鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法
【专利摘要】鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法，包括如下步骤：选取目标鸡饲料、设定添加外源碳水化合物酶类型和剂量水平、体外模拟鸡的胃肠道消化、测定饲料的体外消化能值、分析目标饲料的最优碳水化合物酶谱。本发明通过体外法模拟动物消化过程，使用饲料体外能值表征碳水化合物酶的作用效果，快速获取鸡饲料最优的外源碳水化合物酶谱。
【专利说明】鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法，特别是涉及利用体外模拟消化法快速优化鸡饲料外源碳水化合物酶谱的方法。
【背景技术】
[0002]碳水化合物是饲料的主体部分，也是动物的主要能量来源。随着饲料成本持续上涨，人们不断寻求较低廉的饲料原料(如:玉米加工副产物)部分替代传统的玉米和豆柏饲料原料。然而，这些加工副产物常含有较高的日粮纤维，而这些日粮纤维不能被动物机体充分利用(Anguita et al.，2006)。目前，通常采用添加外源碳水化合物酶来提高日粮纤维的利用率，碳水化合物酶常以非淀粉多糖酶为主，如木聚糖酶(Engberg et al.，2006;丁雪梅等,2009 ；Selle et al., 2003)、纤维素酶(Nahm et al., 1985 ;陈晓春等,2005)、β -葡聚糖酶(Philip et al., 1995 ；Yu et al.，1998)等,而碳水化合物酶的作用效果与日粮组成、酶的活性、酶谱配伍密切相关。然而，外源碳水化合物酶的类型和配伍等不确定因素，导致目前普遍对外源酶的添加具有一定的盲目性。
[0003]筛选饲料的最优酶谱的方法主要有体内法(in vivo)和体外法(in vitro)。体内法就是进行动物试验，常常耗资、费力、费时，系统误差和偶然误差影响因素多(陈亮等，2013)。而体外法具有快速、简便、费用低等优点，但目前体外法选择的参数和条件常常缺乏理论的解释，具有一定的随意性(Coles et al.，2005)。因此，选取合理的体外模拟消化参数，模拟鸡饲料的消化过程，针对不同鸡饲料外源碳水化合物成分特性，筛选与之相适应的碳水化合 物酶谱，对于充分发挥饲料潜能，提高饲料利用率和增加养殖生产效益具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的技术解决问题:为了克服目前鸡饲料中添加外源酶的盲目性，提供一种鸡饲料外源碳水化合物酶谱的快速筛选方法，通过体外法模拟动物消化过程，使用鸡饲料体外能值表征碳水化合物酶的作用效果，快速获取鸡饲料最优的外源碳水化合物酶谱。
[0005]本发明的技术解决方案如下:鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选法，包括步骤如下:
[0006](I)选取目标的鸡饲料，并在所述鸡饲料中添加多种已知类型的外源碳水化合物酶，每种外源碳水化合物酶的添加剂量设置系列的浓度梯度；
[0007](2)将已知重量的加酶鸡饲料样品置于三角瓶中，并加入已知配比的模拟胃消化的缓冲液和消化酶液，混合均匀，其中饲料、缓冲液和消化酶液的重量百分比范围是2:6:I~2:10:1，并在设定的模拟胃消化参数下将鸡饲料样品进行模拟胃的消化过程；
[0008](3)待模拟胃消化结束后，在三角瓶中加入已知配比的模拟小肠消化的缓冲液和消化酶液，其中缓冲液和消化酶液的重量百分比范围是19:1~21:1，并继续在设定的模拟小肠消化参数下将鸡饲料样品进行模拟小肠的消化过程；[0009](4)待模拟小肠消化结束后，将消化残渣烘干至恒重，测定残渣体外消化能值，计算出添加每种碳水化合物酶的鸡饲料体外消化能值，并根据碳水化合物酶和体外消化能值的回归关系，得出每种碳水化合物酶能提高目标的鸡饲料体外消化能值的临界点；
[0010](5)将每种碳水化合物酶依据所述临界点进行编码，采用回归正交旋转组合设计，以体外消化能值为特征指标，筛选外源碳水化合物酶的最优酶谱。
[0011]所述步骤(1)中目标的鸡饲料中添加3~7种外源碳水化合物酶，添加剂量设置O~1000 μ g/g系列浓度梯度。
[0012]所述步骤(2)中模拟胃消化的缓冲液为:pH为2.0，摩尔质量比90:8~100:11=氯化钠:氯化钾的混合缓冲溶液；模拟胃消化的酶液为:pH2.0的900~1500U/mL胃蛋白酶
