专利名称：：包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒及高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地说涉及包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒及高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌。
背景技术：
：在多种疾病进程中，包括癌症、心脑血管疾病和炎症等，由组织因子(tissuefactor,TF)引发的外源性凝血系统的激活扮演重要角色，一些患者因此致死。组织因子途径抑制因子(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)是抑制外源凝血的一种重要蛋白因子。大量临床实验和动物实验证明，重组人组织因子途径抑制因子(humanrecombinanttissuefactorpathwayinhibitor,rhTFPI)对血栓形成、感染性休克、血管再狭窄、内毒素血症和DIC等具有明显防治作用，在临床上有广泛的应用前景。目前，重组人TFPI制备的效果很不理想，存在的主要问题是表达量较低，以哺乳动物细胞表达系统为例，表达量最高(约2-5mg/L)，但成本也最高。因此，通过分子生物技术上的改造，得到能够高表达人类组织因子途径抑制因子的重组酵母菌，将有效降低重组人组织因子途径抑制因子的生产成本。
发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒。本发明的第二个目的是提供一种高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌。本发明的技术方案概述如下包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒，用下述方法制成以序列表SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所述核苷酸序列为PCR引物，以重组质粒mTFPI-pPIC9为模板，扩增出人类组织因子途径抑制因子基因阅读框架，回收得到序列表SEQIDNo.l所述的1125bp的核苷酸序列，与pPIC9K加入T4连接酶进行连接反应，制备成包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒rhTFPI-pPIC9K。高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌，用下述方法制成将包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒rhTFPI-pPIC9K导入巴斯德毕赤酵母工程菌种GS115,获得基因组中包含序列表SEQIDNo.4所述的人类组织因子途径抑制因子基因的重组酵母菌，运用抗生素G418抗性筛选，获得高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G418。本发明应用剂量效应的原理，运用抗生素G418抗性，筛选出高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌。经过高密度发酵，使菌种表达人类组织因子途径抑制因子的量大大提高，达到每升培养基6.8mg左右。(G418即G-418sulfate,也称Geneticin，遗传霉素，分子式为C20H40N4010.2H2S04，分子量为692.71g/mole)图1为PCR扩增TFPI:片段大小为1，125bp;图2为质粒rhTFPI-pPIC9K限制性内切酶EcoRI，XhoI，BglII，HindIII酶切电泳图；图3为WesternBlot检测结果；图4为不同rhTFPI基因拷贝数酵母rhTFPI表达量对照；图5为高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌发酵罐高密度培养rhTFPI表达量。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1制备包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒1.分别设计上、下游PCR引物，以序列表SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示，由上海生工负责合成并纯化。以重组质粒mTFPI-pPIC9为模板(专利号ZL200610015651.3)，扩增出人类组织因子途径抑制因子基因阅读框架，反应体系为100PL1)TaKaRaExTaq(5U/tiL)0.5yL反应条件为2)10XExTaqBuffer(Mg2+Plus)1094°C30sec3)dNTPMixture(各2.5mM)4yL55°C30sec4)模板DNA20ng72°Clmin5)上、下游引物(lOOuM)各0.4uL上述反应30个循环6)无菌去离子水80.5PL回收得到序列表SEQIDNo.l所述的核苷酸序列，将PCR反应液上样于7.5%琼脂糖凝胶，电泳30分钟(见图1，图中M表示DNA分子量标准，100-6,000WideRangeDNAMarker(TaKaRa);1表示PCR产物)2.