专利名称：尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组汉逊酵母菌及其构建方法与其在生产外源蛋白中的应用。更具 体的说本发明是尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌及其构建方法与应用。
背景技术：
利用基因工程技术获得有重要生物学活性的蛋白质是现代生物技术的重要目标。在 体外表达蛋白质，重要的是在努力提高表达量的同时，最大限度地保持产物的空间结构 和生物学活性与天然蛋白一致。为此人们建立了大肠杆菌、杆状病毒、哺乳动物细胞和 酵母四大外源基因表达体系以适应各种来源的蛋白质在体外高效表达。其中的酵母表达 系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具,拥有转录后加工修饰功能,适合于稳定表 达有功能的外源蛋白质.与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比,酵母表达系统操作简 便，成本低廉，可大规模进行发酵,是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。
在过去几十年的时间里，酿酒酵母(5"acc力aro历/ces cerew'siae)作为第一个真核基 因表达系统得到了广泛的应用。但这一表达系统在应用过程中也存在诸多不足之处，如 外源基因表达水平不高、表达蛋白的分泌水平低及多肽链糖基化过度、菌株不稳定等。 而其他的酵母菌株，尤其是甲醇营养型酵母在外源基因的表达上则显示出更大的优势 重组菌株遗传稳定性高，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10-100倍，且没有 过度糖基化的现象，因此适于大规模发酵生产目的蛋白。其中的汉逊酵母(yfe/we/7"7a)除 具有上述优点外，还具有其特有的优势(l)可利用甲醇氧化酶基因(MOX)启动子和甲醛 脱氢酶基因(FMD)启动子等强启动子高效地启动外源基因的表达；(2)非同源重组的频率 高，因而重组质粒可以高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子；(3)表达的 外源蛋白通常贮存在过氧化物酶体内，可使其免受胞内蛋白酶的降解，并且降低了对细 胞的毒害作用；(4)能用廉价的培养基进行高密度发酵，进一步提高外源基因的表达水平； (5)耐高温，最适生长温度为37"C-43'C，生长速率快，大规模发酵的培养时间短、污染
3率低。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种遗传较稳定的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌 汉逊酵母菌。本发明提供的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌，是乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的汉逊酵母菌。
本发明公开了的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌
(Hansenula) YH-11 C(iMCC NO. 2976，已于2009年3月24日:保藏于中国微生物菌种保
藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为YH-11 CGMCC NO. 2976，分类命名为
异常毕赤酵母，Pichia anomala。菌落呈凸起状，乳.白色、有光泽、边缘整齐，细胞呈
椭圆形，该菌株的最适生长温度为37。C，.pH为5.5。
本发明进一步公开了构建尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌的方法，按以下步骤进行-
1 )构建含有汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(^/湖3)的重组质粒pl8HURA; 2)构建说/^i 基因被破坏的重组质粒pHURK;
将歩骤2)的质粒pHURK用酵母菌完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得尿嘧 疲营养缺陷型菌株。
具体构建方法的详细描述如下
1)构建乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体；重组载体可 为pHURK。
.2)将步骤1)中的重组载体导入野生型汉逊酵母菌中，优选为汉逊酵母菌 (^朋W/ ^3)。筛选得到乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(说/湖《 )被破坏的汉逊酵母菌。 其中，所述筛选标记基因可为G418抗性基因、新霉素抗性基因或铜离子抗性基因。 所述G418抗性基因可为yTa/2^T。来源于pFA6a-KanMX。
用于构建所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(说^i )被筛选标记基因灭活的重组载 体的出发载体可为基因工程领域中的质粒载体v丝状噬菌体载体或酵母菌穿梭载体，优 选为pUC18、 pUC19、 pUC118、 pUC119等，尤其优选为pUC18或pUC19。
所述Jay2i/Z可来源于pFA6a-KanMX。
所述野生型汉逊酵母菌优选为汉逊酵母菌(泡"s朋"h)。所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体可为pHURK。 所述重组汉逊酵母菌为汉逊酵母菌(〃a/^e/7^a)。 本发明所述的外源蛋白是淀粉酶或植酸酶。
本发明通过基因工程手段，构建了遗传稳定的尿嘧晚营养缺陷型汉逊酵母菌珠，特 别是汉逊酵母菌(Hanse皿la) YH-11CGMCCN0.2976。本发明获得的况WA 基因功能缺 失的汉逊酵母突变株的HW A 基因内部插入了 5个碱基，造成第10个密码子之后发生移 码突变，使得细胞不能产生有活性的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶，将该H^ A 基因功能缺失 的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母突变株(^朋s朋"Zs)命名为YH-11。该菌株比目前国内外 所用的逊酵母菌所有的优点