液。
[0013]所述步骤(2)中模拟胃消化参数为:温度40~42°C，摇床转速120~180rpm，消化时间4~6h。
[0014]所述步骤(3)中模拟小肠消化的缓冲液为:pH为6.3~6.6，摩尔质量比90:18:152~98:22:186=氯化钠:氯化钾:磷酸盐的混合缓冲溶液；模拟小肠消化的酶液为:ρΗ6.3~6.6，单位酶活力比37:8:386:1~46:12:464:2=胰蛋白酶:糜蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶的混合酶液。
[0015]所述步骤(3)中模拟小肠消化的参数为:温度40~42°C，摇床转速120~180rpm，消化时间15~18h。
[0016]所述步骤(5)中将每种碳水化合物酶依据所述临界点进行编码时，根据添加的多种碳水化合物酶的种类，设置对应数量的影响因子，每个影响因子设置5个水平，采用回归正交旋转组合设计分析体外消化能值，并利用体外消化能值与碳水化合物酶添加剂量关系，表征出最优的碳水化合物酶谱。回归正交旋转组合设计具有计算简单，并可以消除回归系数之间的相关性，达到快速优化最优酶谱的目的。
[0017]本发明与现有技术相比的优点在于:
[0018](1)本发明以大量动物体内实验数据为依据，选取的体外模拟参数更加贴近动物的实际生理状况，具有较好的模拟饲料在鸡体内消化过程的效果；
[0019](2)本发明克服了以往筛选外源碳水化合物酶的盲目性，使用快捷的体外手段模拟饲料在鸡胃肠道的消化过程，并提出体外消化能值表征最优酶谱，达到了快速优化碳水化合物酶谱的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明实现的流程图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图及具体实施例详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，不仅仅限于本实施例。
[0022]实施例1，
[0023]如图1所示，本发明具体操作方法可以如下方式实施:
[0024]( I)选取玉米-豆柏日粮，并在饲料中分别添加四种外源碳水化合物酶，即木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶和果胶酶，每种外源碳水化合物酶添加剂量的浓度梯度水平分别设为 0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μ g/g。
[0025](2)准确称取I~2g (粉碎过60目筛)饲养样品(精确至0.0002g)，置于100mL具塞三角瓶中，向三角瓶中加入模拟胃消化的缓冲液和消化酶液，其中饲料、模拟胃缓冲液和模拟胃消化酶液的重量百分比为2:8:1 ;模拟胃消化的缓冲液为pH为2.0，摩尔质量比90:8=氯化钠:氯化钾的混合缓冲溶液；模拟胃消化酶液为PH2.0的1000U/mL胃蛋白酶液。小心混合均匀后，用橡胶塞封口，于42°C恒温水浴摇床中(150rpm),放入5min后开始计时，消化时间为6h。
[0026](3)待胃消化阶段结束后，向三角瓶中加入模拟小肠消化的缓冲液和消化酶液，其中缓冲液和消化酶液的重量百分比是20:1 ;模拟小肠消化的缓冲液为pH为6.4，摩尔质量比90:18:152=氯化钠:氯化钾:磷酸盐混合缓冲溶液；模拟小肠消化的酶液为:pH6.4，单位酶活力比37:8:386:1的胰蛋白酶:糜蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶混合酶液。小心混合均匀后，用橡胶塞封口，于42°C恒温水浴摇床中(150rpm),放入5min后开始计时，消化时间为ISh0将消化残渣烘干至恒重，并测定残渣能值，计算在不同浓度的每种碳水化合物酶作用下日粮的体外消化能值；并根据碳水化合物酶和体外消化能值的回归关系，得出木聚糖酶、纤维素酶、β -葡聚糖酶和果胶酶能提高目标日粮体外消化能值的临界点为600 μ g/g。