使用限制性内切酶BamHI和EcoRI分别双酶切上述PCR扩增片段以及载体质粒反应体系20uL1)rhTFPI/pPIC9K1wg2)TaKaRaBamHI0.5yL3)TaKaRaEcoRI0.5uL4)TaKaRa10XKBuffer2uL5)无菌去离子水7uL反应条件37°C2小时pPIC9K将反应液上样于7.5。/。琼脂糖凝胶，电泳30分钟，使用凝胶回收试剂盒(天根)，分别回收纯化上述PCR扩增和载体质粒pPIC9K酶切后片段；3.将上述纯化后的PCR扩增和载体质粒pPIC9K酶切后片段中加入T4连接酶16'C，过夜反应反应体系25yL1)TaKaRaT4DNALigase(350U/uL)lyL2)TaKaRaT4LigaseBuffer2.5tiL3)双酶切后pPIC9K0.03pM4)双酶切后rhTFPI0.3pM5)无菌去离子水加至25iiL反应条件16°C，过夜反应上述反应液直接转化感受态大肠杆菌TB1，并将100iiL转化后菌液直接涂布在LB氨苄(氨苄青霉素含量为lOOug/ml)培养琼脂平板上，37°C培养12小时。获得带有rhTFPI-pPIC9K的大肠杆菌TBI(TBI-rhTFPI-pPIC9K);4.挑取单个菌落至10mlLB氨苄(氨苄青霉素含量为100Pg/ml)培养基，250rpm37°C培养12小时，使用质粒小提试剂盒(天根)，小量提取质粒rhTFPI-pPIC9K，进行下一步检测；5.将上述质粒分别被限制性内切酶￡coRI，loI，Bg/II以及///"dIII酶切，反应体系20uL1)rhTFPI-pPIC9K1yg2)TaKaRa五coR礙o崎/II脂dIIIluL3)TaKaRa10XH/顧/MBuffer2UL4)无菌去离子水7uL反应条件37°Cl小时将反应液上样于7.5%琼脂糖凝胶，，电泳30分钟。(见图2其中，M表示DNA分子标准量XHindIIIDNAMarker(TaKaRa);1表示未酶切质粒；2表示rhTFPI-pPIC9KEcoRI酶切质粒pPIC9K;3表示BglII酶切质粒pPIC9K;4表示XhoI酶切质粒pPIC9K;5表示HindlII酶切质粒pPIC9K)，结果符合理论。重组基因限制性内切酶位点预测酶切片段大小(bp)5coRI(GAAATTC)10099勘I(CATCGAG)4759,5340rhTFPI-pPIC9K(AAGATCT)7876,2403倫dIII(A八AGCTT)4959,35%,1532,126.将质粒送上海生工进行测序，测序结果符合模板中人类组织因子途径抑制因子基因序列。实施例25高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)制备1.将质粒rhTFPI-pPIC9K使用限制性内切酶SacI酶切后纯化，使其成为线性而非环状的质粒片段，通过原生质体法，将质粒rhTFPI-pPIC9K转化毕赤酵母GS115(美国，Invitrogen)。1)准备毕赤酵母菌(GS115)准备a)取10PL冻存菌株，四区划线法涂布于RDBplate(阳性转化子为His+)。倒置放置于孵育箱(30°C)培养3Days;b)挑取单个菌落接种至5mlYPD培养基(50ml锥型离心管)中，30°C，200rpm，培养20h(OD6()()"0.3)。表达质粒准备将已构建好的rhTFPI-pPIC9K用限制性内切酶SacI酶切后纯化(通过同源重组，目的基因应插入5'A0X1,GS115表形应为His+Mut+)，培养基准备YPD培养基，RDBagar和RDmoltenagarose。2)步骤a)将菌液以l，500rpm室温离心10min，弃上清；b)用20ml无菌水重悬上述细菌；c)将菌液以l，500rpm室温离心5min，弃上清；d)用20ml新鲜SED重悬上述细菌，将菌液以l，500rpm室温离心5min，弃上清；e)用20mllM山梨醇重悬上述细菌，将菌液以l，500rpm室温离心5min，弃上清；f)用20mlSCE重悬上述细菌，并分装两管，一管用于确定Zymolyase消化细菌细胞壁的最佳时间，另一管用于制备酵母原生质体；g)取7.5iiLZymolyase置于10ml上述菌液，轻轻混匀，并置于30。C孵箱，静置60min;h)将上述菌液以750rpm室温离心10min，弃上清；i)用10ml1M山梨醇重悬上述沉淀(一定要轻柔)；j)将上述菌液以750rpm室温离心10min，弃上清；k)用lOmlCaS重悬上述沉淀(一定要轻柔)；1)将上述菌液以750rpm室温离心10min，弃上清；m)用600uLCaS重悬上述沉淀(一定要轻柔)；n)取100uL上述菌液，加入10yg已酶切的mTFPI-pPIC9K，室温静置lOmin;o)将1mlPEG/CaT溶液加入上述菌液室温静置lOmin;p)将上述菌液以750rpm室温离心10min，弃上清；q)用150ULSOS培养基重悬己转化的细菌，室温静置20min;r)在上述菌液中加入850uLlM山梨醇，并取此菌液lOOwL加入900uL1M山梨醇；s)将上述菌液与10ml熔化的RDagarose混合，并铺在RDBplate上，30°C培养5天。2.配制含有抗生素G418各级浓度(0.25mg/ml，2.Omg/ml以及4.Omg/ml)的YPD培养基，并使用上述培养基筛选能够在上述含抗生素培养基中生长的转化后酵母菌，由于剂量效应，能够在高浓度抗生素中生长的酵母菌-高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)基因组DNA中携带的人类组织因子途径抑制因子基因拷贝数应高于其它在低浓度抗生素中生长的酵母菌-GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml，GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml。保存各级酵母菌种。3.为了验证能够在高浓度抗生素中生长的酵母菌携带人类组织因子途径抑制因子基因拷贝数高于其它在低浓度抗生素中生长的酵母菌，采用实时定量PCR检测酵母基因组中人类组织因子途径抑制因子基因绝对拷贝数。1)准备a)使用酵母基因组提取试剂盒(天根)分别提取转化后的酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml，GS115-ATFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml和GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)基因组DNA。b)分别设计上、下游引物上游引物5'-GGAAGAAGATCCTGGAATATGTCGAGG-3'下游引物5'-CTTGGTTGATTGCGGAGTCAGGGAG-3扩增产物260bp2)仪器和试剂:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中l指的是GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml基因组DNA,2指的是GS115-rhTFP1-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml基因组DNA，3指的是GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml基因组DNA将反应板放入ABI7300荧光定量PCR仪中，设置好反应板文件和程序，开始运行。扩增反应条件如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通过实时定量PCR检测，高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)绝对拷贝数为110025.7(平均值)远高于GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml:1.08(平均值)GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml:325.96(平均值)。4)为了验证高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)人类组织因子途径抑制因子表达量同样高于酵母菌-GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml，GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml，在同条件下培养上述酵母菌，诱导人类组织因子途径抑制因子表达，并通过ELISA试剂盒(AssayMaxHumanTissueFacto/"尸a决ww/w/n力"w(TF尸"以及WesternBlot检测人类组织因子途径抑制因子表达量。a)SDS-PAGE电泳按《分子克隆》方法进行SDS-PAGE，积层胶5%，分离胶15%。b)湿法转膜跑好的胶在转膜液中浸泡20min;从下至上分别放入滤纸、胶、PVDF膜、滤纸，夹子夹好放入倒好转膜液的转膜槽中，250mA转膜30min。c)封闭将膜取出，放入含5%脱脂奶粉的PBST，室温封闭2h。d)—抗、二抗结合取出膜，对应一抗l:100稀释，室温结合2h;PBST洗3次，每次10min;二抗l:10000稀释，室温结合lh;分别用PBST禾口PBS各洗3次，每次lOmin。e)显影等比例混合显色基质A液和B液，均匀滴加膜上，静置lmin，用保鲜膜将膜包好，轻轻挤出多余显色基质，放入暗盒，曝光2-5min。结果表明，高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌(GS115-ATFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)人类组织因子途径抑制因子表达量明显高于酵母菌GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti國G4180.25mg/ml，GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml，(见图3其中1表示GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml;2表示GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml;3表示GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml))达到了摇瓶培养时每升培养基L0mg(见图4其中样品1为GS115-rhTFPI陽pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml;样品2为GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml;样品3为GS115-rhTFPI陽pPIC9Kanti陽G4184.0mg/ml)4.使用发酵罐(上海保兴10JS)将高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)高密度发酵1)发酵菌种准备a)将保存的菌液由冰箱中取出，取10uL置于RDBagarplate倒置30°C3daysb)挑取单个菌落置于5ralYPD培养基中30°C200rpm24hr0D6。。