含有外源性内表位的病毒颗粒的制作方法

专利名称：：含有外源性内表位的病毒颗粒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肽在病毒粒子上的表达，尤其是肽在病毒衣壳内的表达。
背景技术：
：疫苗是生物医学科学和公众健康方面的巨大进步之一。在二十世纪初，感染性疾病在美国广为传播，使人口付出了巨大的代价。例如，1900年，报道了21，064个天花病例，其中894个病人死亡。1920年，报道了469，924个麻疹病例，其中7575个病人死亡；报道了147，991个白喉病例，其中13，170个病人死亡。1922年，报道了107，473个百日咳病例，其中5099个病人死亡。这些疾病大部分在美国已经被消灭了。尽管取得了这些成功，但是就世界范围来说，每年还有超过500万的婴儿死于可用现有疫苗预防的疾病。然而，许多现有疫苗必须冷藏保存，这就使得它们在发展中国家的分发较为困难。而且，还有针对具有显著发病率或死亡率疾病的疫苗尚未发明或是不能得到的情况。举例而言，每年有超过2.5亿人慢性感染乙肝病毒，疟疾导致100-200万人丧生；估计腹泻疾病(例如，由rotovirus、sp.志贺氏杆菌、霍乱弧菌和毒素产生型大肠杆菌引起的感染)每年夺去超过估计的400-500万人的生命。疾病控制中心已经识别了几个用于获得全部可能的疫苗的因素。(ww.cdc.gov/epo/腿wr/preview/mmwrhtm1/00056803.htm)Q这些建议包括寻找疫苗释放和使用的新方法。一种方法是开发剌激两种免疫反应B细胞介导的体液免疫反应和辅助T细胞介导的细胞免疫反应的疫苗。但是，尝试产生同时刺激体液和细胞免疫反应或优先诱导细胞免疫反应疫苗的努力遇到了困难。例如，合成肽疫苗和重组蛋白质疫苗通常免疫源性差，易于诱导体液免疫反应，不能诱导细胞免疫反应。DNA疫苗可以同时诱导体液和细胞免疫反应。但是，问题是长期的抗原表达将导致何种后果。因此，本领域需要改善疫苗的释放机制。特别是，释放机制应该有助于诱导细胞和体液免疫反应。发明概述本发明涉及肽在病毒颗粒上的表达，尤其是肽在病毒外壳或以内的表达。在一些实施方案中，本发明提供了包含嵌合病毒粒子的化合物，该嵌合病毒粒子具有一个蛋白质外壳，其中该蛋白质外壳具有内外表面，在所述的蛋白质外壳的内表面上该衣壳至少包括一个外源肽。在一些优选实施方案中，病毒粒子能在宿主细胞或组织里装配。在一些实施方案中，病毒粒子是二十面体结构。在一些优选实施方案中，病毒粒子是一种豇豆花叶病毒组。在一些特别优选实施方案中，病毒粒子是豇豆花叶病毒。在一些实施方案中，外源肽插入到病毒粒子的一种外壳蛋白中。在一些优选实施方案中，外源肽具有5到20个氨基酸。在其它优选实施方案中，外源肽在外壳蛋白从氨基端的第5到20个氨基酸位点之间插入，这样在宿主细胞中这种病毒粒子的装配也可发生。在一些特别优选实施方案中，外源肽是插入到位于第11位点的酪氨酸残基和第12位点的重复酪氨酸残基之间豇豆花叶病毒的VP-S中的。在其它特别优选的实施方案中，外源肽是插入到位于包括第IO位点的缬氨酸残基和第11位点的酪氨酸残基的二肽和包括第12位点的缬氨酸残基和第13位点的酪氨酸残基的重复二肽之间豇豆花叶病毒的VP-S中的。在其它优选实施方案中，外源肽插入到位于第10位的缬氨酸残基和第11位的重复缬氨酸残基之间的豇豆花叶病毒的VP-S中的。在更多的实施方案中，病毒粒子不包含核酸。在其它实施方案中，外源肽编码一个能被动物免疫系统识别的表位。在一些优选实施方案中，外源表位是细胞毒性的T型淋巴细胞表位。在特别优选实施方案中，外源表位包括具有来自自然产生表位源的侧面6氨基酸的细胞毒性的T型淋巴细胞表位。在一些实施方案中，外源肽是T型辅助细胞的表位。在一些优选实施方案中，外源表位包括具有来自自然产生表位源的侧面氨基酸序列的T型辅助细胞的表位。在其它更多实施方案中，外源表位是B细胞表位。在更多的实施方案中，外源肽包括具有来自自然产生的表位源的侧面氨基酸序列的T型辅助细胞的表位。在一些实施方案中，嵌合病毒粒子包含表达在病毒外壳的外表面的第二个外源肽。在优选实施方案中，第二个外源肽表达在病毒外壳的外表面，其中所述肽是插入豇豆花叶病毒的vp-s的ec'-ec''环。在其它优选实施方案中，第二个外源肽表达于病毒外壳的外表面，其中所述肽是插入豇豆花叶病毒的VP-S的PC-PC环中。在其它优选实施方案中，第二个外源肽表达于病毒衣壳的外表面，其中所述肽插入豇豆花叶病毒的VP-L的PE-PA环中。在其它实施方案中，本发明提供了一种疫苗组合物，其特征在于它包含有效量的病毒粒子，该病毒粒子包含外壳，该外壳具有内外表面，所述的衣壳包含至少一种外源肽，其中所述的外源肽是在所述衣壳的所述内表面上。在其它实施方案中，本发明提供了一种配方，它包含一种病毒粒子作为活性成分，该病毒粒子含有外壳，该外壳具有内表面和外表面，所述外壳包含至少一种外源肽，其中所述的外源肽是在所述衣壳的所述内表面上，和一种佐药。在一些实施方案中，本发明提供了一种化合物，该化合物包含一种病毒外壳蛋白，其中所述病毒外壳蛋白包括外源肽，可以设计所述病毒外壳蛋白，以便装配进入具有内表面和外表面的病毒衣壳中，其中所述的外源肽是在所述病毒蛋白衣壳的所述内表面表达的。在更多的实施方案中，本发明提供了制备病毒粒子的方法，该方法包括提供宿主细胞和编码病毒粒子的核酸，所述病毒粒子包括i)病毒外壳蛋白，所述的病毒外壳蛋白具有内表面和外表面，和ii)外源肽，其中所述外源肽是插入到所述病毒外壳蛋白的所述内表面;用所述核酸转染所述宿主细胞，以便产生病毒粒子。在另外一些实施方案中，本发明提供一种在需要该治疗的动物中诱导免疫反应的方法，所述的方法包括给动物使用一种包括一种具有内表含至少一种外源肽，其中所述的外源肽位于所述衣壳的所述内表面。在另外一个实施方案中，本发明提供了一种通过所述的生产方法可以获得的产品，该生产方法包括提供宿主细胞和编码病毒粒子的核酸，所述病毒粒子包括i)病毒衣壳蛋白，所述的病毒衣壳蛋白具有内表面和外表面，和ii)外源肽，其中所述外源肽是插入到所述病毒外壳蛋白的所述内表面；用所述核酸转染所述宿主细胞，以便产生病毒粒子。在一些实施方案中，本发明提供了一种含有病毒粒子的商业包装，该病毒粒子含有具备内表面和外表面的外壳，所述外壳含有至少一个外源肽，其中所述外源肽位于所述外壳的所述内表面作为活性成分，及其使用说明书。在其它实施方案中，本发明化合物包括表达这里描述的任何实施例中的内表位的嵌合病毒粒子。在一些实施方案中，本发明提供了包含编码病毒粒子核酸的载体，该病毒粒子包括i)具有内表面和外表面的病毒外壳蛋白，和ii)外源肽，其中所述的外源肽是插入到病毒外壳蛋白的内表面。本发明不限定载体的特定类型。实际上，多种载体都可考虑，包括，但不限于RNA载体(例如，编码(+)链RNA病毒的核酸)或DNA载体(例如，编码(+)链RNA病毒的质粒DNA)。同样地，本发明不限定于任何特定病毒粒子。实际上，多种病毒粒子都可考虑，包括，但不限于，杆状病毒粒子和二十面体病毒粒子。本发明不限于任何特定植物(+)链RNA病毒。实际上，多种植物(+)链RNA病毒都可在本发明中使用。在一些优选实施方案中，植物(+)链RNA病毒是豇豆花叶病毒组。在特别优选的实施方案中，植物(+)链RNA病毒是豇豆花叶病毒。在一些实施方案中，外壳蛋白是来自(+)链RNA病毒。本发明不限定外壳蛋白来自何种特定的(+)链RNA病毒。实际上，来自多种(+)链RNA病毒的外壳蛋白都可考虑。在一些优选实施方案中，外壳蛋白来自一种植物(+)链RNA病毒。本发明不限定外源肽插入任何特定位点。实际上，可以考虑在多种位点插入。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白具有氨基端，外源肽插入从氨基端算起的第5到第20个氨基酸的位置，以便所述的病毒外壳蛋白的装配可以进行。在一些优选实施方案中，病毒外壳蛋白是豇豆花叶病毒的VP-S，并且外源肽是插入VP-S的第11位点酪氨酸残基和基因工程改造的vp-s的第12位点的重复酪氨酸残基。在其它优选实施方案中，病毒外壳蛋白是豇豆花叶病毒的vp-s，外源肽插入vp-s的包括位于第10位点的缬氨酸残基和第11位点的酪氨酸残基的二肽和vp-s的包括基因工程改造的第12位点的缬氨酸残基和由基因工程改造的第13位点的酪氨酸残基的重复二肽之间。本发明不限定外源肽的任何特定类型。实际上，多种外源肽可以在本发明的载体上表达。在一些实施方案中，外源肽是疏水的。在其它实施方案中，外源肽是细胞毒性的t淋巴细胞表位。在更多的实施方案中，外源肽是辅助t细胞表位。在其它实施方案中，外源肽是b细胞表位。本发明不限定载体只编码一种外源肽。实际上，本发明考虑一种以上的外源肽能够从载体上表达。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白进一步包含第二个外源肽。在优选实施方案中，第二个外源肽是插入到所述病毒外壳蛋白的外表面。在一些特别优选的实施方案中，病毒外壳蛋白是具有一个pc'-pc"环的vp-s，第二个外源肽插入所述的ec'-ec"环。在其它优选的实施方案中，病毒外壳蛋白是具有3e-pa环的vp-l，第二个外源肽插入所述的eE-pa环。本发明的载体也包括其它成分，例如调控元件。在一些实施方案中，核酸进一步编码可可操作连于编码病毒粒子核酸的启动子。本发明不限定任何特定的启动子。实际上，多种启动子都可考虑，包括，但是不限于组织特异性植物启动子和组成型植物启动子。在其它实施方案中，本发明提供了几种方法，包括提供了i)上述的载体，和ii)宿主细胞；和b)在转染细胞表达病毒粒子的条件下，用载体转染宿主细胞产生转染宿主细胞。本发明不限定转染任何特定的宿主细胞。实际上，转染多种宿主细胞都可考虑，包括，但不限于，宿主细胞可选自植物体的细胞群、植物组织培养细胞、植物原生质体、植物组织中的细胞。更在进一步的实施方案中，本发明包括用这些方法产生的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了几种方法，包括提供了用上面描述的载体转染的植物以及在产生病毒粒子的条件下培植植物。在一些优选实施方案中，所述的方法进一步包括从植物中纯化病毒粒子的步骤。在更多的实施方案中，本发明提供了包含编码含有外源肽的病毒外壳蛋白其中的核酸的组合物，该病毒外壳蛋白被设计以便装配进入具有内表面和外表面的病毒外壳，其中外源肽在病毒粒子的内表面表达。本发明不限定于任何特定类型的核酸。实际上，多种核酸都可考虑，包括，但不限于RNA,(例如，编码(+)链RNA病毒的核酸)或DNA(例如，编码(+)链RNA病毒的质粒DNA)。同样地，本发明不限定于任何特定病毒粒子。实际上，多种病毒粒子都可考虑，包括，但不限于，杆状病毒粒子和二十面体病毒粒子。本发明不限于任何特定植物(+)链病毒。实际上，多种植物(+)链RNA病毒都可用于本发明。在一些优选实施方案中，植物(+)链RNA病毒是豇豆花叶病毒组。在特别优选的实施方案中，植物(+)链RNA病毒是豇豆花叶病毒。在一些实施方案中，外壳蛋白是来自(+)链RNA病毒。本发明不限定外壳蛋白来自任何一种特定的(+)链RNA病毒。实际上，来自多种(+)链RNA病毒的外壳蛋白都可考虑。在一些优选实施方案中，外壳蛋白来自一种植物(+)链RNA病毒。本发明不限定外源肽插入任何特定位点。实际上，在多种位点插入得以考虑。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白具有氨基端，外源肽插入从氨基端算起的第5到第20个氨基酸的位置，以便所述的病毒外壳蛋白的装配可以进行。在一些优选实施方案中，病毒外壳蛋白是豇豆花叶病毒的VP-S，并且外源肽是插入VP-S的第11位点酪氨酸残基和基因工程改造的VP-S的第12位点的重复酪氨酸残基之间。在其它优选实施方案中，病毒外壳蛋白是豇豆花叶病毒的VP-S，外源肽插入VP-S的包括位于第10位点的缬氨酸残基和第11位点的酪氨酸残基的二肽和VP-S的包括基因工程改造的第12位点的缬氨酸残基和由基因工程改造的第13位点的酪氨酸残基的重复二肽之间。本发明不限定外源肽为任何特定类型。实际上，多种外源肽可以在本发明的载体上表达。在一些实施方案中，外源肽是疏水的。在其它实施方案中，外源肽是细胞毒性的T淋巴细胞表位。在更多的实施方案中，外源肽是辅助T细胞表位。在其它实施方案中，外源肽是B细胞表位。本发明不限于只编码一种外源肽的核酸。实际上，本发明认为核酸可以编码一个以上的外源肽。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白进一步包括第二个外源肽。在优选实施方案中，第二个外源肽插入病毒外壳蛋白的外表面。在一些特别优选实施方案中，病毒外壳蛋白是具有ec'-PC"环的VP-S,第二个外源肽插入所述的PC'-PC"环。在其它实施方案中，病毒外壳蛋白是具有PE-3A环的VP-L，第二个外源肽插入到所述的PE-PA环中。本发明的核酸也包括其它成分，例如调控元件。在一些实施方案中，核酸进一步编码可可操作连于编码病毒粒子核酸的启动子。本发明不限定任何特定的启动子。实际上，多种启动子都可考虑，包括，但是不限于组织特异性植物启动子和组成型植物启动子。在本发明的更多实施方案中，本发明提供了包含具有内表面和外表面外壳的病毒粒子，该衣壳包含至少一个外源肽，其中外源肽是在外壳的内表面上。本发明不限于任何特定的病毒粒子。实际上，如上所述，本发明囊括多种病毒粒子。在一些实施方案中，本发明提供了表达病毒粒子的植物。在更多的实施方案中，本发明提供了从该植物分离的果实、叶子、块茎、茎或纯化的病毒粒子。在其它实施方案中，本发明提供了诱导免疫反应的方法，该方法包括提供i)病毒粒子(如上描述)，该病毒粒子包含多个具有内表面和外表面的外壳蛋白，该外壳蛋白包含外源肽，其中外源肽是在外壳蛋白的内表面上；和ii)被试者；b)在被试者针对外源肽产生免疫反应的条件下，将被试者暴露给病毒粒子。在一些优选实施方案中，病毒粒子是由植物源提供的。在本发明的更多实施方案中，本发明提供了包含编码具有插入的外源肽序列的病毒外壳蛋白序列的核酸的载体，该病毒外壳蛋白包括第二个点突变，从而使得病毒外壳蛋白能够装配进病毒外壳。本发明不限定任何特定的第二位点突变。实际上，多个第二位点点突变都可考虑，包括，但是不限于，第二位点点突变在豇豆花叶病毒的VP-S和VP-L上。在特别优选实施方案中，第二个点突变选自VP-S中的F91S、VP-S中的F180L、VP—S中的M177V、VP—S中的I124V、VP—L中的R2102K、VP-L中的I2045M、VP-S中的M177T、VP-L中的A2092T、VP-S中的G80D。在一些实施方案中，本发明提供了在病毒外壳蛋白中诱导第二个点突变的方法，该方法包括提供i)包含编码病毒粒子的核酸的载体，该病毒粒子包括病毒外壳蛋白，该病毒外壳蛋白具有内表面和外表面，和ii)外源肽，其中外源肽是插入到病毒外壳蛋白的内表面和ii)第一宿主植物；用载体感染第一宿主植物，以便表达病毒粒子；监控第一宿主植物，直到在直接感染的叶片上出现晚期病变；接种第二宿主植物，以便获得继发性感染。在一些实施方案中，该方法进一步包括监控第二宿主植物直到全身症状出现的步骤。在一些优选实施方案中，全身症状的出现时间与用对照病毒粒子感染植物出现全身症状的时间框架一致。在其他实施方案中，该方法进一步包括权利要求84所述方法的步骤，进一步包括从全身病变中分离病毒粒子的步骤，该病毒粒子包括一个基因组；和对病毒粒子的基因组测序。在一些实施方案中，本发明提供了用本方法产生的病毒粒子。在一些实施方案中，本发明提供了包括含有外壳的病毒粒子的疫苗组合物，该外壳具有内表面和外表面，包括至少一种外源肽，其中外源肽是在衣壳的内表面上。