[0027](4)四种碳水化合物酶设为4个影响因子，每个因子设置5个水平，将每种碳水化合物酶的临界添加量(600 μ g/g)编码为0，采用四元二次回归正交旋转组合设计，酶添加水平400、500、600、700、800 μ g/g分别用-2、-1、O、1、2进行编码(具体的设计因素及水平见表1)，建立体外消化能值与四种碳水化合物酶添加量的四元二次回归方程，其方程为:玉米 _ 豆柏日粮的体外消化能值=a0+alxl+a2x2+a3x3+a4x4+al2xlx2+al3xlx3+al4xlx4+a23x2x3+a24x2x4+a34x3x4+allxl2+a22x22+a33x32+a44x42 (a,回归方程系数；xl，木聚糖酶；x2，纤维素酶；χ3，β-葡聚糖酶；χ4，果胶酶)。使用偏导数法求解回归方程中最优的碳水化合物酶谱组合以及各个碳水化合物酶添加剂量。
[0028]表1
[0029]
【权利要求】
1.鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法，其特征在于实现步骤如下: (1)选取目标的鸡饲料，并在所述鸡饲料中添加多种已知类型的外源碳水化合物酶，每种外源碳水化合物酶的添加剂量设置系列的浓度梯度； (2)将已知重量的加酶鸡饲料样品置于三角瓶中，并加入已知配比的模拟胃消化的缓冲液和消化酶液，混合均匀，其中饲料、缓冲液和消化酶液的重量百分比范围是2:6:1~2:10:1，并在设定的模拟胃消化参数下将鸡饲料样品进行模拟胃的消化过程； (3)待模拟胃消化结束后，在三角瓶中加入已知配比的模拟小肠消化的缓冲液和消化酶液，其中缓冲液和消化酶液的重量百分比范围是19:1~21:1，并继续在设定的模拟小肠消化参数下将鸡饲料样品进行模拟小肠的消化过程； (4)待模拟小肠消化结束后，将消化残渣烘干至恒重，测定残渣体外消化能值，计算出添加每种碳水化合物酶的鸡饲料体外消化能值，并根据碳水化合物酶和体外消化能值的回归关系，得出每种碳水化合物酶能提高目标的鸡饲料体外消化能值的临界点； (5)将每种碳水化合物酶依据所述临界点进行编码，采用回归正交旋转组合设计，以体外消化能值为特征指标，筛选外源碳水化合物酶的最优酶谱。
2.根据权利要求1所述的鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法，其特征在于:所述步骤(1)中目标的鸡饲料中添加3~7种外源碳水化合物酶，添加剂量设置O~1000 μ g/g系列浓度梯度。
3.根据权利要求1所述的鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法，其特征在于:所述步骤(2)中模拟胃消化的缓冲液为:pH为2.0，摩尔质量比90:8~100:11=氯化钠:氯化钾的混合缓冲溶液；模拟胃消化的酶液为:pH2.0的900~1500U/mL胃蛋白酶液。
4.根据权利要求1所述的鸡饲料外`源碳水化合物酶谱的筛选方法，其特征在于:所述步骤(2)中模拟胃消化参数为:温度40~42°C，摇床转速120~180rpm，消化时间4~6h。
5.根据权利要求1所述的鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法，其特征在于:所述步骤(3)中模拟小肠消化的缓冲液为:pH为6.3~6.6，摩尔质量比90:18:152~98:22:186=氯化钠:氯化钾:磷酸盐的混合缓冲溶液；模拟小肠消化的酶液为:pH6.3~6.6，单位酶活力比37:8:386:1~46:12:464:2=胰蛋白酶:糜蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶的混合酶液。
6.根据权利要求1所述的鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法，其特征在于:所述步骤(3)中模拟小肠消化的参数为:温度40~42°C，摇床转速120~180rpm，消化时间15 ~18h。
7.根据权利要求1所述的鸡饲料外源碳水化合物酶谱的筛选方法，其特征在于:所述步骤(5)中将每种碳水化合物酶依据所述临界点进行编码时，根据添加的多种碳水化合物酶的种类，设置对应数量的影响因子，每个影响因子设置5个水平，采用回归正交旋转组合设计分析体外消化能值，并利用体外消化能值与碳水化合物酶添加剂量关系，表征出最优的碳水化合物酶谱。
【文档编号】C12Q1/34GK103882094SQ201410018289
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】陈亮, 张宏福, 侯小峰, 付生慧, 何科林 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所