专利名称：一种无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞及其构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域,涉及一种可诱导多能干细胞(Induced pluripotentstem cell，简称iPS细胞)，具体涉及一种无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞(猪iPS细胞)及其构建方法。
背景技术：
胚胎干细胞(ES)是哺乳动物囊胚期内细胞团(ICM)通过体外培养获得的细胞，其特性为无限增殖和发育全能性。胚胎干细胞对于生命科学研究具有十分重要的意义，其应用前景十分广阔(I)细胞移植治疗，ES细胞在体外能够无限扩增并发育成为各种成体细胞，因此ES细胞是细胞 移植治疗的重要细胞来源，例如ES细胞分化成为胰岛细胞治疗一型糖尿病；(2)研究人类疾病的细胞模型，ES细胞可以分化成为前体神经细胞，可以用于研究神经退行性疾病的发病机制；(3)对ES细胞进行基因修饰，通过同源重组可以对ES细胞中特定的基因进行敲入或敲除，研究这些特定基因在生长发育、营养代谢以及生理病理过程中的功能；(4)生产转基因动物，用于农业生产、人类器官移植供体、建立人类疾病模型、生产药用蛋白等。虽然ES细胞具有十分重要的应用价值，但是目前人们仅从小鼠、恒河猴、人和大鼠四个物种中建立了 ES 细胞系(Evans MJ et al. 1981 ；Thomson J A et al. 1995,1998 ；Buehr M et al. 2008 ；Li P et al. 2008)。由于体外培养条件等因素的限制，其他哺乳动物(如猪、牛、羊等)的ES细胞系仍然没有成功建立起来。诱导性多能肝细胞(iPSC)的出现，使人们看到了新的希望，人类体细胞导入四种转录因子基因(0ct4, Sox2和Klf4, c-Myc或Nanog, Lin28)，表达的转录因子使细胞重新编程后，转变为具有类似ES功能的诱导多能性干细胞(iPS)。尽管iPS细胞并非百分之百的ES细胞，但iPS细胞可运用到那些使用传统方法无法建立ES细胞的物种上，比如猪、牛、羊等。猪是一种重要的经济动物，与人类生活密切相关。其妊娠期短，平均为114天，繁殖力强，平均产仔数为10头，后代生长快，母猪性成熟是4到5月龄，公猪在性成熟是5到6月龄。猪在解剖、组织结构、生理和营养代谢等方面与人类最为接近，因此，转基因猪在生命科学研究中具有重要的研究价值，转基因猪可以用于农业生产、人类器官移植供体、建立人类疾病模型、生产药用蛋白等。2009年，三个不同的实验室先后成功建立了猪诱导多能干细胞(Wu Z etal. 2009 ；Esteban MA et al. 2009 ；Ezashi T et al. 2009)。然而，这些猪 iPS 细胞内都整合有外源基因(0ct4，Sox2和Klf4，c-Myc或Nanog，Lin28)，外源基因的存在会增加这些iPS细胞的致癌风险，因此，构建无外源基因整合的iPS细胞显得尤为重要。
发明内容
本发明的首要目的在于，提供一种无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞的构建方法。本发明的第二个目的在于，提供一种无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞。在本发明的第一个方面，提供一种无外 源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞的构建方法，包括以下步骤a)采用CreER慢病毒载体感染猪可诱导多能干细胞；b)采用40H-Tamoxifen处理上一步骤得到的干细胞,所述CreER将外源因子切除掉；c)采用FACS筛选上一步骤得到的干细胞，得到所述无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞。根据本发明，所述CreER慢病毒载体为Lv_ef Ia-CreER-IRESncherry,Lv-efIa-CreER-1RES-puro,或 Lv-efla-CreER-IRES-neo。根据本发明，所述猪iPS细胞内整合有带Ioxp的外源诱导因子，所述外源诱导因子为0ct4、Sox2、Klf4、c-Myco根据本发明，所述步骤a)的感染复数MOI < 50。根据本发明，所述40H_Tamoxifen的浓度为0. 8 I. 2uM。根据本发明，所述步骤b)中被切除的外源因子为0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc。根据本发明，所述步骤b)中的所述将外源因子切除掉是以绿色荧光蛋白EGFP不再表达为标志。根据本发明，所述步骤c)得到的所述无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞不表达绿色荧光蛋白。在本发明的第二个方面，提供由上述构建方法构建的无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞。本发明获得无外源诱导因子整合的猪iPS细胞，可以应用于核移植克隆猪或者转基因猪，大大降低了外源诱导因子尤其是c-Myc的致癌风险。