(1)有丝分裂遗传稳定性高，回复突变率低。 (2)具有自主复制序列(HARS)，重组的频率高，重组质粒可以高拷贝整合到染 色体上，易获得高拷贝整合的转化子。
(3) 可利用甲醇氧化酶(M0X)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子等强启动子， 高效地启动外源基因的表达。
(4) 蛋白的表达通常在过氧化物酶体内进行，可使其免受细胞内蛋白酶的降解，并 降低了对细胞的毒害作用。
(5) 能利用廉价的化学合成培养基进行细胞高密度发酵，不需要添加价格昂贵的天 然组分(如酵母粉、蛋白胨)，进一步降低了生产成本并提高了外源基因的表达水平。
(6) 耐高温，最适生长温度为37-430C,生长速率快，大规模发酵的培养时间短。
(7) 发酵中以甘油或甲醇为唯一碳源和能源，能利用甘油的微生物不多，能利用甲 醇的微生物更少，发酵染菌率低。
(8) 外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍左右，且没有过度糖基化现 象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白。
图1为重组质粒pl8HURA的构建示意图2为尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌构建示意图；图3为重组质粒pMOX-Amy的物理图谱； 图4为重组质粒pMOXa-Amy的物理图谱； 图5为重组质粒pMOXa-appA的物理图谱。
具体实施例方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细 节影响对本技术方案的描述。以下结合实例对本发明做进一步的说明。其中实施例中所 用限制性内切酶均购自TaKaRa公司。 实施例1
汉逊酵母菌(^朋se"t^a)的构建
一、构建含有汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(说WA )的重组质粒pl8HURA 重组质粒pl8HURA的构建过程如下
1、 汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(说况A )的获得 根据已报道的汉逊酵母菌的〃W A 的核苷酸序列设计的引物序列如下
引物l: 5'-CCAGGATCCTCAACATTTCCCTGAATAAT-3'(序列表中的序列1)(划线部分碱 基为^MU识别位点)
引物2: 5'-CGAGAATTCTCACTAGTATTC CCGCGACT-3'(序列表中的序列2)(划线部分 碱基为&oRI识别位点)
以汉逊酵母菌(/fe/7se/7Wa) JCM3621 (ATCC34438)的总DNA为模板，在引物1和引 物2的引导下进行PCR反应扩增说/^4 ， PCR反应体系为模板DNA 0. 6叫，引物1 0. 5nmol/L，引物2 0. 5jamol/L， dNTP 200)tunol/L， 10XPCR缓冲液L， pfu DNA聚 合酶(Promega公司)1单位，用去离子水补至50)a L，混匀后加入石蜡油；用国 产PCR仪TC-96AE设置PCR反应条件为94。C 5分钟，循环1次；94°C 40秒，70°C 1 分钟，5(TC l分钟，29个循环；94°C 40秒，70°C 15分钟，50°C 1分钟，循环1次。
将PCR产物回收并纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明得到了大小约0.9kb 的DNA片段，与预期的大小一致，将其命名为况/WJ。
2、 将步骤1的PCR产物经及mHI和fcoRI酶切后，与经同样酶酶切的质粒载体pUC18
权利要求
1、尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCC NO.2976。
2、 一种构建权利要求1所述尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌的方法，按以下步骤进行:1) 构建含有汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的重组质粒pl8HURA;2) 构建HURA3基因被破坏的重组质粒pHURK;将步骤2)的质粒pHURK用酵母菌完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。
3、 权利要求1所述尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula) YH-11 CGMCC NO. 2976在生产外源蛋白中的应用。
4、 如权利要求3所述的应用，其中所述的外源蛋白是淀粉酶或植酸酶。
全文摘要
本发明公开了一种遗传较稳定的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11 CGMCC NO.2976；本发明同时提供了汉逊酵母菌的构建方法，包括1)构建含有汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的重组质粒p18HURA；2)构建HURA3基因被破坏的重组质粒pHURK；将步骤2)的质粒pHURK用酵母菌完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。本发明进一步公开了构建的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌在生产外源蛋白中的应用。
文档编号C12N15/81GK101560475SQ20091006832
公开日2009年10月21日 申请日期2009年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者昊 元 申请人:昊 元