在更多的实施方案中，本发明提供了诱导体液免疫反应的方法，该方法包括给动物使用本疫苗组合物。在其他实施方案中，本发明提供了增强针对B细胞表位的免疫反应的方法，该方法包括提供了i)修饰的病毒粒子，它包括一个B细胞表位和一个免疫原复合物中的内在细胞毒性T细胞(CTL)表位；禾口ii)一种动物；将修饰病毒粒子施用于动物。本发明不限定于任何特定的CTL表位。实际上，多种CTL表位都可考虑，包括，但不限于，乙肝病毒表面抗原"a"类决定簇的2F10肽模拟位(mimotope)。本发明还提供了增强针对B细胞表位的免疫反应的方法，该方法包括提供了i)修饰的病毒粒子，其包括一个B细胞表位和一个抗原复合物中的内在CTL表位；和一种动物；b)将修饰病毒粒子施用于动物。本发明不限定于特定CTL表位。实际上，多种CTL表位都可考虑，包括，但不限于，乙肝病毒表面抗原"a"类决定簇的2F10肽模拟表位(mimotope)。在一些实施方案中，本发明提供了增强针对B细胞表位的免疫反应的方法，包括提供了i)修饰的病毒粒子，包括一个B细胞表位和一个免疫原复合物中的内在辅助T细胞表位；和ii)一种动物；以及将修饰病毒粒子施用于动物。本发明不限定于任何特定的T细胞表位。实际上，多种T细胞表位都可考虑，包括，但不限于破伤风类毒素的通用T细胞表位o在另一些实施方案中，本发明提供了增强针对B细胞表位的免疫反应的方法，包括提供了i)修饰的病毒粒子，包括一个B细胞表位和一个抗原复合物中的内在辅助T细胞表位；和ii)一种动物；以及将修饰病毒粒子施用于动物。本发明不限定于任何特定的T细胞表位。实际上，多种T细胞表位都可考虑，包括，但不限于破伤风类毒素的通用T细胞表位。图1表示CPMV的VP-S蛋白的氨基端的序列以及说明外源肽可以插入的位置。图2表示根据本发明一个实施方案(参考实施例6)用嵌合病毒粒子预防接种小鼠的CTL分析结果；使用BetaMax工作站测量含有来自LCMV耙肽的靶细胞或空载细胞的铬的释放量。图3表示使用于公开的大量遗传构建中的载体pCP26的限制性酶切图谱。发明详述本发明涉及肽在病毒粒子上的表达，尤其是肽在病毒外壳或内表面上的表达。嵌合病毒粒子(CVP)作为疫苗使用代表一项改善疫苗储藏和释放的富有吸引力的战略。CVP的使用在美国专利5,874,087和5,958,422中有报道(将它们每个引述于此作为参考)。这些专利描述了研发编码在其外壳蛋白中包含肽插入物的修饰的豇豆花叶病毒(CPMV)基因组的载体。这些载体用于产生病毒粒子，肽呈现在病毒粒子的表面。在定义之后，描述病毒粒子表达系统，肽插入物和插入位点，以及修饰病毒粒子的用途。定义为便于理解本发明，几个术语定义如下。在此所用，术语"病毒粒子"是指病毒的全部或部分装配的衣壳。病毒衣壳可以含有或者可以不含有核酸。在此所用，术语"病毒衣壳"是指在野生型病毒中，包裹病毒核酸的蛋白质外壳。病毒衣壳具有内表面和外表面。病毒衣壳的内表面是指通常暴露于病毒核酸的表面。病毒衣壳的外表面是指通常暴露于环境中的表面。在此所用，术语"病毒外壳蛋白"是指与其它蛋白作用装配构成病毒衣壳部分的蛋白质。病毒外壳蛋白的实例包括，但是不限于，豇豆花叶病毒的VP-S和VP-L外壳蛋白质。病毒外壳蛋白的内侧面是指暴露于病毒衣壳内表面的外壳蛋白质部分。病毒外壳蛋白的外侧面是指暴露于病毒衣壳的外表面的外壳蛋白质部分。在此所用，术语"(+)链RNA病毒"是指含有RNA基因组的病毒，其中当导入合适的宿主时，分离的RNA具有直接感染力。已知(+)链RNA病毒能感染多种动物、真菌和植物宿主。(+)链RNA病毒的实例包括，但不限于，小RNA病毒(例如polioviruses)，和来自于以下家族的病毒椰菜花叶病毒属、雀麦花叶病毒病毒属、豇豆花叶病毒属、双粒病毒属、弧肠孤病毒属、分病毒属、sequivididae、烟草花叶病毒属和番茄丛矮病毒属。当在植物病毒感染时使用时，术语"症状"是指在植物体上病毒感染指征的出现。这些指征包括局部病变和全身症状。局部病变例如坏死斑，褪绿斑和环斑发生在感染部位或其附近。全身症状出现在整个植物体，包括镶嵌型，斑点型，矮化病，黄化和坏死。在此所用，术语"全身感染"是指从起始部位扩散的病毒感染。对植物而言，当病毒从感染细胞移动进入植物的微管结构(例如，韧皮部)时，就会发生全身症状。对许多病毒而言，该移动是受一种调节原生质网(plasmadesmata)的移动蛋白调节的。当在病毒衣壳或病毒粒子中使用时，术语"二十面体的"是指表现普通二十面对称的衣壳通过12个顶点的每一顶点的5层折叠旋转对称，关于通过20个三角每一表面中心轴的3层折叠旋转对称，关于通过30个边的每一中轴的3层折叠旋转对称。二十面体包括60个相同的建筑单位(可以包括一个以上的亚单位)或若干60个相同的建筑单位。整个衣壳中的单位间接触不是完全相同的；但是，所有单位间结合涉及接触同一总类型，所以单位间结合可以看作准相同。预期一些二十面体病毒，特别是大二十面体病毒(例如，腺病毒)可能与从较小二十面体病毒观察所得的结构和几何标准不同。二十面体病毒的实例包括，但不限于，小RNA病毒，腺病毒和来自以下家族的病毒椰菜花叶病毒属、雀麦花叶病毒病毒属、豇豆花叶病毒属、双粒病毒属、弧肠孤病毒属、分病毒属、sequivididae和番茄丛矮病毒属。在此所用，术语"表位"是指抗原决定簇，它是具有诱导产生特异抗体和与特异抗体(即，能够结合到特定免疫球蛋白或T细胞受体上)结合能力或潜能的大分子的任意一个区域。当使用于肽或表位时，术语"疏水的"是指含有20%或更多疏水性氨基酸残基的肽或表位(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸)。在此所用，术语"细胞毒性T淋巴细胞表位"是指能被细胞毒性T淋巴细胞识别的表位。在此所用，术语"辅助T细胞表位"是指能被辅助T细胞识别的表位。在此所用，术语"B细胞表位"是指能被B细胞识别的表位。在此所用，术语"免疫反应"是指由免疫系统调节的动物对抗原或免疫源的反应，其特征是可以产生抗体和/或刺激细胞介导或免疫耐受性。在此所用，术语"抗原复合物"是指包含至少一种能与免疫球蛋白或细胞表面受体结合的表位的复合物。在此所用，术语"免疫复合物"是指包含至少一种能够诱导体液和/或细胞介导免疫反应的表位的复合物。在此所用，术语"模拟位(mimotope)"是指结构上与表位确实相似的用于诱导针对该表位的免疫反应的肽，即使两者的序列在氨基酸水平上没有同源性或相似性(在肽模拟位情况下)，或，其中在模拟位代表一个为非蛋白质分子，例如碳水化合物，接受的结构构型时，模拟位具有与介导该非蛋白质表位的免疫分子反应的能力。在此所用，术语"免疫球蛋白"是指浆细胞的分泌产物(例如，激活的B细胞)，它包括两条重链和两条轻链复合在一起形成一个蛋白质结合的位点。在此所用，术语"I类MHC-主要组织相容性基团I类蛋白"是指由主要组织相容性基因编码的蛋白质，它的含义是CD8+T淋巴细胞的抗原有效提呈。在此所用，术语"n类腿c-主要组织相容性基团n类蛋白"是指由主要组织相容性基因编码的蛋白质，它的含义是CD4+T淋巴细胞的抗原有效提呈。在此所用，术语"植物"是指多种植物细胞，该细胞很大程度上分化成存在于植物发育的任何阶段的结构。这样的结构包括，但不限于，果实、芽、茎、叶、花瓣等。术语"植物组织"包括植物的分化和未分化组织，包括，但不限于，根、芽、叶、花粉、种子、瘤组织和培植的多种细胞(例如，单细胞、原生质体、胚芽、愈合组织等)。植物组织可以存在于植物中，存在于器官培养，组织培养或细胞培养中。在此所用，术语"原生质体"是指去掉细胞壁的分离的植物细胞。一般而言，原生质体根据传统方法产生(例如，参见，美国专利4，743，548;4，677，066;5，149，645;和5，508，184;所有这些引述于此作为参考)。植物组织可以分散在适当的介质中，该介质具有合适的渗透压(例如，3-8重量％的糖多元醇)和一种或几种多糖水解酶(例如，果胶酶、纤维素酶等)，允许细胞壁降解进行足够时间以便提供原生质体。过滤后，原生质体可以用离心方法分离，然后重新悬浮用于随后处理或用途。持续培植的原生质体再生成完整植物体是用本
技术领域：
所知的方法进行的(例如，参见，Evans等人，植物细胞培养手册，1:124-176页，Macmillan出版公司，纽约[1983];结合，植物原生质体，21-37页，CRC出版社，BocaRaton[1985]和Potrykus和Shillito，酶学方法，118巻，植'物分子生物学，A.和H.Weissbach编辑，学术出版社(AcademicPress)，Orlando[1986])。在此所用，术语"基因"是指含有对照和产生多肽或蛋白质前体必需的编码序列的DNA序列。多肽可以由全长的编码序列或任何部分的编码序列编码，只要期望的蛋白质活性予以保留。在此所用，"核苷酸"是指由共价连接到五碳糖分子上的嘌呤[鸟嘌啉(G)或腺嘌呤(A)]和嘧啶[胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)]碱基组成的化合物，而"核苷酸"通常是指在其一个五碳糖羟基基团上发生磷酸化的核苷酸分子。在此所用，"核酸"是指核苷酸共价连接序列，其中一个核苷酸的五碳糖的3'位与下一个五碳糖的5'位通过磷酸二酯键相连，并且其中的核苷酸残基(碱基)是以特定序列相连的；即，核苷酸的线性序列。在此所用，"多核苷酸"是指包含长度超过100个核苷酸序列的核酸。在此所用，"寡核苷酸"是指短多核苷酸或多核苷酸的一部分。典型的寡核苷酸包括一个约由2到100个碱基组成的序列。单词"寡"有时代替单词"寡核苷酸"。之所以说核酸分子具有"5'末端"和"3'末端"，是因为核酸磷酸二酯键连接是发生于取代单核苷酸的五碳糖环的5'碳原子和3'碳原子上。其中新的连接将发生在5，碳原子上的核酸末端是其5，末端。其中新的连接将发生在3'碳原子上的核酸末端是其3'末端。在此所用，"末端核苷酸"是指位于5'末端和3'末端的最后一个核苷酸。之所以说DNA分子具有5'末端和3'末端，是因为单核苷酸反应形成寡核苷酸的方式使一个单核苷酸五碳糖环的5'磷酸基通过磷酸二酯键按一个方向结合到相邻的单核苷酸五碳糖环的3'氧原子上。所以，如果寡核苷酸的5'磷酸基不与单核苷酸五碳糖的3'氧原子相连，则寡核苷酸的末端称为5'末端；如果寡核苷酸的3'氧原子不与下一个单核苷酸五碳糖的5'磷酸基相连，则寡核苷酸的末端称为3'末端。在此所用，"核酸序列"，即使在大的寡核苷酸或多核苷酸内部，也可以说具有5，末端和3，末端。在线性或环状的DNA分子中，离散元件被称作"上游"或5'元件相对于"下游"或3'元件。这些术语反映了转录是沿着DNA链从5，向3'方向进行的事实。典型情况下，介导连接基因转录的启动子和增强子元件通常位于编码区的5'端或上游。但是，增强子元件即使位于启动子元件和编码区的3'端也能够起作用。转录终止和多腺苷酸化信号位于编码区的3'或下游。当使用于基因时，术语"野生型"是指具有从自然存在材料中分离基因的特征的基因。当使用于基因产物时，术语"野生型"是指具有从自然存在材料中分离基因产品的特征的基因产品。野生型基因是指在群体中最常见，并且因此武断地定为该基因的"正常的"或"野生型"形式。相反，当使用于基因或基因产品时，术语"修饰的"或"突变型"相应是指与野生型基因或基因产品相比较，表现出序列和/或功能特性的修饰(即，改变特性)的基因或基因产品。应该注意到，可以分离自发突变体；当与野生型基因或基因产品比较时，根据它们改变了特性的事实识别它们。在此所用，术语"过量表达"是指在转基因生物体某个基因产品的产量超过了正常或非转化生物体的产量水平。在此所用，术语"共抑制"是指表达与内源基因实质上同源的外源基因，导致外源基因和内源基因的表达都受到抑制。在此所用，术语"变化水平"是指转基因生物的基因产品产量在数量或比例上与正常或非转化生物不同。当使用于DNA分子时，术语"重组"是指包含通过分子生物学技术连在一起的DNA片段的DNA分子。当使用于蛋白质或多肽时，术语"重组"是指用重组DNA分子表达的蛋白质分子。术语"目的核苷酸序列"是指任何核苷酸序列，具有本领域普通技术的人可以操作该序列产生针对某个原因的期望结果(例如，赋予质量改善)。这样的核苷酸序列包括，但不限于此，结构基因的编码序列(例如，报告基因，筛选标记基因，癌基因，抗药性基因，生长因子等)以及不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列(例如，启动子序列，多腺苷酸化序列，终止序列，增强子序列等)。在此所用，当使用于结构基因时，术语"编码区"是指编码作为mRNA分子翻译结果的新生多肽的氨基酸的核苷酸序列。典型地，编码区的5，端结合了编码起始蛋氨酸的核苷酸三联体"ATG"，3，端结合了终止密码子(例如，TAA，TAG,TGA)。在一些情况下，编码区也可用核苷酸三联体"TTG"启动。在此所用，当使用于多核苷酸时，术语"互补的""互补性"是指依靠碱基配对原则相互联系的多核苷酸。例如，序列5'-AGT-3'互补于序列5，-ACT-3，。互补性可以是"部分互补"，其中只有核酸的一些碱基依据碱基配对原则配对。或者，在核酸间可能存在"完全"或"全部"互补性。核酸链间的互补性程度对核酸链间杂交的效率和强度有显著的影响。这在依赖于核酸间结合的扩增反应和检测方法中具有特殊意义。在此所用，核酸序列的"互补体"是指其核酸表现出与含有所述核酸序列的核酸具有完全互补的核苷酸序列。当使用于核酸时，术语"同源性"是指互补性的程度。存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。"序列同一性"是指两个或更多核酸或蛋白质间的相关性度量，是以关于总对比长度的百分比给出。同一性计算考虑了相同的，并且在其各自较长的序列中处于同一相对位置的核苷酸和氨基酸残基。同一性计算可以用包含于计算机程序中的运算法则进行，例如"GAP"(遗传学计算机集团(GeneticsComputerGroup)，Madison,威斯康星州)和"ALIGN"(DNAStar，Madison，威斯康星州)。部分互补序列是至少部分抑制(或与之竞争)与靶核酸杂交的完全互补序列的序列，使用功能性术语"基本上同源"来定义。完全互补序列与靶序列杂交的抑制可以在低严紧条件下使用杂交分析进行检验(Southern或Northern杂交，溶液杂交和类似方法)。在低严紧条件下，基本同源的序列或探针将会与耙序列完全同源的序列竞争，抑制序列的结合(即，杂交)。这不是说低严紧条件是容许非特异性结合的条件；低严谨条件要求两个序列的相互结合是特异性(即，选择性的)相互作用。不存在非特异性结合可以通过使用甚至缺乏部分互补性(例如，同一性低于30%)的第二个靶序列测试；不存在非特异性结合时，探针将不能与第二个非互补靶序列杂交。当使用于双链核酸序列，例如cDNA或基因组克隆时，术语"基本同源"是指在如下文所述的低严谨条件下，任何可以与双链核酸序列的任一链或两条链杂交的探针。当使用于核酸杂交时，低严紧条件包括等同于当使用约含500个核苷酸长度的探针时，在42t:的溶液中进行结合或杂交的条件。其中溶液的组成为5XSSPE(43.8g/1NaCl，6.9g/1NaH2P04H20和1.85g/1EDTA,用NaOH将pH调至7.4)，0.1%的SDS，5XDenhardt，s试剂[每500毫升含有50XDenhardt，s:5g水溶性聚蔗糖(Type400，Pharmacia)，5g牛血清清蛋白(V级，Sigma)和100g/ml变性鲑精DNA。结合或杂交后用包含5XSSPE，0.1%的SDS的溶液在42。C洗涤。当使用于核酸杂交时，高严紧条件包括等同于当使用约含500个核苷酸长度的探针时，在42t:的溶液中进行结合或杂交的条件。其中溶19液的组成为5XSSPE(43.8g/1NaCl，6.9g/1NaH2P04H20和1.85g/1EDTA，用NaOH将pH调至7.4)，0.5。/o的SDS，5XDenhardt，s试剂和100ug/ml变性鲑精DNA。结合或杂交后用包含0.IXSSPE，1.0%的SDS的溶液在42"C洗涤。当使用于核酸杂交时，本领域技术人员熟知可以使用大量等同条件包括低严紧条件或高严紧条件；诸如探针长度和性质(DNA，RNA，碱基组成)、靶性质(DNA，RNA，碱基组成，在溶液中存在或固定化等)、盐和其他成分(例如，存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)的浓度等因素都应考虑，杂交溶液可以变化产生与上面所列条件不同的低或高严紧条件，但是其作用是等同的。当使用于核酸杂交时，"严紧"一般发生在从约Tm-5°C(低于探针Tm温度5TO到比Tm低20"C-25"C的范围内。正如本