图I是慢病毒载体Lv-efl a -Cre的结构图。图2是慢病毒载体Lv-efl a -CreER的结构图。图3是慢病毒载体Lv-efl a -CreER(Nhel)的结构图。图4 是慢病毒载体 Lv-efl a -CreER-1RES-mcherry 的结构图。图5是Lv-efl a -CreER-IRESncherry慢病毒感染猪iPS细胞，加药组第6天(力口A 40H-Tamoxifen后第5天)的荧光镜检结果。b :明场下的细胞形态；G =EGFP的表达；R mcherry的表达。图6是Lv-efl a -CreER-IRES-mcherry慢病毒感染猪iPS细胞,对照组第6天的荧光镜检结果。b :明场下的细胞形态；G =EGFP的表达；R mcherry的表达。图7是Lv-efl a -CreER-IRES-mcherry慢病毒感染猪iPS细胞，加药组加入40H-Tamoxifen 5天后，对照组和加药组猪iPS细胞的EGFP表达水平比较。上半部分是荧光显微镜下观察结果，下半部分是对应的猪iPS细胞被消化成单细胞后进行FACS分析的结果，Ml表示表达EGFP的细胞，M2表示不表达EGFP的细胞。表示对照组，“ + ”表示加药组。图8是Lv-efl a -CreER-IRES-mcherry慢病毒感染猪iPS细胞，加药组加入40H-Tamoxifen 5天后，对照组和加药组猪iPS细胞的EGFP表达水平柱状图比较。图 9 是用 Lv_ef la-CreER-IRES-mcherry 感染猪 iPS 细胞,加入 40H_Tamoxifen 诱导7天后，经过FACS分选，得到无外源诱导因子的猪iPS细胞(OSKC-free pig ips)和没有切除外源因子的猪iPS细胞。FACS分选后分别铺在两个24孔板的两个孔中。b :明场下的细胞形态；G EGFP的表达；R mcherry的表达。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。 在本发明中，所述猪iPS细胞是这样的干细胞，其整合有带Ioxp的外源诱导因子，所述外源诱导因子为0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc。且外源因子0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc所在的慢病毒载体上含有可同时表达的绿色荧光蛋白EGFP。以下实施例中，用到的培养基有293T细胞的培养基(10 % D-MEM)，具体组成为89 %的D-MEM培养液(购自Invitrogen, 11965) ;10% 的胎牛血清(购自 Hyclone，SH30396. 03) ；lmM L-谷氨酸(购自Invitrogen, 25030) ;1*% 的非必须氨基酸(购自 Invitrogen, 11140050)。猪iPS细胞的培养基(ESO)，具体组成为79%的Knockout D-MEM/F12培养液(购自 Invitrogen, I266O) ;2O的Knockout SR(购自 Invitrogen, IO828) ；ImM L-谷氨酸(购自 Invitrogen, 25030) ;1*% 的非必须氨基酸(购自 Invitrogen, 11140050) ；0. ImMfi-疏基乙醇(购自 Sigma，M7522)。以下实施例中所使用的慢病毒原始载体Lv-efl a -IRES-EGFP购自Invitrogen公司，具有氨节抗性。以下实施例中，通用的细胞培养产品均购自Invitrogen公司。实施例I、慢病毒载体Lv-efl a -Cre的构建I. I、根据 pBluescript II SK(-)-Cre (Stratagene)的序列设计 Cre 的引物,引入酶切位点，引物序列如表I所示(其中F表示正向引物，R表示反向引物)。表I引物序列
权利要求
1.一种无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 a)采用CreER慢病毒载体感染猪可诱导多能干细胞； b)采用40H-Tamoxifen处理上一步骤得到的干细胞,所述CreER将外源因子切除掉； c)采用FACS筛选上一步骤得到的干细胞，得到所述无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞。
2.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于，所述CreER慢病毒载体为Lv-ef la-CreER-IRES-mcherry, Lv-efIa~CreER-1RES-puro,或 Lv-efla-CreER-IRES-neo。
3.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于，所述步骤a)的感染复数MOI< 50。
4.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于，所述外源因子包括0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc。
5.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于，所述40H-Tamoxifen的浓度为0.8 I. 2uM。
6.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于，所述步骤b)中的所述将外源因子切除掉是以EGFP不再表达为标志。
7.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于，所述步骤c)得到的所述无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞不表达绿色荧光蛋白。
8.一种按权利要求I 7任一项所述的构建方法构建的无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞。
全文摘要
本发明涉及一种无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞及构建方法，包括步骤A)采用CreER慢病毒载体感染猪可诱导多能细胞，经4OH-Tamoxifen诱导，CreER可以将带有loxp的外源因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc切除掉；B)通过FACS将不表达绿色荧光蛋白即无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞筛选出来。本发明获得的无外源诱导因子整合的猪可诱导多能干细胞可以应用于核移植克隆猪或者转基因猪，大大降低了外源诱导因子尤其是c-Myc的致癌风险。
文档编号C12N15/867GK102747104SQ201110100449
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者吴璐, 朱辉, 肖磊, 陈霁君 申请人:中国科学院上海生命科学研究院