工业中的应用。9. 如权利要求8所述一种低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌的应用，其特征在于，所 述菌株在食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒等行业中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，属于生物工程技术领域。所述菌株为异常威克汉姆酵(Wickerhamomycesanomalus)，已于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？NO.10370。本发明所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22℃，耐酸性为pH2.5～7.0；耐盐性为0～15％(NaCl％)；耐乙醇性为0～10％(v％)，发酵产生的代谢产物仅有乙酸乙酯和少量乙醇，不含杂醇油。本发明菌株可作为重要功能菌应用于食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒等传统发酵行业及食品工业中，降低传统生产的发酵温度，优化生产工艺，降低生产能耗及成本，同时增加产品乙酸乙酯含量，改善产品风味，提高产品品质，具有可观的经济效益。CGMCC NO：1037020150119
【IPC分类】C12P7/62, C12R1/645, C12N1/16
【公开号】CN105349444
【申请号】CN201510849370
【发明人】黄丹, 毛祥, 罗慧波, 叶光斌, 刘有晴, 于华, 方春玉
【申请人】四川理工学院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月27日