技术领域：
的技术人员所理解的，严紧杂交可以用于区分或检测同一性多核苷酸序列或者区分或检测相似或相关的多核苷酸序列。在"严紧条件"下，目的核酸序列将与其精确互补或密切相关的序列杂交。之所以说多肽分子具有"氨基末端"(N-端)和"羧基末端"(C-端)，是因为肽键发生在第一个氨基酸残基主链氨基基团和第二个氨基酸残基的主链羧基基团之间。典型地说，其新的连接将加到生成多肽链的羧基末端的多肽末端和多肽序列是从氨基末端开始从左到右进行的。在此所用，术语"外源肽"或"外来肽"是指不存在于其自然环境的肽(即，经过了人工修改)。例如，外源肽基因含有插入另一个多肽或加入或融合到一个多肽上的肽。当使用于氨基酸序列或蛋白质时，术语"部分"(如在"氨基酸序列的一部分")是指该蛋白质的片段。该片段的大小范围是从4个氨基酸残基到全部氨基酸序列减去一个氨基酸。在此所用，术语"融合蛋白"是指含有与外源蛋白片段(例如，疏水表位)相连的目的蛋白(例如，病毒外壳蛋白)的嵌合蛋白。当使用于核酸时，如在"分离的核酸序列"中的"分离"是指从通常与其自然来源相关的至少一种含杂质的核酸中鉴定和分离出来的核酸序列。分离核酸是以不同于其自然发现形式或环境中存在的核酸。相反，未分离核酸是指以其自然状态存在的核酸例如DNA和RNA。例如，给定的DNA序列(例如，基因)被发现存在于其邻近基因附近的宿主细胞染色体上；RNA序列，例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列，与编码多数蛋白的数量众多的其它mRNA以混合物的形式存在于细胞中。但是，包含SEQIDN0:X的分离核酸序列包括，例如，在细胞里这类一般含有SEQIDN0:X的核酸序列，其中该核酸序列是在不同于其自然细胞的染色体或染色体外位点，或者另外侧面接有不同于自然发现的核酸序列。分离核酸序列可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸序列用于表达蛋白质时，该核酸序列将最低含有至少一部分正义或编码链(即，核酸序列可以是单链的)。可以选择的是，它可以同时包含正义和反义链(即，核酸可以是双链的)。在此所用，术语"纯化的"是指分子或分子集合体(例如，病毒粒子)，或者是核酸或氨基酸序列，它们是从其自然环境中被取出并分离的。所以，"分离的核酸序列"是纯化的核酸序列。"基本纯化的"分子是指至少含量60%，优选地至少75%，更优选地至少90%不含与其自然相关的其他成分的分子。在此所用，术语"载体"和"运载体"是可互换地使用于将DNA片段从一个细胞转移到另外一个细胞的核酸分子。载体可以包括质粒，噬菌体，病毒，粘粒等。在此所用，术语"表达载体"或"表达盒"是指包含期望的编码序列和在特定宿主生物中表达可操作连接编码序列所必须的适当核酸序列的重组DNA分子。在原核生物中表达的必须核酸序列通常包括启动子，操纵子(选择性的)，和核糖体结合部位，经常还有其他序列。己知真核细胞使用启动子，增强子和终止子和多腺苷酸化信号。术语"靶向载体"或"耙向构建"是指包含任何一侧面都有识别序列的目的基因的寡核苷酸序列，它能同源重组定位于侧面识别序列之间的DNA序列。，在此所用，术语"可操作重组"，"可操作顺序"和"可操作性连接"是指核酸序列的连接方式，其中产生了能介导给定基因转录和/或期望的蛋白质分子合成的核酸分子。本术语也指能使功能蛋白产生的氨基酸序列的连接形式。真核生物的转录控制信号包括"启动子"和"增强子"元件。启动子和增强子包括与参与转录的细胞蛋白特异相互作用的DNA序列的短阵列(Maniatis，等人，科学(Science)，236:1237,1987)。启动子和增强子元件已经从多种来源的真核生物中分离出来，包括酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞的基因。启动子和增强子也已从病毒中分离出来，类似控制元件，例如启动子，也在原核生物中发现。特定启动子和增强子的选择决定于用于相关蛋白表达的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有较广的宿主范围，而其它仅在细胞类型的有限亚型中起作用(参见综述，Voss等人，生物化学进展(TrendsBiochem.Sci.)，11:287,1986;和Maniatis等人，见上1987)。在此所用，术语"启动子元件"，"启动子"或"启动子序列"是指位于DNA聚合体的蛋白质编码区的5，端(即，领先位置)的DNA序列。自然界所知的大多数启动子领先于转录区。启动子象一个开关一样发挥作用，激活基因表达。如果基因受到激活，就说进行转录或参与转录。转录涉及mRNA从该基因中合成。所以，启动子作为一个转录调控元件发挥作用，也提供了基因转录成mRNA的起始位点。启动子可以是组织特异性或细胞特异性的。当用于启动子时，术语"组织特异"是指能介导目的核苷酸序列在特定类型的组织(例如，种子)中的选择性表达的启动子，而相同的目的核苷酸序列在不同的类型的组织(例如，叶子)中却相对不表达。启动子的组织特异性可以通过例如，将报告基因可操作连接到启动子序列上产生报告子构建物，将报告子构建物导入植物基因组以便报告子构建物整合进转基因植物的每一组织，以及在转基因植物的不同组织中检测报告基因的表达(例如，检测由报告基因编码的mRNA、蛋白质、蛋白质的活性)来评价。相对于报告基因在其它组织的的表达水平，在一种或几种组织中检测到较高水平的报告基因的表达则表明启动子针对检测到的表达量较高的组织而言是特异性的。当用于启动子时，术语"细胞类型特异"是指在特定类型的细胞中能介导目的核苷酸序列选择性表达的启动子，而在相同组织的不同类型的细胞中，相同的目的核苷酸序列却相对没有表达。当用于启动子时，术语"细胞类型特异"也是指在某个组织的某一区域中，能促进目的核苷酸序列选择性表达的启动子。细胞类型特异的启动子可以用本
技术领域：
的已知方法加以评估，例如，免疫组织化学染色法。简22单来说，组织切片包埋在石蜡中，石蜡切片与第一抗体反应，该抗体对由目的核苷酸序列编码的多肽产物是特异的，而该核苷酸的表达由该启动子控制。与第一抗体特异的标记的(例如，过氧化物酶结合)第二抗体与切片的组织结合，用显微镜检测特定的结合(例如，用抗生物素/生物素)。启动子可以是组成性的或可调节的。当使用于启动子时，术语"组成性"是指不存在刺激(例如，热休克、化学性、光等)时，能够介导可操作连接的核酸序列转录的启动子。典型地，组成性启动子能在基本上任何细胞和组织中介导转基因表达。代表性的组成性植物启动子包括，但不限于SD花椰菜花叶病毒(CMVSD;见例如，美国专利号5，352，605，在此加入以供参考)、甘露氨酸合酶、章鱼氨酸合酶(ocs)、超级启动子(见例如，W001/14098)和ubi3(见例如Garbarino和Belk卿，植物分子生物学(Plant.Mol.Biol.24:119-127[1994]启动子。这些启动子已用于在转化植物组织中成功介导异源核酸序列的表达。相反，"可调节的"启动子是存在刺激(例如，热休克、化学性、光等)时，能介导可操作连接的核酸序列的转录水平的启动子，该转录水平不同于无剌激下的可操作连接核酸序列的转录水平。在此所用，术语"调控元件"是指控制核酸序列表达的一些方面的遗传元件。例如，启动子是有助于可操作连接编码区的转录起始的调控元件。其他调控元件有拼接信号、多腺苷酸化信号、终止信号等。增强子和/或启动子可以是"内源的"或"外源的"或"异源的"。"内源的"增强子或启动子是与在基因组中给定基因自然连接的增强子或启动子。"外源的"或"异源的"启动子或增强子是用遗传操作方法(即，分子生物学技术)置于某个基因的毗邻部位，以致该基因的转录是由连接的增强子或启动子介导的。例如，可以分离、去除与第一个基因可操作结合的内源启动子，将其置于与第二个基因可操作结合的部位，从而使"异源启动子"与第二个基因可操作性结合。多种结合得以考虑(例如，第一和第二基因可以来自同一物种，或来自不同物种。)在真核宿主细胞中，表达载体上存在"拼接信号"经常导致重组转录的较高表达水平。拼接信号调节内含子从原始RNA转录物上去除，由拼接供体和受体位点组成(Sambrook，等人，分子克隆实验手册(Molecularcloning:alaboratorymanual)，第二版，美国冷泉港实验室出版社，纽约[19S9]，16.7-16.8页)。常用的拼接供体和受体位点是来自猿猴空泡病毒(SV40)的16SRNA的拼接结合。在真核细胞中，重组DNA序列的有效表达需要介导最终转录物有效终止和多腺苷酸化的信号表达。转录终止信号通常发现存在于多腺苷酸化信号的下游，其长度为几百个核苷酸。在此所用，术语"多腺苷酸位点"或"多腺苷酸序列"是指介导新生的RNA转录产物的终止和多腺苷酸化的DNA序列。重组转录产物的有效多腺苷酸化是期望的，因为缺乏多聚腺苷酸尾巴的转录产物则不稳定并且很快降解。在表达载体中使用的多聚腺苷酸信号可以是"异源的"或"内源的"。内源多聚腺苷酸信号是指在基因组中自然存在于给定基因的编码区的3'末端的信号。异源多聚腺苷酸信号是指从一个基因分离的，置于另一个基因的3'端的信号。常用的异源多聚腺苷酸信号是猿猴空泡病毒40(SV40)的多聚腺苷酸信号。SV40的多聚腺苷酸信号包括在一个237bp的BamHI/BclI限制酶切片段，介导终止和多腺苷酸化(Sambrook,见上，16.6-16.7页)。术语被细菌"传染"和"感染"是指靶生物样品(例如，细胞、组织等)与细菌在某种条件下共培养，这样细菌中含有的核酸序列样品导入到一个或多个靶生物样品的细胞中。术i吾"轰击(bombarding)"、"轰击(bombardment)"和"生物学轰击(biolisticbombardment)"是指加速粒子轰击靶生物材料(例如，细胞，组织等)的过程，以便影响靶生物材料细胞的细胞膜损伤和/或使粒子进入靶生物材料。生物(biolistic)轰击的办法在本
技术领域：
是已知的(例如，美国专利号5，584，807，其内容引于此作为参考)，并且是商业上可以获得的(例如，氦气驱动的微弹道加速器(PDS-1000/He,BioRad)。当用于植物组织时，术语"微损伤"是指在该组织中弓I入显微伤害。微损伤可以通过，例如，此处描述的粒子轰击或磨擦组织获得。在此所用，术语"转染"是指将外源DNA导入真核细胞。转染可以用本领域技术人员知道的多种方法实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀物的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、利用1，5二甲基-1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化物的转染、电穿孔法、微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、反转录病毒感染和生物方法(biolistic)。当用于细胞时，术语"转基因"是指包含转基因的细胞，或其基因组已经受到转基因导入的修饰。当用于组织或植物时，术语"转基因"分别指组织和植物，其含有具有转基因的一个或多个细胞，或者由于导入转基因导致其基因组的改变。转基因细胞、组织和植物可以用几种方法产生，包括将含有核酸(通常为DNA)的"转基因"导入靶细胞或使用人工干涉的方法将转基因整合到耙细胞的染色体组中，例如此处所述的方法。术语"外源基因"是指通过实验控制导入细胞的基因组的任何核酸(例如，基因序列)，可以包括该细胞里发现的基因序列，只要导入的基因相对于自然发生的基因存在一些改变(例如，点突变、存在选择性标记基因等)。在此所用，"转化"是指将转基因导入细胞。细胞转化可以是稳定的或是暂时的。术语"暂时转化"或"短暂转化的"是指将一个或多个转基因导入细胞，但是并未整合进宿主细胞基因组中。例如，暂时转化可以用酶联免疫吸附(ELISA)测定法检测，该方法检测一种或多种转基因编码的多肽的存在。可替代地是，暂时转化可以通过检测由转基因编码的蛋白质(例如，3-葡糖苷酸酶)的活性进行。术语"暂时转化体"是指暂时整合进一个或多个转基因的细胞。相反，术语"稳定的转化"或"稳定地转化"是指将一个或多个转基因导入和整合到细胞的基因组中。细胞的稳定转化可以使用能与一个或几个转基因结合的核酸序列对细胞的基因组DNA进行Southern印迹杂交来检测。可选择的，细胞的稳定转化也可以通过细胞基因组DNA的多聚酶链式反应扩增转基因序列检测。术语"稳定转化体"是指已经将一个或多个转基因稳定整合进其基因组DNA的细胞。所以，稳定转化体与暂时转化体的区别在于，来自稳定转化体的基因组DNA含有一个或多个转基因，而来自暂时转化体的基因组函A不含有转基因。A.病毒粒子表达系统为了产生根据本发明所述的修饰的病毒粒子，通过在编码暴露于病毒衣壳的内表面的外壳蛋白部分的病毒基因组所述部位导入编码外源肽(例如，动物病毒抗原)的核苷酸序列来修饰病毒核酸，然后用修饰的病毒核酸感染宿主细胞或生物体，收获修饰病毒的装配粒子。对于DNA病毒，本方法最好通过直接操作病毒的DNA;或者操作与RNA病毒的RNA的相对应的cDNA来实现。相应地，在一些实施例中，本发明提供了编码病毒粒子的载体，该病毒粒子已被修饰以便在病毒衣壳的内表面表达外源肽。在特别优选的实施方案中，编码病毒外壳蛋白的核酸序列通过插入编码外源肽的序列被修饰，以便当病毒外壳蛋白装配进衣壳时，外源蛋白展现在衣壳的内表面。在进一步的实施方案中，编码外源肽的序列是插入病毒外壳蛋白的一部分中，以便病毒外壳蛋白装配进衣壳时不受到实质的干扰或破坏。多种病毒粒子都可用于本本发明。假定DNA病毒和RNA病毒都适合用在此所述的方法修饰。在特别优选的实施方案中，修饰病毒粒子是植物病毒。在进一步优选的实施方案中，植物病毒优选二十面体病毒。迄今为止，所有已经阐明晶体结构的具有二十面体对称的所有植物病毒的特征是存在一个规则的8链桶构型。所以，可能是该构型是所有植物二十面体病毒的共性。因此，优选的二十面体植物病毒可以选自下述病毒家族椰菜花叶病毒属、雀麦花叶病毒病毒属、豇豆花叶病毒属、双粒病毒属、弧肠孤病毒属、分病毒属、sequivididae和番茄丛矮病毒属。和下述病毒属黄属病毒组、玉米雷亚多非纳病毒组、南方菜豆花叶病毒组、芜菁黄花叶病毒组、enamovirus和ideavirus。在特别优选的实施方案中，修饰病毒粒子来自豇豆花叶病毒属家族。豇豆花叶病毒属家族是一组至少14个植物病毒的病毒组，它主要感染豆科植物。它们的基因组由两个单链的不同大小的正义RNA分子构成，它分别包于直径约28nm的等容积的粒子中。以其氯化铯密度剃度离心中的行为结果划分，两种类型的核蛋白体被称为中间成分(M)和底部成分(B)，粒子中的RNA相应称为MRNA和BRNA。