^1c)取上述菌液lml置于200mlBMGY培养基中30°C200rpm18hr0D6。。"42)菌体扩增阶段一参数a)温度30。Cb)pH:5c)培养时间24hr歩骤a)将发酵基础盐(FermentationBasalSaltwithantifoam204)4L倒入发酵罐中；b)用pH电极测量培养基准确的pH值，并记录；c)按照发酵罐消毒操作规则，高温，高压30min消毒；d)将培养基冷却至28°C，将搅拌开至900rpra，通气量开至1.OVVM罐压维持在0.09MPa;e)当所有数值稳定后，首先标定pH电极，修改零点值，使pH电极数值正常；f)打开碱补料，使用浓氨水(28%NH40H)将培养基的pH值调至5;g)当DO值稳定后(一般大于100%)，标定DO电极斜率至100%;.h)将搅拌下调至300rpm调节进气量至0.2VVM，调节排气阀VT1，使罐压接近0(不得大于0.02MPa);i)在接种口处放好火焰圈并点燃，并旋松接种口10S，打开接种口；j)分别倒入PTM1微量盐(PTM1TraceSalts17.5ml(已灭菌))，200ml菌液(0D6。。^4);k)旋紧接种盖，立即调高通气量开至1.0VVM罐压至0.09MPa，并将搅拌上调至600rpm;此时DO值开始下降，通过调节通气量及排气量，D0值维持在7(m左右。3)菌体扩增阶段二参数a)温度30°C;b)pH:5;c)培养时间5hr。步骤a)将已消毒的补料瓶及输液管放置于搁架上，用手动方式转动蠕动泵头，将输液管沿蠕动泵转动方向嵌入蠕动泵内，并用夹子加紧软管(保证其不移动)；b)旋下补料口上闷头，用酒精棉球对补料口内橡胶塞外表面消毒，然后将针头插入并穿透密封盖，并用补料针上的螺母锁紧；C)打开蠕动泵手动开关使输液管中充满料液，将蠕动泵开关打至自动状态；d)连通50%甘油补料，将流加量设定为7075ml/hr;e)此时，D0值从100%逐渐下降，调节通气量至lOL/min罐压至0.09MPa，补料时间为5hr。4)蛋白表达阶段参数a)温度25°C;b)pH:5;c)培养时间72hr。步骤a)将培养基冷却至25'C;b)将装有10%酸水解酪素补料瓶及输液管放置于搁架上，用手动方式转动蠕动泵头，将输液管沿蠕动泵转动方向嵌入蠕动泵内，并用夹子加紧软管(保证其不移动)；c)旋下补料口上闷头，用酒精棉球对补料口内橡胶塞外表面消毒，然后将针头插入并穿透密封盖，并用补料针上的螺母锁紧；d)打开蠕动泵手动，直至800ml10%酸水解酪素全部补完，关闭蠕动泵；e)连通Methanol(100%Methnol—with12mlPTM1TraceSalts/liter);f)分别设定流加量为i)第1至5个小时14.4ml/hr(Total72ml);ii)第6至8个小时.29.2ml/hr(Total87.6ml);iii)第9至72个小时43.6ml/hr(Total2.8L);注意，此时没有连通的补料瓶一定要用旋夹夹紧，保证没有空气倒流(壁厚1.6mm的硅胶管能耐受的压力为0.IMPa)11g)此时，DO值从100%逐渐下降，调节通气量至l.OVVM罐压至0.09MPa，补料时间为7280hr。发酵过程中使用Sigmaantifo柳204作为消泡剂，使用浓度为0.1%，使用1%酸水解酪素是为了降低酵母细胞分泌的蛋白水解酶对rhTFPI的降解通过ELISA检测rhTFPI表达量rhTFPI蛋白最高表达量出现于65小时，表达量为每升培养基6.8mg(见图5)序列表SEQIDNo.l1.序列特征1)长度1125bp2)类型核酸3)链性双链4)拓扑结构线性2.分子类型DNA3.序列描述SEQIDNo.l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>1.序列特征1)长度28bp2)类型核酸3)链性单链4)拓扑结构线性2.分子类型DNA3.带有限制性内切酶BamHl位点4.序列描述SEQIDNo.25'gaaggatccaaacgatgagatttcctag3'SEQIDNo.31.序列特征1)长度24bp2)类型核酸3)链性单链4)拓扑结构线性2.分子类型DNA3.序列描述SEQIDNo.34.带有限制性内切酶EcoRI位点5'cgccctagggaattcacatatttt3SE(3IDNo.41.序列特征1)长度831bp2)类型核酸3)链性双链4)拓扑结构线性2.分子类型DNA3.序列描述SEQIDNo.4gattctgaggatcacagstacggagttgcc60cttatgcattcattttgtgcattcaaggcgg￡Ltg￡LtggCC120agatttttcttcaatattttcactcgacagtgcgaagaatttatatatggg鹏tgtgaa180gga^atcagag￡Lgtgca^^aaatgtgtac■gagataat240gcaaacaggattataaagacaacattgcaacaagaaaagcc已gatttctgctttttggaa300gaag已tcctggaatatgtcgaggttatattaccaggtacttctacaacaa360cagtgtgaac"tggtggatgcctgggcaatatgagacactg420gaagaatgcaagaacatttgtgaagatggtccgaatggtttccaggtggataattatgga480acccagctcaatgctgtgaataactccctgactccgcaatcaaccaaggttcccagcctt540tttgaatttcacggtccctcatggtgtctcactccagcagacagaggattgtgtcgtgcc600aatgagaacagattctactacaattcagtcattgggaaatgccgcccatttaagtacagt660ggatgtgggggaaatgaaaacaattttacttccaaacaagaatgtctgagggcatgtaaa720aaaggtttcatccaaagaatatcaaaaggaggcctaattaaaaccaaaagaa肪agaaag780aagcagagagtgaaaatagcata.tgaagaaatttttgttaaaaatatgtga831SEQIDNo.51.