两种类型的粒子都有相同的蛋白组分，包括60个拷贝，每个拷贝含有一个大外壳蛋白(VP37;VP-L)和一个小外壳蛋白(VP23;VP-S)。除了核蛋白体粒子，豇豆花叶病毒制备物包含不同量的空衣壳(只有蛋白质)，其被称为顶部(T)成分。在豇豆花叶病毒家族的典型成员中，豇豆花叶病毒属(CPMV)，已知MRNA和BRNA都是多腺苷酸化的，并具有共价连接在其5'末端的小蛋白质(VPg)。对其他豇豆花叶病毒的有限研究暗示这些特征为本组中的認A病毒共有特征。来自CPMV的两种RNA已经测序，表明由3481(M)和5889(B)个核苷酸构成，其中不包括多聚腺苷酸尾巴(vanWezenbeek等人，EMB0J.2:941-46[1983];Lomonossoff和Shanks,EMB0J.2:2253-2258[1983])。两种RNA都含有一个单一的长开放阅读框，通过合成和随后裂解大的前体多肽表达病毒基因产品。虽然两个RNA对于感染整个植物都是必须的，但是较大的BRNA可以独立在原生质体中复制，但在这种情况下，没有病毒粒子产生(Goldbach等人，自然286:297-300[1980])。这些结果和较早的遗传实验已确定外壳蛋白是由MRNA编码的。CPMV的3.5埃电子密度图表明CPMV与T-3植物病毒如豇豆花叶病毒之间有一种清楚的关系，特别是番茄丛矮病(TBSV)和南方菜豆花叶病毒组，尤其是南方菜豆花叶病毒(SBMV)。后者病毒的衣壳由180个相同的外壳蛋白亚单位组成，每个亚单位由一个单一的e-桶结构域构成。它们在病毒粒子中可以占据三种不同的位置，即A、B和C。CPMV的两个外壳蛋白表明它们由3个不同的桶结构域构成，两个来自VP37，一个来自VP23。所以，与T3病毒相同，每个CPMV病毒是由180个桶结构构成的。来自VP23的单一结构域占据了与TBSV和SBMV的A型亚单位相似的位置，而VP37的氨基端和羧基端相应占据了C型和B型亚单位的位置。X射线衍射分析了CPMV晶体和本组的另外一个成员，菜豆荚斑驳病病毒(BPMV)，表明BPMV和CPMV的三维结构是十分相似的，总的来说是豇豆花叶病毒典型。在CPMV和BPMV的结构中，每个桶原则上由不同长度的环连接的8条反向平行的片层构成。平的P-片层命名为B、C、D、E、F、G、H和I片层，连接环被称为PC、PE、3F—PG禾口PH-3I环。豇豆花叶病毒在结构上也与动物小核糖核酸病毒有关。小核糖核酸病毒的衣壳由60个拷贝构成，其中每一个拷贝由三种不同的外壳蛋白VP1、VP2和VP3组成，每个具有一个单一的P-桶结构域。对于豇豆花叶病毒而言，这些外壳蛋白是通过一个前体多蛋白的裂解释放的，并以VP2-VP3-VP1的顺序合成。比较CPMV和小核糖核酸病毒的三维结构可以表明VP37的氨基端结构域和羧基端结构域相应等同于VP2和VP3，而VP23的氨基端结构域和羧基端结构域等同于VP1。结构位置和基因顺序的等同性表明VP37相当于两种小核糖核酸病毒的衣壳蛋白，VP2和VP3的未裂解形式。豇豆花叶病毒和小核糖核酸病毒之间的主要差别之一是豇豆花叶病毒的蛋白亚单位缺乏在小核糖核酸病毒上发现的桶链间的大插入，虽然这些病毒粒子的基本结构是非常相似的。3-折叠间的四个环PC、3D-PE、PG和31)对于保持病毒粒子的结构完整性不是关键的，但是，根据本发明，是外源肽序列的表达位点，例如动物病毒的抗原位点。豇豆花叶病毒的一个优点是衣壳包括60拷贝，每个拷贝含有两个组成性的外壳蛋白，所以允许每个病毒粒子展现某个肽的60-180个拷贝，其中每个外壳蛋白结构域已被操作以致它们表达插入的片段。在豇豆花叶病毒属家族中，优选豇豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒，最优选豇豆花叶病毒CPMV是一种二重基因组RNA病毒，为了便于操作任何RNA病毒来表达外源肽，适宜的是使用该RNA的cDNA克隆。因此，在一些实施方案中，本发明提供了编码一个修饰的病毒粒子的cDNA载体，以便将外源肽表达在病毒衣壳的内表面。CPMV的两个RNA分子的全长cDNA克隆是可以得到的，其可以被操作插入编码外源肽的寡核苷酸序列。在一些特别优选的实施方案中，载体是CP26。在其他实施方案中，载体包括BRNA或MRNA或者BRNA或MRNA的变体或类似物。在一些实施方案中，变体或类似物可以与BRNA或MR織的正链或负链在从高严紧到低严紧的条件下杂交。在特别优选的实施方案中，变体或类似物包括编码外源蛋白的序列。在一些实施方案中，cDNA被用于产生体外转录物，当与植物温育时，转录物具有感染性。相应地，在一些实施方案中，本发明提供了编码修饰病毒粒子的RNA载体，修饰的目的是在病毒衣壳的内表达外源肽。但是，转录物的感染性显著低于自然病毒粒子的RNA，可能在转录产物的末端作为存在非病毒残基的结果。困难也可能来自转录产物暴露于温育中的降解性试剂。对此原因，转录物通常通过给它们的5'端加帽来稳定。仍在更多的优选实施方案中，修饰的病毒粒子也包括展现在病毒衣壳外表面的外源肽。将外源肽展现在病毒衣壳的外表面的方法由美国专利5，874，087和5，958，422提供，每个专利引于此作为参考。在进一步的实施方案中，cDNA直接用于温育植物。在这些实施方案中，编码修饰的病毒粒子的序列可以与在植物组织中表达的启动子可操作连接。在本发明中有用处的启动子包括，但不限于此，花椰菜花叶病毒(CaMVSD，见例如，美国专利5，352,605，在此引入以供参考)、甘露氨酸合酶、章鱼氨酸合酶(ocs)、超级启动子(见例如W095/14098)和ubi3(见例如Garbarino和Belknap，植物分子生物学，24:119-127[1994])启动子。这些技术克服了使用体外转录物所遇到的一些问题，并且适于所有植物RNA病毒。对于DNA病毒，DNA本身被导入植物体。在这种情况下，外源肽最初作为衣壳蛋白的一部分表达，因此是以整个病毒粒子的一部分而生产。所以，肽可以作为打算以此为目的的连接分子而生产。可替代地是，病毒的遗传修饰可以进行设计，以便可以通过使用适当影响病毒粒子裂解的试剂容许释放期望的肽。为了在商业水平上生产修饰的病毒，不必制备用于每批病毒生产的感染性接种物(DNA或RNA转录物)。在一些实施方案中，首次接种可以用于感染植物，获得的修饰的病毒可以在植物体传代，以便产生完整病毒或病毒RNA，用于随后批次的接种物。在一些实施方案中，病毒衣壳不包括核酸。本
技术领域：
已知用于选择性富集和纯化"空"病毒粒子的方法(参见，例如，vanKa,en和deJaeger，豇豆花叶病毒，在植物病毒197的CBI/AAB描述，Co腿onwealthAgriculturalBureax[1978];和W098/56933，的公开在此引入以工参考)。B.外源肽在病毒衣壳内的表达以前描述的病毒表达技术的局限之一是存在带正电荷肽或疏水性肽插入外壳蛋白的表面环之一导致病毒感染性的丧失的事实，可能原因29是扰乱的蛋白折叠，粒子凝聚或扰乱的病毒运输。这些粒子的无生存能力是表达一些表位的巨大障碍。通过表达一些附加酸性氨基酸可以补偿带正电荷的表位(例如，pl麗8、pl醒9;Bendalm-nane等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)290(1):9-20[1999]。但是，在表面表达疏水性残基至今仍十分困难。在病毒表面使用替代性插入位点没有解决这个问题。总的来说，在VP-S的羧基端插入表位给出了相似的特性，该表位也是表达在表面上。本技术的局限使其表达多数T细胞表位存在困难。新的插入位点的发现描述如下。1.插入位点总的来说，外源RNA或DNA可以以多种构型插入植物病毒基因组中。例如，可以作为已有核酸的附加物或已有序列的部分替代物，该项选择极大地由衣壳蛋白的结构和附加或取代的容易程度决定，前提是不干扰遗传修饰的病毒在植物体中的装配能力。对于适用于本发明目的附加或缺失可容许的和最合适大小的确定，可在每一特定状况下，参考现有的公开技术，用实验确定。在一些情况下，附加插入物的用途比取代插入表现出更多的灵活性。本发明证实在病毒外壳蛋白上插入表位以便它们在病毒衣壳的内表面或内侧上表达。总的来说，暴露在装配的病毒衣壳的内表面的病毒外壳蛋白的任何部分都是表位插入的候选位点。在本发明的一些实施方案中，那样的位点是通过病毒衣壳的高分辨结构分析(例如，晶体结构分析)选择的。在本发明的进一步实施方案中，病毒外壳蛋白通过在识别出的位点插入表位。编码修饰病毒的载体(例如，cDNA或RNA载体)然后用于感染合适的宿主(例如，原生质体，植物组织或整个植物)。如果感染发生了(例如，通过在植物中的局部病变的出现分析)，那么这个位点对于表位表达是有用的。在一些情况中，感染病毒连续选择识别出导致更大感染性的突变体，包括能全身感染的病毒粒子(下面将详细讨论)。本发明是以将外源基因插入CMPV的VP-S中为样板的。在一些实施方案中，插入位点在VP-S的氨基端。在进一步的实施方案中，外源基因插入从氨基端算起第5氨基酸和第20氨基酸之间的任何一点，优选地从氨基酸端算起的第7氨基酸和第15氨基酸之间，更优选地从氨基酸端算起的第9氨基酸和第12氨基酸之间。在优选的实施方案中，外源肽的插入不干扰的体内病毒的功能(例如，装配)。根据高分辨结构，氨基端是在病毒粒子的内表面，而不是在外表面。本发明不限定于特定的作用机制。实际上，对作用机制的理解对实施本发明而言不是必须的。而且，作为将表位表达于CMPV的VP-S的氨基端的战略，期望的是将表位插入Y11或V10Y11的重复中。氨基端在病毒的生存周期中起作用，因为它在多肽加工过程中被病毒蛋白酶识别。识别位点的确切大小还不知道，但是根据VP37与MP(运动蛋白)的识别位点类推，识别位点的大小可能是10-11个氨基酸(Verver等人，病毒学242:2-27[1998])。VP-S的前十个氨基酸从VP-S的P-桶中凸出，不与其它任何残基作用。Yll标志着VP-S的氨基端和小外壳蛋白的其余部分的界线，是由Q73、R165和H71形成的疏水口袋。在Y11处插入显然不干扰多蛋白的加工。其它因素也使该处成为期望的位点。CMPV内的RNA分布不清楚。但是，菜豆荚斑驳豇豆花叶病毒的中间成分中，一些RNA是在晶体结构中。主要的RNA-蛋白质相互作用发生在VP37的氨基端。对CMPV而言，这种情况同样发生。CMPV的冷冻电子显微技术照片显示在其五片层几何轴上可能存在一个小的空间，正好在蛋白质壳的下面。而且，VP-S的氨基端包含两个带负电的残基，使其与RNA的糖-磷酸主链的相互作用也不可能。所以，VP-S的氨基端的插入不可能干扰与RNA的相互作用，并且存在容纳外源肽的空间。可替代的是，VP-S的氨基端可能结构完好，在病毒粒子中与VP23分子相关的五个几何终点形成一个环面(Lin等人，病毒学杂志(JournalVirology)74(1):493-504[1999])。B因子表明第卜9个氨基酸是柔性的。这个区域的插入将可能导致破坏环面，但将不可能影响桶折叠。肽扫描实验表明CMPV和许多其它二十面体植物病毒的VP-S的氨基端展现最强的B细胞表位之一具有相关性。这与该结构域通过装配病毒粒子，例如CVP，的能动行为(即，呼吸)短暂暴露的观念一致。相应地，在一些实施方案中，本发明提供了具有在Y11位点插入外源肽的修饰的CPMV。仍在进一步的实施方案中，外源肽是插入VP-S的Yll的重复体之间。在其他的实施方案中，本发明提供了具有在VP-S的V10Y11的重复体之间插入外源肽的修饰的CPMV。本发明不限定于任何一种特定的作用机制。实际上，对作用机制的理解对于本发明的实施并非必须。但是，推测外源肽的侧面具有Y11或V10Y11的重复体保护了Yll的疏水性环境。Yll的重复体代表病毒载体的基因工程的诱发变异，这可以有助于在CPMV的衣壳中容纳外源肽。总地来说，由于许多观察到的发生于粒子上、将肽展示在粒子外表的全程变异已经限制在外源肽本身，CPMV的氨基酸序列的其它变化证实设计困难。几种表位已被成功地插入Y11位置，表现出在豇豆植物上的很好的感染能力。一些构建体具有V10Y11的重复体，在两种情况下(pNLAL7/pMAL8和pMV14/pMV15)，已证实有利于避免表位的变异或使构建具有感染性。在一种构建(pTr4)中，只有V10是重复的(因为表位开始、终止于缬氨酸)并且在这种情况下，构建是感染性的。这些结果使在新的构建体中重复至少VIO，如果可能的话V10Y11是可取的在新的构建体中。2.肽根据本发明可以整合进植物病毒的外源肽可以是高度多样性的，仅仅受制于外源肽性质和大小，其在病毒粒子上或内的插入位点不干扰修饰病毒在体外和体内培养时的装配能力。广义概念而言，修饰病毒可以从任何生物学上有用的肽(通常是多肽)形成，其功能发挥需要特定构型才具有活性。这可以通过将肽与较大的分子结合(例如，提高其稳定性)或在特定生物系统上的提呈模式来获得。这种肽的实例是肽激素；酶；生长因子；原生动物、病毒、细菌真菌来源的抗原；抗体包括抗独特型抗体；免疫调节剂和细胞因子(例如，干扰素和白细胞介素)；受体；粘附素；肽的任何一种前述类型的部分或前体。该肽优选地包含5个以上的氨基酸。本发明允许将多种外源肽表达在病毒衣壳的内表面上。在一些实施方案中，肽是从5到20氨基酸，优选是从7到15个氨基酸，最优选是从8到12个氨基酸。但是，可以推测外源肽大小的限制仅受嵌合病毒容纳外源肽和在植物体内仍具有装配进感染病毒的能力的限制。在优选的实施方案中，外源肽具有免疫学特性。相应地，在一些实施方案中，外源肽是抗原或免疫原。成功插入的表位实例在下表1中予以提供。在一些实施方案中，表位是B细胞表位。在其他实施方案中，表位是T细胞表位。在一些优选实施方案中，外源肽是细胞毒性T淋巴细胞表位，与细胞毒性T淋巴细胞反应。总地来说，T细胞表位是疏水性的。在一些实施方案中，表位具有大于7.0的等电点(pl)(例如，pHBV16、pLCMV2和PVSVI)，是疏水性的或包含长的疏水性的伸长片段(例如，pLCMV2和pHBV16)。这些表位中的一些以前已经插入到VP-S的环中，产生良好的(短HBV表位)，中等的(LCMV表位)和无(2F10肽)症状。在一些优选实施方案中，肽相当于序列号4-17。在其他实施方案中，肽是由相当于序列号18-31的核酸序列编码。表1氨基端插入物的总结构建vp-s的氨基端插入氨基酸序列插入核酸序列paCPMV序列号1GPVCAEASDV序列号31YSPCMIASTPHBV15序列号2GPVCAEASDVY序列号4GYHGSSL序列号18ggttatcatggttctagtttg序列号31YSPCMIASTI3,16序列号2GPVCAEASDVY序列号5AVYYCTRGYHGSSL序列号19gctgtttattattgtactagaggttatcatggttctagtttg序列号31YSPCMIASTPLCMV2序列号2GPVCAEASDVY序列号6RPQASG環GNLTAQ序列号20agacctcaagcttctggtgtttatatgggtaatttgactgctc幼序列号31YSPCMIAST醒L7序列号2GPVCAEASDVY序列号7SYIPSAgKI序列号8SYIPSAGKI序列号21tcttEitattccttctgctgaasiagstt序列号31YSPCMIAST腿L8序列号2GPVCAEASDVY序列号7SYIPSAEKI序列号21tcttatattccttctgctgaaaagatt序列号32VYSPCMIAST醒L10序列号2GPVCAEASDVY序列号7SYIPSAEKI序列号21tcttatattccttctgctgaaaagatt序列号32VYSPCMIAST醒L11序列号2序列号9序列号22序列号3233<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>使用VP-S的氨基端的插入位点相对于以前使用的插入位点而言具有明显的优点，表现在可能表达疏水性或碱性表位。这开创了在CPMV上表达外源表位的可能性上的一个全新领域。由于新插入位点存在于病毒粒子的内面，对插入表位的强免疫反应不可能。但是，许多植物病毒的内藏的氨基端证实是居于病毒的最强免疫原性部分之中。对这一现象的最可能解释是粒子的主动行为(呼吸)。由于这一原因，B细胞对BBV16中的2F10表位的反应受到测试。缺如任何一种a-2F10抗体清楚表明本构建中的表位是内藏的。3.第二位点变异令人惊奇地是，已经发现在其VP-S的氨基端的包含外源肽的嵌合病毒粒子(即，内展示粒子)特别易于在植物体上选择性影响除了插入位点本身而外的其他位点的外壳蛋白序列的变异。再次变异具有下述特征新的变异是自发发生，在宿主植物体内进行选择；大部分的变异发生在外源肽插入位点的远端和近端部位。有趣的是，许多变异影响了位于被认为涉及衣壳亚单位之间的蛋白-蛋白相互作用的结构域中的外壳蛋白的氨基酸序列的变化。通过用新的包含了内部化的表位的嵌合病毒粒子构建感染宿主植物体，可能选择和分离除了插入物中的氨基酸以外的氨基酸发生变化的新病毒粒子。而且，在给定外壳蛋白的给定位置不依赖于时间独立地发生，从而再次导致正好在组成衣壳的蛋白的同一位置分别地诱导和选择变异。并且，给定氨基酸残基可以变成不同的氨基酸(即，非保守性变化)的事实暗示从结构中去除原始氨基酸产生的限制比建立特定的氨基酸替代更重要。并且，氨基酸替代自然限定于密码子的非摆动区的(单点)点突变产生的变异体。所以，提供了区分CPMV的衣壳中的位置的方法，允许选择补偿突变("热点")。该方法独立于此种衣壳中的内部化表达肽和其精确插入位点。更引人注目的是，通过用内部表达外源肽嵌合体感染宿主植物，CPMV的外壳蛋白的第二、第三或更多位点变异可以予以选择。当所述的第三位点和更多位点变异发生时，新嵌合病毒的感染性和增殖性超过了只有一个再次变异(只有第二变异)的其对应体的感染性和增殖性。并且，修饰病毒的基因组用于展现另外的肽时，病毒粒子的感染性和增殖性都大于野生型病毒表达同一肽的情况。所以，本发明提供了产生在植物体上比同源的野生型CPMV载体具有更高的增殖性的改良病毒载体的方法。相应地，在一些实施方案中，本发明也提供了包含第二位点和第三位点变异的载体，该载体增强了包含表位插入点的病毒粒子的感染性，并且提供了选择这种突变的方法。在一些实施方案中，变异是在VP-S中，而在其他的实施方案中，变异是在VP-L中。七种第二位点变异和两种第三位点突变在下表2中予以说明。相应地，本发明也提供了包含多种变异病毒载体的载体库，可以选择用于表位表达。对这些突变的详细的选择和区分方法提供在实施例12中。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>本发明不限定于特定的作用机制。实际上，对发明机制的理解对于使用本发明是不必要的。不过，多数的突变氨基酸可能涉及分子内部蛋白-蛋白相互作用。Phe91位于两个相邻的VP23分子的界面上。F91S突变无疑削弱了这种作用。Phel80位于VP23和VP37分子的界面上，并且与Phe2045和Ala2047作用。F180L突变抑制这种相互作用。Metl77与VP37的羧基端的Arg97的侧链具有疏水性的相互作用。M177V和M177T突变都可以使这种相互作用不可能发生。Arg2102可能在空间位置上与相邻的VP37分子的氨基端靠近。存在与E2121的分子间的相互作用，但是当R2102K的突变发生时，该作用就不可能了。但是，一些突变残基内藏于外壳蛋白之一中，结构后果更难预测。对至少一些这种突变的一种可能的解释是对降低了粒子稳定性而言，需要这种突变确保有效的病毒脱壳作用。由于VP-S的氨基端形成了环状面，插入的表位可以与另一个表位作用，稳定病毒粒子。似乎是一些表位比其他的表位在此方面具有更强的趋势。所以，第二位点突变具有明确的用途。在本发明的一些实施方案中，突变可用于就其本身而言不具有感染性的构建中(例如，pSEN2，参考上面的表2)。推测认为这增加了新插入位点说明书第33/66页的应用可能性的范围。相应地，一种有用的方法是用所有已经观察到的第二位点和第三位点突变产生载体库，新的表位可在其中克隆。然后，在一些实施方案中，对最可行的载体的选择可在植物体上实现。4.与外部表位的联合表达本发明也包括在病毒衣壳的内部和外部都表达表位的病毒粒子和编码这种病毒的载体。这些病毒粒子被称为双展示嵌合病毒粒子(ADCVP)。本发明不限制于任何一种特定的作用机制。实际上，对机制的理解对本发明的实施不是必要的。不过，推想在病毒粒子上的T细胞和B细胞表位共同表达可以导致对B细胞表位的免疫反应的增强。相应地，在一些实施方案中，本发明包含在病毒衣壳的外部表达B细胞表位和在病毒衣壳的内部表达T细胞表位的病毒粒子(或者编码病毒粒子的载体)。在一些优选的实施方案中，病毒粒子是CMPV，并且T细胞表位插入到VP-S的氨基端。仍在更进一步的实施方案，T细胞表位是插入Yll或V10Y11的重复体之间，并且B细胞表位是插入VP-S的eBPC环、PB，PC，，环或羧基端或者VP-L的PEPA环。ADVCP的实施例提供在实施例7中。C.修饰病毒粒子的用途本发明中的载体和病毒粒子具有许多用途。在一些实施方案中，病毒粒子用于在动物体内诱导免疫源性或抗原性反应。所以，病毒粒子在保护动物，包括人，抵抗由病原引起的疾病中有用处。在其他实施方案中，发现粒子可用作肿瘤疫苗。在进一步的实施方案中，病毒粒子用于制作疫苗组合物。在优选的实施方案中，疫苗组合物包括修饰病毒粒子和佐剂(例如，QS-21)。然后将疫苗如同本
技术领域：
所知那样施用于动物。实施例下述的实施例用于说明本发明的某些优选的实施方案和情况，不能理解为限制本发明的范围。在下面的公开中，使用了下述的缩写M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)；uM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；咖ol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；Ug(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml(毫升)；37ul(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；um(微米)；nm(纳米)；°C(摄氏温度)；cDNA(DNA拷贝或互补DNA);DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA);dsDNA(双链DNA);dNTP(脱氧核苷三磷酸)；CPMV(豇豆花叶病毒)ADVCP(双展示嵌合病毒粒子)；CTL(细胞毒性T淋巴细胞)；CVP(嵌合病毒粒子)；ELISA(酶联免疫吸附测定)；MP(运动蛋白)；VLP(类病毒粒子)；VP-L(大病毒蛋白[37kDa外壳蛋白]);VP-S(小病毒蛋白[23kDa外壳蛋白])。下述的所有实验中使用的载体是pCP26。该载体是衍生自描述于(Dalsgaard等人，Nat.Biotech.15，248-252[1997])中的pCP7，其构成为可购买到的载体BluescriptpBSSK+(Stmtagene，CA)，其已经克隆进一个盒式结构，该盒式结构包括连到一个相对于感染性CPMV的RNA2的cDNA分子上的来自CAMV35S的组成性启动子，该cDNA中编码氨基端的24个氨基酸的核苷酸已被删除，并且引入产生尸WI限制性内切酶位点的突变nt3295(T—A)。在载体的主链序列中，设计了下面的点突变以便产生新的限制性内切酶位点^co47in(在nt960位发生T—C)和&7I(在ntl005位发生T—C)。在&7I和I之间的多位点连接序列已被删除。由于在本构建体中，多位点连接序列的大部分已经去除，所以，靠近顺el位点的单一&o01091限制酶切位点用于在VP-S的PBPC-环中的插入位点。这一点显示在图1中，该图表明在CPMV的VP-S的Tyrll的重复体中插入表位的克隆战略。这两个限制位点用于插入编码多种表位的寡核苷酸。除非有其他的申明，在下面所述的实施例中，用编码嵌合病毒粒子的cDNA接种宿主植物的过程是基本上按照(Daisgaard等人，JLZ:，禾口Dessens&Lomonossoff，基因病毒学杂志(J.Gen.Virol.)74，889_892[1993])概要描述的方法进行。为了在CPMV的VP-S上同时结合表达氨基端+表面表位，每个在不同插入位点编码一个表位的两种质粒用I和5s闭I消化，导致产生1.3kb和5kb的片段。较小片段包括编码VP-S的氨基端的序列，较大片段包括编码VP-S的eBPC环、PB'PC''环或羧基端的序列。通过纯化包括插入表位的片段并使用标准分子生物学技术将它们连接起来可以获得包括多个表位的构建(Sambrook，J.，Fritsch,E.F.&Matiatis，T.分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社[1989])。实施例1本实施例说明在病毒衣壳的内表面上肽的表达。尤其是，来自乙肝病毒表面抗原的a组决定簇的模拟位的肽被插入到CPMV的VP-S中。来自针对乙肝病毒表面抗原(HbsAg)的抗独特型单克隆抗体的序列，AVYYCTRGYHGSSLY(SEQIDN0:33)，和来自同一序列(GYHGSSLY;SEQIDN0:34)的高度疏水性的的八聚体被报道在发动用乙肝病毒表面抗原本身的一个"a"组决定簇产生的同类免疫反应上是有效的(例如参见，美国专利5,531,990:5，744，135和5,856,087，在此引述它们作为参考)。相同的肽产生乙肝病毒特异性T辅助细胞反应。所以，称为2F10及其衍生物是a组决定簇的模拟位。来自2F10的十五聚体和八聚体可以表达在CPMV粒子的外表面。八聚体表达于VP-S的PBeC-环和VP-L的,A-环中(Brennan等人，微生物学145:211-220[1991])，产生的嵌合粒子依次称为，HBV7和HBV14。在接种时，该嵌合粒子都具有在豇豆植物中启动感染的能力。十五聚体可被不同地表达在VP-S的PBeC-环中，以便产生已知的构建HBV2;在VP-S的羧基端，以便产生HBV8;以及在VP-L的PEPA-环中(HBV3)。对这三种构建，症状限制在接种的叶子中，即使将纯化病毒传代到其他植物。换句话来说，在具有启动生活感染周期的群体内，嵌合病毒对植物没有选择性。为克服技术限制，两种肽都作为在VP-S的氨基端的独特插入物进行表达。八聚体(HBV15)和十五聚体(HBV16)是插入到Tyr11和Ser12之间。因为氨基端牵扯在病毒多蛋白蛋白水解酶的结合作用中，据认为至少需要十个氨基端的氨基酸，所以选择了该位置。因此，将外源肽插入VP-S的氨基端的期望结果是避免去除蛋白酶的结合作用，以便执行它的功能。假定天然氨基端结构域在第11位存在酪氨酸残基，似乎重要的是在相邻的氨基酸模体中保持这种残基的存在。由于这些肽本身是以酪氨酸残基终止，所以在这种情况下对于内部表达它们而言，Tyrll的重复体是不必要的(也参见下面的实施例2)。在所有用cDNA接种的植物体上，HBV15在宿主植物上产生的症状不能与野生型CPMV感染产生的症状区分开来。按照Daisgaard等人，JLZ:，的CPMV标准纯化方法纯化62g的叶子所得的粒子产量是64.5mg。用cDNA接种，HBV16在5个植物中的3个上产生症状。但是，在用首次感染周期纯化而来的病毒对植物的随后接种中，观察到与野生型感染相当的症状。按照CPMV标准纯化方法(如上所述)，从这些植物纯化病毒的产量是23g获得13mg(0.57mg/g植物材料)。两种病毒都在15%变性聚丙烯酰胺凝胶上分析。小外壳蛋白不表现出如同有时展示在CPMV的表面环中的内部肽的裂解现象。实施例2本实施例说明对应于来自Plasmodiumberghei的环子孢子蛋白的CTL-表位(MAL7)的疏水性肽的表达和内部展示。P.berghei是人类疟疾的一种单细胞原生动物致病原因。相对于来自环子孢子蛋白的一个表位的肽，具有SYIPSAEKI的氨基酸序列，可以在VP-S的PBPC-环中表达(产生称为Mal4的嵌合病毒粒子)，和在VP-S的羧基端的两个不同位点表达(依次产生Mal5和Mal6)。相同的肽可以表达在VP-S的氨基端，位于蛋白(Tyrll;参考实施例1)中的第11位点的酪氨酸残基的重复体之间。该构建被称为MAL7。在将编码修饰的CPMVMAL7的cDNA接种到宿主豇豆植物的叶子之后的起始阶段，构建体不产生全身症状。但是，21天后，五株植物的两株的初生叶上出现了清晰可见的局部病变，表明通过接种的嵌合病毒粒子介导的感染已被建立。从这些局部病变纯化的病毒直接转移到两组年轻的豇豆植物上，每组三株。局部病变五天里可以看到，一周里随后的全身症状出现了。这种明显改善的存活能力似乎表明从其基因组发生全程突变的群体中筛选病毒。在第二次接种两组豇豆植物8天后，从纯化的病毒中分离RNA，进行反转录-PCR，并且对所得的cDNA测序。分析结果表明存在一个点突变，这种情况在两组植物中独立发生，在每种情形中通过对反转录-PCR反应产生的cDNA的正负链的测序予以证实。但是，逆转现象在分离的病毒中并非100%，因为在此位点，在来自每种分离物的自动测序器的色谱中，观察到两种核苷酸的混合物。但是，明显地，在每种情况下，核苷酸的序列中的一个腺嘌呤变成了鸟嘌呤，导致在氨基酸水平上肽中的Glu变成Gly的突变。在接种3周后，分析植物的顶部叶片，病毒基因组的混合物仍然存在，但是通过分析色谱图判断突变的基因组存在量明显大于原始序列。这表明突变的VL-P在宿主体内启动和进行病毒的全身传播的能力上比未突变的嵌合病毒具有竞争优势。由于肽的突变序列，本构建不能用于有关表位的免疫分析。但是，它例示了肽系统内部化的两个要素。首先，证实在CPMV的基因组的天然序列中酪氨酸残基的重复体之间插入外源肽的使用。在一些情况下，这对于保持病毒多蛋白蛋白酶的推定结合位点是必须的。第二，证实了体内选择改变的嵌合病毒粒子的能力，该病毒粒子的特性使它们能在豇豆植物体内感染和全身传播。在特定情况下，重组病毒基因组的改变直接影响了插入的外源肽本身。突变影响在CPMV的外部展示的肽可在植物体内的选择压力增加的实例中看到，因为肽具有的使总的衣壳蛋白壳的pl(参看定义部分)不平衡的电荷性质。这里所述的结果并非预期结果，因为存在于内部化肽的推理是一旦肽分布于病毒粒子的内部，讨论的肽本身的表面电荷将不是一种限制因素。下面的实施例发现了在CPMV嵌合粒子内内部化肽的完整非预期序列。实施例3本实施例表明在嵌合病毒基因组中的全程突变的体内产生和随后的分离，这给在内部表达MAL7肽的CVP的感染进程和全身扩散中的同源野生型嵌合病毒基因组赋予了选择性优势。另人惊奇的是，在(上面的)实施例2中描述的突变嵌合体，在重组病毒启动和进行一个"自然的"感染周期上，包括在宿主植物体内的全身性传播，是可行的。但是，在期望通过选择压力消除任何结构限制的努力中，可以导致在上面所述的MAL7中报道的突变中的插入位点得以改变。检査晶体结构的温度因素，发现VallO是处于一种相对刚性的构型中，而残基A印9则是非常柔韧的。这意味着可能重复VallOTyrll,以便在保留蛋白酶的结合位点的同时，将MAL7肽内的潜在去稳定性的带电残基转移到VP-S氨基端中相对于原始的VallOTyrll朝向有更多羧基端的位置。所产生的嵌合体称为MAL8。在一项单独的研究中，MAL8构建用于感染宿主豇豆植物。