序列特征1)长度276个氨基酸.2)类型氨基酸3)拓扑结构线性2.分子类型多肽序列描述SEQIDNo.5AspSerGluGluAspGluGluHisThrIsoIsoThrAspThrGluLeu16ProProLeuLysLeuMetHisSerPheCysAlaPheLysAlaAspAsp32GlyProCysCysAlaIsoMetLysArgPhePhePheAsnIsoPheThr48ArgGinCysGluGluPheIsoTyrGlyGlyCysGluGlyAsnGinAsn64ArgPheGluSerLeuGluGluCysLysLysMetCysThrArgAspAsn80AlaAsnArgIsoIsoLysThrThrLeuGinGinGluLysProAspPhe96CysPheLeuGluGluAspProGlyIsoCysArgGlyTyrIsoThrArg112TyrPheTyrAsnAsnGinThrLysGinCysGluArgPheLysTyrGly128GlyCysLeuGlyAsnMetAsnAsnPheGluThrLeuGluGluCysLys144AsnIsoCysGluAspGlyProAsnGlyPheGinValAspAsnTyrGly160ThrGinLeuAsnAlaValAsnAsnSerLeuThrProGinSerThrLys176ValProSerLeuPheGluPheHisGlyProSerTrpCysLeuThrPro192AlaAspArgGlyLeuCysArgAlaAsnGluAsnArgPheTyrTyrAsn208SerValIsoGlyLysCysArgProPheLysTyrSerGlyCysGlyGly224AsnGluAsnAsnPheThrSerHysGinGluCysLeuArgAlaCysLys240LysGlyPheIsoGinArgIsoSerLysGlyGlyLeuIsoLysThrLys256ArgLysArgLysLysGinArgValLysIsoAlaTyrGluGluIsoPhe272ValLysAsnMet2761权利要求1.包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒，其特征是用下述方法制成以序列表SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所述核苷酸序列为PCR引物，以重组质粒mTFPI-pPIC9为模板，扩增出人类组织因子途径抑制因子基因阅读框架，回收得到序列表SEQIDNo.1所述的1125bp的核苷酸序列，与pPIC9K加入T4连接酶进行连接反应，制备成包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒rhTFPI-pPIC9K。2.高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌，其特征是用下述方法制成将包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒ATFPI-pPIC9K导入巴斯德毕赤酵母工程菌种GS115，获得基因组中包含序列表SEQIDNo.4所述的人类组织因子途径抑制因子基因的重组酵母菌，运用抗生素G418抗性筛选，获得高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G418。全文摘要本发明公开了包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒及高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌，包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒，是以序列表SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所述序列为PCR引物，mTFPI-pPIC9为模板，扩增出人类组织因子途径抑制因子基因阅读框架，回收得序列表SEQIDNo.1所述的核苷酸序列，与pPIC9K加入T4连接酶进行反应，制成包括人类组织因子途径抑制因子的重组质粒。本发明应用剂量效应原理，运用抗生素G418抗性，筛选出高表达人类组织因子途径抑制因子重组酵母菌。经高密度发酵，使菌种表达人类组织因子途径抑制因子量大大提高。文档编号C12N15/81GK101509010SQ20091006825公开日2009年8月19日申请日期2009年3月26日优先权日2009年3月26日发明者冷希岗,宋丽萍,徐伟杰,筠朱,霞董申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所