首次感染的概况如同实施例2中的MAL7—样。详细而言，用编码MAL8的cDNA接种的五株植物在21天后，有一株表现出一个局部病变，这就表明存在没有明显全身传播病毒的局部感染。从局部病变纯化的病毒用于接种新鲜豇豆植物。5天后，在植物体全身性传播嵌合病毒的症状检测到了。这是感染性提高的标志，最可能是病毒基因组突变的后果。从第二轮用MAL8感染的感染物中分离的病毒的基因组用反转录-PCR译成的cDNA，沿着两条链测定编码VP-S的基因序列。在核苷酸位点2931处的一种全程突变得以检测，将胸腺嘧啶变成了胞嘧啶残基，所以，产生了第191位苯丙氨酸变成丝氨酸的氨基酸变化。这种非保守改变是发生在小外壳蛋白，VP-S的一个位点，该位点是位于病毒粒子的相邻VP-S蛋白之间的界面上。这种突变明显允许内部表达了肽的嵌合CPMV粒子的体内装配和全身性的扩散。这些数据表明使用内部表达同样肽的嵌合病毒粒子可以筛选不同的全程突变，该全程突变可以允许在植物体内装配的嵌合病毒粒子具备内部表达外源肽和启动对豇豆植物的感染和在其体内进行全身传播。这进一步证实在病毒粒子内的突变定位和推想由插入肽产生的结构限制驱动的突变定位在一定程度上依赖于所用的精确插入位点，而不仅仅依赖于肽本身。实施例4本实施例表明在嵌合病毒基因组中的全程突变的体内产生和随后选择，其在感染进程和全身扩散内部表达肽的嵌合病毒粒子方面，具有的选择优势大于相同的野生型嵌合病毒基因组。为了排除实施例2和3所述的现象被限制于内部表达疙疾肽的嵌合病毒的可能性，接着使用一种方法选择其中推想发生了第二位点突变的内部表达肽的嵌合病毒粒子。允许生活力(意思是在植物体装配进入重组病毒粒子)，感染性，全身传播或增殖力提高的突变可以按照如下所述的方法筛选。为了说明本方法，富集和筛选方法参考一种肽进行描述，该肽是APGNYPAL，是指一种来自Sendai病毒的核蛋白体的一种CTL表位。简单地说，cDNA被基因工程去编码一种嵌合病毒粒子，其中肽(APGNYPAL，SEQIDNO:10)插入到酪氨酸残之间，依次是曾经插入到CPMV的VP-S中的肽的氨基端第11位和羧基端的第20位。第20位的酪氨酸代表天然的VP-S的第11位酪氨酸的重复体，被用于保持推想的多蛋白蛋白酶的结合位点(如前所述)。所得构建称为pSEN1。在用SEN1接种宿主豇豆植物后，病毒感染症状慢慢表现出来。在18天后，五株接种的植物中只有一株出现可见的全身感染。其它四株的症状限于接种叶片的局部病变。从感染限定于叶片局部病变的所有四株植物体分离病毒粒子，分离自一个单一的病变。分离到植物体外的病毒基因组RNA用反转录-PCR反转录。随后对所产生的cDNA两条链进行测序表明分离自所有四株植物的病毒基因组包含未经变化的序列。再过7天后(感染25天后)，接种的5株植物中有3株观察到全身症状。从发生全身症状的叶子上纯化病毒，将其基因组RNA反转录。所得cDNA的序列分析表明在核苷酸3199处发生了一个全程突变，将鸟嘌呤变成了野生型的胸腺嘧啶。结果，亮氨酸残基掺入小外壳蛋白(VP-S)的180位，取代了苯丙氨酸。这种突变的基因组序列与使用内部表达来自Sendai病毒的肽的嵌合病毒粒子对豇豆植物的成功感染有关。这将植物病毒-宿主相互作用的广大用途例示作为一种富集和选择编码具有容纳表达于衣壳内部的外源肽的能力的嵌合病毒粒子的新的CPMV基因组的动态方法。与实施例2和实施例3放在一起，本实施例说明体内选择过程可以起作用，并用于内部表达了多种不同肽的嵌合病毒粒子；因此允许较好感染性和嵌合病毒粒子全身传播的突变可以在CPMV的小外壳蛋白的许多不同位点发生。实施例5本实施例说明内部表达来自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的CTL表位。上面概述的实施例说明具有对在嵌合病毒粒子外部表达不利的生理-化学特性的肽可以内部表达。但是，可能的是对于可以插入并在CPMV病毒粒子的内部表达的肽存在大小限制。所以，适合于内部表达的外源肽在长度上不可能大于20个残基(虽然实验式实验可以发现更长的具有内部分布能力的肽并不是不可能的)。在这个尺寸范围的肽的一类是所谓的细胞毒性T细胞淋巴细胞(CTL)表位。重要的是，CTL表位，除了在长度上为6-9个残基，是构型独立的。实际上，存在有力的证据表明CTL表位以线形表位发挥作用。所以，这种表位应该高度适合于内部插入嵌合病毒粒子中。在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒发现了一种此种表位(RPQASGVYMGNLTAQ;SEQIDN0:6)。当展示在嵌合病毒粒子的外部时，该序列由于它的高的正电荷产生了一些问题。所以，三个多余的氨基酸(谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸)被加到其氨基端，以便努力产生一种当其在嵌合病毒粒子的外部表达时，具有较中性表面的肽。由于嵌合病毒粒子的内在的不稳定性，所以用这种特定构建感染宿主豇豆植物所产生的症状是可变的，并是不可预测的。并且，外部展现的表位存在严重的裂解，在老鼠中，不能测量到与这种嵌合病毒粒子的T细胞特异反应。为了证实CTL表位构成了能在CVPS内部表达的外源肽中的重要一类，编码这种淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的已知CTL表位(RPQASGVYMGNLTAQ;SEQIDN0:6)的DNA被插入到VP-S的氨基端中。同样的表位(没有附加的氨基酸Glu，Gly和Ala)被插入VP-S的氨基端，插入位置位于Tyrll和紧接于被称为LCMV2的构建中的小外壳蛋白中的外源蛋白下游的重复酪氨酸残基之间的一个位置。DNA接种导致5个被接种植物中有3个表现病毒症状。RT-PCR分析和随后对产物cDNA的测序证实嵌合构建的序列未变，并与接种进植物体的一致。病毒产量是从29g叶子制备25mg病毒。用15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实正如对内部化的肽所期望的那样，LCMV肽上没有裂解。所以，这说明代表表位中的一类大而免疫上重要的类型的肽，细胞毒性T淋巴细胞表位(CTL)，可以在嵌合病毒粒子的内部表达。而且，同样的特定肽进一步证实在嵌合病毒粒子上实现带正电肽的内部化表达代表解决具有这种性质的肽外部表达的嵌合病毒粒子的潜在的不稳定性和行为上的不可预测性的技术方案。而且，这表明长度是15个氨基酸残基的肽可以成功地容纳在嵌合病毒粒子的内部，而不需要第二个位点的突变。实施例6本实施例说明内部表达在嵌合病毒粒子上的CTL表位的免疫效率。嵌合病毒粒子构建如上所述，LCMV2，在粒子的内部表达了一个淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的CTL表位，被用于免疫老鼠。在0天和第14天，用200ug进行皮下注射，包含或不包含佐剂，QS-21。作为对照，野生型的CPMV也接种到实验动物中，包含或不包含佐剂，QS-21。在第42天，取出脾脏；8天后进行CTL分析(参考免疫学最新方法，第一巻，第3.11.4部分及其后)。用QS-21中的LCMV2感染老鼠，从中纯化细胞毒性T细胞，促进高达46%的靶细胞裂解(图2)。在缺乏佐剂的情况下，没有看到对LCMV2的CTL反应。在用野生型CPMV接种的老鼠中，有或没有佐剂，没有观察到特异性的CTL反应。除了CTL反应，从纯化自注射了LCMV2的老鼠脾脏的细胞中，观察到非常强的表位特异性T-辅助细胞反应。从LCMV2构建的免疫性能，可以清楚的知道具有在粒子的内面展示肽的CVPC可以诱导针对特定肽的CTL反应和强的肽-特异性T-辅助细胞反应。但是，用MAL8、VSV1或SEN1免疫的老鼠中，没观察到CTL反应。这在抗原提呈细胞中的表位加工中存在困难。实施例7本实施例说明双展示嵌合病毒粒子(ADCVPs)的合成，它是在一个病毒粒子上同时在外部和内部表达表位的单一嵌合病毒粒子。在稳定的嵌合病毒粒子的内部表达肽的能力和在稳定的嵌合病毒粒子的外部表达较大的肽的能力(分别地)一起提出了在一个粒子上表达至少两个同时展现的肽一个在内部，另外一个在外部。特别是，内部存在T辅助细胞表位可以加强在同一个病毒粒子的外部共同表达的其它表位的免疫反应。为了检验这种认识，使用了主要在实体瘤细胞上发现的与多态上皮细胞粘蛋白的变体形式有关的表位(GVSTAPDTRPAPGSTA;SEQIDN0:35)。嵌合病毒粒子中该表位的免疫概况已被很好的总结了其特征。在动物模型中有反应的肽的联合体通过对CPMV基因组的分子遗传操作插入到选定的位点。迄今为止，已经建立了作为VP-S中可行插入点的三个外部位点以便用于在嵌合病毒粒子的外部展示肽PB3C环、PC''环和羧基端;而嵌合病毒粒子的第四个外部插入位点是呈现在VP-L的3EPA环中。为了检验内部结合表位和与外部表达在单个的嵌合病毒粒子上的表位的有效性，联合体制备总结在下表3中。表3在CVP的内部和外部都同时有肽分布的双展示构建体<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>下述的构建诱导了好的症状(参考前边)MUC39、HCG16、MUC41、MUC42和MUC47。这些结果表明在VP-S的PBPC环或PB，PC，，环中插入物可以与VP-S的氨基端的小(8个氨基酸)的插入物最有效结合，该小插入物在范围如上说明的适合于内部嵌合病毒粒子的插入物大小。但是，在已经建立的插入物大小的范围内，VP-S的羧基端的插入物明显不如氨基端的插入物大小敏感。实施例8本实施例说明双嵌合病毒粒子在诱导特定的T-辅助细胞反应上的免疫效率。一个在氨基端的T细胞辅助表位在免疫反应上对一个插入其它地方的B细胞表位的刺激效应可以通过免疫比较加以研究，比较对象是外部表达内部表达相同的T辅助细胞表位的两种不同的双展示粒子的T辅助细胞表位的嵌合病毒粒子与不同的B细胞表位的结合。HBV15是在内部位点表达来自2F10肽的八聚体的嵌合病毒粒子(参看上面的实施例l);MUC39内部表达了与实体瘤相关的来自人变体粘蛋白的肽一起表达的八聚体，固Clp(MUC14)外部表达在PB3C环中；而MUC42同时在VP-S的羧基端内部表达了相同的2F10模拟位和外部表达了衍生自MUClp的肽(MUCL)(参看前述的实施例7)。在0天和第21天，用5pg置于QS-21中的HBV15、MUC39或MUC42在QS-21存在的情况下免疫三组老鼠，每组5只。在第21天，28天和42天收集血清，并用ELISA检测同时具有2F10和MUCI特异性的抗体。对粘蛋白肽的特异抗体的滴定平均值总结于表4中。表4对不同嵌合病毒粒子的MUClp肽特异性滴定<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在每个时间点，用CPMV-MUC39免疫的老鼠产生的抗-MUC抗体滴定值(约高一个稀释度)高于用CPMV-MUC14免疫老鼠的滴定值，这揭示出T-辅助细胞表位可能存在对抗-MUCB细胞反应的刺激效应。对于用CPMV-MUC42免疫的老鼠而言，五个中的一个产生了MUClp特异性的抗体而当2F10不与T-辅助细胞表位共表达时，没有老鼠产生MUC1特异性抗体。在第28天，反应是中等程度的；到第42天，滴度下降了。所以，T-辅助细胞表位，在2F10的存在的情况下，可以强化对B细胞表位的反应，例示在Muclp肽中。当检测2F10特异性的T细胞反应(表5)时，将用CPMV-MUC39免疫的老鼠所得的脾脏细胞进行增殖以便与2F10肽反应。与由MUC42构建所诱导的Muclp肽特异性抗体相对较低水平一致，在本项分析中，2F10肽对特定细胞毒性T细胞的增殖没有明显的剌激效应。表5T细胞的增殖指数<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>这些数据表明用CTL表位对免疫反应的共刺激作用可以用于启动对共存在的、但是不相关的肽的增强反应。实施例9本实施例说明通过在插入肽位点以外的其它位点筛选进一步的再次突变表达和内部化强有力的通用T-辅助细胞表位。从破伤风类毒素(■ALINSTKIYSYFPSV;SEQIDNO:15)衍生而来的T-辅助表位已知与多种生物体中和相应广大的单模标本范围内具有一种强有力免疫刺激效应。为了进一步增强CPMV作为表位提呈系统的免疫源特性，破伤风类毒素可以被整合进嵌合病毒粒子中。为了实现这个目的，VP-S的第十位缬氨酸(VallO)被表位本身所取代。由于破伤风类毒素表位是以缬氨酸开始和结束的，所以突变的病毒氨基端缺失10个"天然"氨基酸，该10个氨基酸似乎足以保持推想的多蛋白蛋白酶结合位点。这种方法产生的构建称为TT4。在将cDNA直接接种进豇豆植物后，Daisgaard等人，JL/:，TT4构建从第14天起在接种的叶子上以局部病变的形式表现出感染的症状。宿主植物的全身感染不会发生。从这些局部病变中纯化的病毒在第二轮感染中，直接接种到年轻的豇豆植物上。在感染的5天内，就可看到局部病变；再过7天，全身感染清晰可见。所有时期的增殖力都提高表明在病毒基因组中的再次突变的病毒群中出现了选择。在第二次接种10天后，纯化病毒，分离RNA，进行反转录-PCR，对所得的cDNA测序。分析显示了几个单点突变，通过cDNA测序证实该单点突变在反义链上。总而言之，在不同的克隆中，观察到六个再次突变-G2388A,其导致在VP-L蛋白中存在一个Arg2102Lys突变。(这个突变被发现在三个分别的克隆中出现。)；-A3188G，导致VP-S蛋白中一个Metl77Val突变；-A3029G，导致VP-S蛋白中一个Ilel24Val突变；和-G2388A,导致VP-S蛋白中一个11e2045Met突变。为了检测是否这些突变是足以在首次感染中使TT4构建失去感染性，3种新的构建被制备出来用作载体骨架的新的嵌合病毒粒子基因组，依次包含G2388A(在VP-L中Arg2102Lys)、A3188G(在VP-S中Metl77Val突变)、A3029G(11el24Val)。接种了这些新克隆的植物在接种6天后，表现出感染的局部症状；再过4天，表现出全身症状。这是一个清楚的迹象单个第二点突变足以使修饰的TT4构建失去感染性。本构建物提供了在CPMV的内表面上表位插入物的几种特性的演示。首先，它表明T辅助细胞和CTL表位可以作为嵌合病毒粒子的内部分布肽展示。并且，清楚的说明为产生能够在植物体启动增殖感染嵌合病毒粒子，Tyrll不必复制。在CPMV的氨基端自然发生的10个氨基酸的存在对增殖和感染性是充分的。同样清楚的是存在几种不同的极大地提高在CPMV的VP-S的氨基端插入表位的构建的增殖性的第二位点突变，这些突变可以发生在VP-S本身或VP-L中(大外壳蛋白)。特定的突变是单独发现在分别的克隆中的事实强调，一定的第二个点突变比其它的突变更容易选择。这代表了一种在病毒载体中区分突变热点的方法，这些病毒载体在产生新的能产生新的嵌合病毒粒子以便展示多种外源肽的嵌合病毒粒子克隆载体中有用途。实施例10本实施例阐明了来自破伤风类毒素的强有力的通用的T-辅助细胞表位与插入在CPMV外面的VP-L环中的B细胞表位的结合表达和内部化。由于破伤风类毒素是一种通用的T-辅助细胞表位，所以值得研究如实施例9所述的在CPMV的内部联合展示这种肽的可能性，使得它与在嵌合病毒粒子的外部表面呈现表位的单个的病毒粒子上共表达。为达到这个目的，制造了一种构建，其中两个来自/^ei/ofey77o/7asaeri/57V7as的肽依次插入VP-L的B结构域的PEaB环中(膜外蛋白肽9和10，TDAYNQKLSERRAGADNATAEGRAINRRVEAE;SEQIDNO:36;Brennan等人，jg，而破伤风类毒素表位是插入到VP-S的氨基端。这种构建称为pPAE14。在cDNA直接接种豇豆植物后，PAE14构建在14天后表现出感染症状(在接种叶片上出现局部病变)。但是，宿主植物的全身症状没有出现。从这些局部病变纯化的病毒直接转移到年轻的豇豆植物上，以便启动二次感染。5天内，看到局部病变；一周内，随后的全身症状出现了。这表明筛选了其基因组增加了一个再次突变的新病毒。在接种第二组豇豆植物10天后纯化病毒，提取RNA用于反转录-PCR，并对所得cDNA测序。分析显示群体中存在几种单点突变，并通过cDNA的相对链的测序予以证实。在不同克隆中观察到的突变是-A3029G,导致VP-S蛋白中11el24Val突变(参考，实施例9，其中在相同位点发生了不同的突变)；禾口-T3189C,导致Metl77Thr突变(如上所述，在实施例9中报道了一种发生在相同位置的不同突变)。这个实施例表明在嵌合植物病毒，例如CPMV的内部表达一个表位，同时与在VP-L中的一个表位结合使其在外部提呈是可能的。观察到的第二位点突变表明，对不同的构建而言，相同的突变可以被发现(例如，在实施例9和此处的A3029G);那样选择的不同突变可以在一个单一的氨基酸位点发生，导致感染性明显增强的嵌合病毒粒子的产生。实施例11本实施例阐明了来自破伤风类毒素的强有力的通用的T-辅助细胞表位与插入在CPMV外面的VP-S环中的B细胞表位的结合的表达和内部化。由于有可能通过使用VP-L的B结构域的PEaB环(实施例10)将在CPMV的内表面表达通用的T-辅助表位与在病毒的外表面表达表位结合起来，所以值得探索将伤风类毒素表位的表达与在VP-S的PBPC环中的表位表达结合起来。用乙肝病毒的2F10模拟位的相似方法在实施例7中予以描述。所以，制造了一种构建，其中破伤风类毒素表位如实施例9所述插入到VP-S的氨基端，而粘蛋白-肽(GVTSAPDTRPAPGSTA;SEQIDN0:37)插入到VP-S的eBPC环中，位于基本上如同在Daisgaard等人，J2中所述的Ala22Pro23之间。该构建被称为pMUC51。在将cDNA接种到豇豆植物之后，MUC51不表现出任何感染症状，甚至在21天之后。由于这一原因，制备了一种与pMUC51相同的cDNA构建，除了如同实施例9所报道的第二位点突变(A3188G:Metl77Val)被编码进嵌合病毒载体中。新的构建称为p而C53。在将cDNA接种到豇豆植物之后，MUC53直到第14天才表现出感染症状。宿主植物的全身感染没有发生。从局部病变纯化的病毒直接转移到年轻的豇豆植物上以便启动第二轮感染周期。这很可能表明在病毒基因组上筛选进一步的突变。从接种10天后的植物上分离病毒，用反转录-PCR将基因组RNA转译成cDNA。对互补链都进行序列分析证实发生了进一步的突变-G2357A,导致在VP-L中发生了Ala492Thr;和-G2898A，导致在VP-S中发生了Gly80Asp。这些实验表明表位内部化的几种有用的特征。清楚的是它可能将在VP-S的PBPC环中的表位插入物与VP-S的氨基端的表位结合起来，即使后一表位在长度上是18个氨基酸残基。并且，它表明在一些情况下，单独的第二位点突变不足以产生感染性的构建，若非第三位点突变需要被选择以便提供能够启动感染能力的嵌合病毒粒子。选择如此高级次序的突变和第二位点突变的方法是在下面的实施例12中公开的。实施例12下面的实施例介绍了筛选能够实现肽内部化和双展示的新的嵌合病毒粒子基因组的方法。参考前面的实施例给我们提示，用野生型嵌合病毒粒子作为载体，体内筛选能内部容纳反映内在化和双展示肽的新的植物病毒粒子。所以，下述方法或其变体可以用于筛选新的嵌合病毒粒子载体。1.通过连接两个或更多的杂交寡核苷酸或外源DNA片段，一个编码肽的序列克隆进一个编码CPMV-RNA(例如，pCP7或pCP26)的感染性的cDNA分子中。可以应用相邻于编码VP-S的氨基端的序列的限制酶切位点(例如，唯一的Mel和&o01091位点)。肽插入的确切位置优选在VallO和Tyrll之间，在VallOTyrll的重复体之间，或者在Tyrll的重复体之间。也可能使用其中已经插入肽的cDNA克隆(例如，VP-S的PBPC环)，以便几个表位可以同时在一个粒子上编码和提呈。2.在豇豆嵌合病毒的案例中，将步骤1所构建的克隆和编码CPMV-RNA1的cDNA克隆结合接种约为10-14天龄的豇豆植物(或者在植物生长、并在开花开始前的其他任一时期*)。(任何其他CPMV的易感宿主可以在开花开始前的适合时间予以感染*)。[*直到生长阶段停止前，病毒能够在适合的宿主上启动全身感染；对于开花植物而言，是在开花开始前]。3.对植物表现感染症状进行密切的监测。对于一个良好的复制粒子，4-6天后，可以在接种叶上看到局部病变，虽然它们通常不明显。在感染后的10-14天，可以看到全身症状。如果存在全身感染的明确指征，植物可在感染后的3-4周内收获，并且纯化病毒(步骤5)。如果14天后或更长时间才出现第一个局部病变，并且在感染后直到3周也没有或非常少的全身症状，那么可能在植物体内发生了自发突变。在这种情况下，病毒需要按照步骤4转移到新鲜植物上。如果根本没有可检测的症状，需要进行再次突变(参看步骤7和8)。4.如果在感染后的2周或更长的时间里(在花期开始前或植物生长阶段终止前)仅有明显的局部病变而没有全身症状，从叶子上将病变取下来并单独转移到一个试管中。每个试管加入一些水或适合储存病毒粒子的任何缓冲液，压碎叶子碎片。所得悬浮液依照步骤2所述用于接种新鲜的年轻豇豆植株(或其他适合的宿主植物)。这将在感染约5天后导致局部病变，再过3-6天出现全身症状。收获叶子。从叶子上纯化病毒，例如使用氯仿/异戊醇提取后，用PEG沉淀，(vanKa,en和deJaeger豇豆花叶病毒，在CMI/AAB描述植物病毒197，CommonwealthAgriculturalBureaux[1978])。从每种单独植株上分离样品用于序列分析(Brennan等人，见上)。6.用能与VP-S基因或VP-L基因特异杂交并启动其反转录的引物，该病毒粒子可用于标准反转录反应。使用能够扩增VP-S基因或VP-L基因或者两者的引物，通过PCR方法扩增反转录产物。将多聚酶链式反应产物进行测序，以便VP-S、VP-L或者两者序列可在两条链上确定。如果插入表位上没有突变，该构建物可以和其他物质一起用于免疫学分析。7.如果确定了第二点突变，就可以通过区域介导的突变形成或者通过将步骤6中的cDNA中切出和粘贴片段进感染克隆中，将它们导入步骤1所述的cDNA克隆的新的衍生物中。8.如果在步骤4中，根本没有症状，在不同的构建中确定的或者任何其他可以产生感染克隆的已知的第二位点突变突变可以被导入步骤1制备、步骤6修饰的cDNA克隆中。对新的构建重复整个感染过程，按照步骤2-5的顺序。如果在步骤4中存在良好的症状，导入的突变足以使CPV在植物体中感染和复制。如果只有局部病变，那么可能发生了第三个点突变。这可以按照步骤5和6进行研究或证实。9.使用多种第二位点突变或第三位点突变(或更多的点突变)可以建立病毒载体文库，该文库可以如同上面的步骤1所述连接进表位。在这种情况下，重要的是进行步骤4中的局部病变的转移，以便确保全身感染的植株含有一个病毒单一克隆。实施例13本实施例表明再次应用第二突变加强了病毒载体的感染和复制，该病毒载体表达一种外源肽而不是其体内突变选择压力下产生的内在表达肽。来自仙台病毒的核衣壳蛋白的肽(氨基酸序列是，HGEFAPGNYPALWYSA;SEQIDNO:ll)被插入到CPMV的VP-S的氨基端，位于复制的酪氨酸残基(即，Tyrll在该插入肽的氨基端，而第二个酪氨52酸残基紧邻在插入肽的羧基末端之后)之间的区域。该构建称为pSEN2。在将cDNA在豇豆植株上接种后，21天后，SEN2不表现出任何的症状。由于这个原因，构建了一个与pSEN2相似的构建体，但是其不同在于嵌合病毒载体包含一个选自表达疟疾表位构建(MAL8;参见实施例3)的第二位点突变，Phe91Ser。这个构建体称为pSEN3。在cDNA接种到豇豆植株上后，SEN3构建体表现出最早6天在接种的叶片上表现感染症状，再过4天，5株接种植物中有4株表现全身症状。感染后21天收获植物。从接种的叶上纯化病毒，观察到从47克叶子中获得的病毒产量为50毫克。将来自接种21天后纯化的病毒中分离的RNA进行反转录-PCR，并在两条链上对所得cDNA测序。测序分析表明该序列与用于接种植物的pSEN3构建的序列相比没有变化。这清楚地表明可以使用选自内部表达一个肽的构建体的特定的第二个位点突变帮助在基本上相同的位置插入另外一个无关肽的内部表达。这暗示着第二位点突变在肽的内部表达中具有广阔的用途，原则上也可根据实施例7和8用于构建双展示粒子。所以，可能根据实施例12和13简要说明的方法构建一个载体库，该载体库可以不经过不适当的实验检验肽在病毒粒子内部的表达。实施例14本实施例表明在植物病毒粒子的内部表达T细胞表位可以避免该表位暴露于体液免疫反应元件(例如，循环抗体)和免疫原或抗原提呈途径产生的免疫调节。构成疫苗的许多肽的目的是对提呈的表位.引导细胞反应而不是体液反应(抗体反应)。特别是，如果剌激了细胞免疫反应，肿瘤干涉治疗逐渐被认为更有效。但是，由于提呈的有关表位也可以被血清中循环的抗体识别，所以通常存在被导入用于刺激期望免疫反应的免疫原可以诱导针对展示肽的体液免疫而不是细胞免疫反应的机会。而且，具备与导入的免疫原或抗原性组合物的结合能力的循环抗体的偶然存在，可以通过清除复合物阻止了期望免疫反应的适当和有效的刺激。实际上，这是任何肽展示系统的潜在问题，其中肽展示在大分子载体的外部，例如匙孔血蓝蛋白(KLH)。另一方面，在病毒粒子的内部表达一种肽如一种表位，，例如，在植物的嵌合病毒中，可以保护该肽不与抗体结合。这不仅阻止了对该表位的不需要的体液反应，并且有助于肽经受清除和蛋白水解后的存活，直到其得以提呈，并且被免疫系统的抗原提呈细胞加工(APCS)。由于这些原因，表位在CPMV或其他植物病毒中的内部化对表达表位有实用性，该表位可以与循环抗体交叉反应，因而被用以介导从体液反应到细胞反应的免疫反应类型。这也可以使用于肽的模拟位的表达。对于肽在免疫治疗中的应用，需要对特定的细胞毒性的T细胞进行诱导。为了实现这一点，必须使细胞释放和提呈能诱导细胞毒性T细胞反应的表位，以便该肽表位可被加工并被提呈在腿Cll分子中。以这种途径的提呈避免了直接的抗体反应，取而代之的是诱导了对特定细胞毒性T淋巴细胞群的刺激。这种淋巴细胞随后直接耙向展示议论肽的细胞，导致调理作用后细胞溶解或者靶细胞或抗原的清除。现已知道来自人类乳腺癌细胞(或其他癌细胞)表面大量存在的一种蛋白，粘蛋白，的肽当与载体结合后，可以诱导小鼠CTL反应。在癌细胞上发现的粘蛋白多肽与许多非癌细胞表面上的发现的蛋白的普遍形式的不同在于它是不同的翻译后修饰的。在尝试用包含粘蛋白肽的疫苗Muclp免疫实验动物时，发现在小鼠中的交叉反应抗体可以将诱导的细胞免疫反应转化为体液免疫反应。当同样的免疫原预防接种人时，引起的是抗体反应而不是细胞反应，因为抗原肽与针对Gala(1，3)Gal表位的抗体交叉反应，其中Galci(1，3)Gal表位正常存在于人类的一些血型组的决定簇中，但是没有在老鼠中发现。一种技术方案是将同样的肽作为插入物表达于CPMV的VP-S的氨基端，位于Tyrll的重复体之间。当这些粒子被用于免疫人时，抗体不能直接与插入的表位结合。通过Muclp肽在抗原提呈细胞(APCs)上的吸收和提呈，优先发生了针对表位的细胞反应。对特异于Muclp肽表位的CTL亚群的刺激导致在其细胞膜上带有基本上相同的表位的靶细胞的裂解和清除。实施例15本实施例表明生产包含来自麻疹病毒的CTL表位的CVP。从麻疹病毒获得的带正电的CTL表位(LDRLVRLIG;SEQIDNO:13)被插入VP-S的氨基端，位于Y11的重复体之间。该构建被称为pMV14。用这种构建接种植物不显示任何症状。相同的表位被插入到V10Y11(二pMV15)的54重复体之间，现在观察到5个接种植株中有2个表现了症状。当纯化病毒被转染到年轻的豇豆植株上时，观察到非常良好的症状。两种外壳蛋白基因被完全测序，发现完全正确。实施例16本实施例表明生产包含来自疱疹性口腔炎病毒的CTL表位的CVP。疱疹性口腔炎病毒(RGYWQGL;SEQIDN0:12)的CTL表位已经成功地表达在TY粒子的表面，并且这些粒子在小鼠身上诱导了非常良好的CTL反应(Layton等人，免疫学87:171-178[1996])。相同的表位被插入到CPMV的VP-S的重复的Yll之间。该构建被称为PVSVI。在用本构建接种的5株植物中有4株表现出良好的症状。本病毒的产量好(0.79毫克/克叶子)。本实施例表明构建CTL表位侧面具有寡丙氨酸的载体。已知对于抗原提呈细胞的CTL表位的正确加工，表位侧面的氨基酸残基是关键因素。但是，对于哪种残基与某种表位结合是最合适的知之甚少。已经观察到在表位的任一位点插入短的丙氨酸片段可以有助于提高对插入的蛋白载体的CTL表位的反应。(DelVal等人，细胞学杂志(Cell)66:1145-1153[1991])。制备了一种在V10Y11的重复体之间具有5个丙氨酸的载体，但在该插入点(二pP35)中具有唯一的一个Notl位点。该载体本身可以感染豇豆植株，虽然病毒的症状相比于野生型病毒要迟一些。在这个寡丙氨酸片段中插入表位可以有助于研究，万一表位产生的免疫反应很弱时的最佳CTL表位加工过程。将疟疾表位插入到Notl位点制备了pMALll。该构建在植物体上有良好的症状。由于在小鼠中没有观察到对pMV15麻疹病毒表位的CTL反应(参见上面所述)，制备了另外一种构建，其中表位的两侧之一具有几个丙氨酸。这种构建，pMV16，对豇豆植株没有感染性。与pSEN3相似(参见上面所述)，来自不相关构建的第二个位点的突变被用于pMV16(来自pTT4的M177V)。这种被称为p雨17的构建在植物体上不表现任何症状。依据国际承认用于专利程序和控制的微生物保藏的布达佩斯条约的条文，下述有用的植物病毒载体保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC)(Rockville，Md.，美国):pTB2(ATCC编号75280)和pTBU5(ATCC编号75281)。构建这些质粒的详细情况在美国专利5，589，367中予以公布，引述于此作为参考。在上述说明书中提到的出版物和专利引述于此作为参考。在不背离本发明范围和精神的情况下，本发明所述的组合物和方法的多种改进和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。虽然本发明是于特别的优选的实施方案相联系而说明的，但是应该理解的是本发明的权利要求不应该限于此种特定的实施方案中。实际上，对本
技术领域：
和相关
技术领域：
的技术人员来说，所述实施本发明的模式的多种变化也应包含在所附权利要求的范围之内。5序列表<110>K-海伦多恩<120>含有外源性内表位的病毒颗粒<130>DOW-04661<150>GB9924352.9<151>1999_10-14<160>37<170>Patentlnversion3.0<210>1<211>10<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<400>1GlyProValCysAlaGluAlaSerAspVal1510<210>2<211>11<212>PRT<213>人造/未知<220><221>raise—feature<222>()..()<223>合成的<400>2GlyProValCysAlaGluAlaSerAspValTyr1510<210>3<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()()<223>合成的<400>3GlyProValCysAlaGluAlaSerAsp15<210>4<211>7<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>4GlyTyrHisGlySerSerLeu<210>5<211>14<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<400>5AlaValTyrTyrCysThrArgGlyTyrHisGlySerSerLeu1510<210>6<211>15<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<400>6ArgProGinAlaSerGlyValTyrMetGlyAsnLeuThrAlaGin151015<210>7<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..(><223>合成的<400>7SerTyrlieProSerAlaGlu!Lyslie15<210>8<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()..()<223>合成的5<400>8SerTyrlieProSerAlaGlyLyslie15<210>9<211>16<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<400>9AlaAlaAlaSerTyrlieProSerAlaGluLyslieAlaAlaAlaAla151015<210>10<211>8<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()..()<223>合成的<400>10AlaProGlyAsnTyrProAlaLeu15<210>11<211>16<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>().()<223>合成的<400>11HisGlyGluPheAlaProGlyAsnTyrProAlaLeuTrpSerTyrAla151015<210>12<211>8<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>().()<223>合成的<■>12ArgGlyTyrValTyrGinGlyLeu15<210>13<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()..()<223>合成的<400>13LeuAspArgLeuValArgLeulieGly15<210>14<211>15<212>PRT61<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()()<223〉合成的<400>14AlaAlaAlaLeuAspArgLeuValArgLeulieGlyAlaAlaAla151015<210>15<211>18<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()..()<223>合成的<400>15ValAspAspAlaLeulieAsnSerThrLyslieTyrSerTyrPhePro151015SerVal<210>16<211>13<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>(>..()<223>合成的<400>16MetGinTrpAsnSerThrThrPheHisGinThrLeuGin1510<210>17<211>5<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()..()<223>合成的<400>17AlaAlaAlaAlaAla15<210>18<211>21<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<400>18ggttatcatggttctagtttg21<210〉19<211>42<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()()<223>合成的<400>19gctgtttattattgtactagaggttatcatggttctagtttg42<210>20<211>45<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()()<223>合成的<400>20agacctcaagcttctggtgtttatatgggtaatttgactgctcaa45<210>21<211>27<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<400>21tcttatattccttctgctga3aagatt27<210>22<211>48<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<彻>2264gcagcggcctcttatattccttctgctgsaaagattgcggccgctgct48<210>23<211>24<212>DNA<213>人造/未知<220><221>raise—feature<222>()..()<223>合成的<400>23gctcctggtsattatcctgctttg24<210>24<211>48<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..O<223>合成的<400>24catggtgaaitttgctcctggtaatt3tcctgctttgtggtettatget48<210>25<211>23<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()()<223>合成的<400>25agaggttatgtttatcaaggttg23<210>26<211>27<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()…()<223>合成的<400>26ttggatagattggttagattgattggt<210>27<211>45<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()()<223>合成的<400>27gcagcggccttggatagattggttagattg<210>28<211>54<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()()<223>合成的<400>28gtggattgeitgctttgattssttctsctssg27attggggccgctgct45atttatagttattttccttctgtt54<210>29<211>39<212>DNA<213>人造/未知<220〉<221>misc—feature<222>()..()<223>合成的<權>29atgcaatggaactctactacttttC3tcaaactttgcaa39<210>30<211>15<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()..()<223>合成的<400>30gcsgcggccgctgct15<210>31<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<400>31TyrSerProCysMetlieAlaSerThr15<210>32<211>10<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>32ValTy:rSerProCysMetlie15<210>33<211>15<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>().()<223>合成的<400>33AlaValTyrTyrCysThrArg<210>34<211>8<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>()..()<223>合成的<400>34GlyTyrHisGlySerSerLeu15AlaSerThr10GlyTyrHisGlySerSerLeuTyr1015Tyr68<210>35<211>16<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc—feature<222>().()<223>合成的<權>35GlyValSerThrAlaProAspThrArgProAlaProGlySerThrAla151015<210>36<211>32<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc一feature<22>()()<223>合成的<400>36ThrAspAlaTyrAsnGinLysLeuSerGluArgArgAlaGlyAlaAsp151015AsnAlaThrAlaGluGlyArgAlalieAsnArgArgValGluAlaGlu202530<210>37<211>16<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc一feature<222>()..()<223>合成的<400>37GlyValThrSerAlaProAspThrArgProAlaProGlySerThrAla15101权利要求1.一种含有具有衣壳的嵌合病毒粒子的化合物，其中所述的衣壳具有内侧面和外侧面，所述的衣壳在其所述的内侧面含有至少一个外源肽。2.根据权利要求1所述的嵌合病毒粒子，它能够在宿主细胞或组织中装配。3.根据权利要求1或2所述的嵌合病毒粒子，其中所述的病毒是二十面体的。4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的病毒是豇豆花叶病毒属。5.根据权利要求4所述的嵌合病毒粒子，其中所述的病毒是豇豆花叶病毒。6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入外壳蛋白中。7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽含有5到20个氨基酸。8.根据权利要求1-7中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入到距离外壳蛋白的氨基端5-20个氨基酸的地方，这种病毒粒子的装配在宿主细胞中未受到阻止。9.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入到豇豆花叶病毒的VP-S中，其插入位置位于第11位的酪氨酸残基和第12位重复酪氨酸残基之间。10.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入到豇豆花叶病毒的VP-S中，其插入位置位于包含第10位的缬氨酸残基和第ll位的酪氨酸残基的二肽与包含位于第12位的缬氨酸残基和第13位酪氨酸残基的重复二肽之间。11.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入到豇豆花叶病毒的VP-S中，其插入位置位于第10位的缬氨酸残基和第11位的重复的缬氨酸残基之间。12.根据权利要求1-11中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的病毒粒子不含有核酸。13.根据权利要求1-12中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽编码一种可以为动物免疫系统识别的表位。14.根据权利要求1-13中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽是细胞毒性T淋巴细胞表位。15.根据权利要求1-14中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽含有具有来自表位自然发生源的侧面氨基酸的细胞毒性T淋巴细胞表位。16.根据权利要求1-12中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽是T辅助细胞表位。17.根据权利要求1-12和权利要求16中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽含有具有来自表位自然发生源的侧面氨基酸序列的T辅助细胞表位。18.根据权利要求卜12中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽是B细胞表位。19.根据权利要求1-12和权利要求18中任一项所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽包括具有来自表位自然发生源的侧面氨基酸序列的T辅助细胞表位。20.根据权利要求1-19中任一项所述的嵌合病毒粒子，它含有一个表达在病毒衣壳外表面上的第二个外源肽。21.根据权利要求1-20中任一项所述的嵌合病毒粒子，它含有一个表达在病毒衣壳外表面的第二个外源肽，其中所述的肽被插入到豇豆花叶病毒的VP-S的PC'-PC"环中。22.根据权利要求1-20中任一项所述的嵌合病毒粒子，它含有一个表达在病毒衣壳外表面的第二个外源肽，其中所述的肽被插入到豇豆花叶病毒的VP-S的eB-ec环中。23.根据权利要求1-20中任一项所述的嵌合病毒粒子，它含有一个表达在病毒衣壳外表面的第二个外源肽,其中所述的肽被插入到豇豆花叶病毒的VP-L的3E-aB环中。24、根据权利要求卜20所述的嵌合病毒粒子，它含有表达在病毒衣壳外表面的第二种外源肽，其中所述的肽插入到豇豆花叶病毒VP-S的羧基端。25、根据权利要求l-14所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽的表位与含有两个或多个丙胺酸残基的氨基酸侧面相接。26、一种含有包含至少一条被插入在VP-S和/或VP-L中的外源肽的嵌合病毒粒子的化合物，且其中所述嵌合病毒粒子选自雀麦花叶病毒病毒属或豇豆花叶病毒病毒属，该病毒粒子具有拥有内侧面和外侧面且包括在所述衣壳内侧面上的至少一条外源肽的二十面体衣壳。全文摘要本发明涉及在病毒粒子上表达肽，尤其是在病毒衣壳的内部表达肽。本发明描述了修饰病毒的方法，以便使外源表位可被表达在病毒衣壳的内部。可被修饰的病毒包括(+)链RNA病毒，特别是植物(+)链RNA病毒，例如豇豆花叶病毒。内部表达对表达疏水表位特别有用。本发明还发现修饰的病毒粒子有作为疫苗和作为能诱导免疫反应的物质的用途。文档编号C12N15/40GK101591647SQ20091014262公开日2009年12月2日申请日期2000年10月13日优先权日1999年10月14日发明者K·海伦多恩,T·琼斯申请人:陶氏化学公司