免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗，其包括基于重组腺病毒的基因载体。为了获得针对HPV的协同免疫增强效果，该类治疗性疫苗含有三个关键元素：1）有效表达HPV病毒抗原，包含HPV16型和18型的E6、E7多价融合蛋白；2）有效表达与前述抗原蛋白融合的免疫佐剂蛋白，包含结核杆菌的热休克蛋白（HSP）；3）同时表达免疫刺激因子，包含粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。该疫苗通过对小鼠体内含HPV抗原的肿瘤治疗实验表明，能有效增强免疫反应并清除肿瘤。本发明展示了HSP融合蛋白与GM-CSF对HPV抗原的协同免疫刺激作用，为宫颈癌及其它HPV感染所致疾病的治疗性疫苗提供了新的方法。
【专利说明】免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗
【技术领域】
[0001]本发明属于疫苗领域，具体涉及一种人乳头瘤病毒持续性感染及其所诱发的宫颈癌及其它病变的治疗性疫苗，更具体的，涉及含有免疫增强剂的人乳头瘤病毒治疗性疫苗。
【背景技术】
[0002]世界范围内，宫颈癌是女性第二大高发癌症，每年约274，000患者死于该病。所有的宫颈癌均可检出HPV感染。此外，肛门、阴道、阴茎癌及某些口腔癌及喉癌也与HPV感染有关。虽然目前已经有两种预防性疫苗投放市场，但其对已存在的HPV感染并无任何治疗效果，更无法阻断病变恶性化进程。并且，据估算现已被HPV感染的病人基数很大，所以通过大规模接种预防性疫苗达到减少宫颈癌发病率，至少需要20年后才能明显见效。由于已有大量人群感染病毒甚至已发生宫颈癌或癌前病变，因此以清除已被感染的细胞和癌细胞为目的的治疗性疫苗的研发非常迫切。人乳头瘤病毒E6和E7蛋白是HPV病毒携带的二个致癌基因所编码的癌蛋白，属非自体的外源蛋白抗原，从癌前病变到宫颈癌发生它们都持续稳定表达，因此是非常理想的免疫治疗靶点。大量临床研究都试图以这两种癌蛋白为靶点，包括重组病毒、多肽、蛋白和DNA疫苗。这些治疗性疫苗都显示了很好的安全性，在某些病人身上也出现了病灶的消退和生存期延长。此外，研究表明疫苗免疫所诱发的T细胞免疫强度与治疗治疗效果有关。尽管某些临床研究已经出现希望，但如果想彻底治愈持续感染和清除癌症，还需要新的策略来诱导足以强大的抗肿瘤特异性抗原的T细胞免疫反应。
[0003]热休克蛋白(HSP)可以有效地调节细胞功能，增强免疫反应。首先，它可以作为“分子伴侣”起作用，帮助蛋白运输定位和辅助蛋白折叠。其次，它可以活化专职抗原递呈细胞(APC)，而HSP70可以与巨噬细胞上的受体结合，从而有效激活其免疫反应。SGN-00101是一种融合有HPV16 型E7蛋白和结核杆菌的HSP65的融合蛋白，其已经表现出了良好的安全性，并且对抑制宫颈上皮细胞的高度不典型增生有一定效果。
[0004]粒-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)是已被广泛研究并被认为是最有效的免疫治疗因子之一。它可以介导自然杀伤细胞和通过抗原提呈细胞来活化肿瘤特异的CD8+杀伤性T淋巴细胞，从而起到抗肿瘤作用。诸多动物和临床试验已经证实其可以长期有效激发肿瘤抑制免疫反应。例如，Sipuleucel-T作为一种免疫治疗药物，就是利用了 GM-CSF活化抗原递呈细胞的特点，现在已经被美国食品药品安全管理局批准上市。Jennerex等人的最新临床研究也表明表达有GM-CSF的融癌痘苗病毒可以减小多种癌症病灶。但这些增强免疫的方法其疗效都不理想，要么缺乏肿瘤抗原特异性，要么免疫刺激强度欠佳。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗。
[0006]首先，本发明提供一种人乳头瘤病毒及免疫增强分子五基因型融合抗原，其含有人乳头瘤病毒16型的E6、E7蛋白和人乳头瘤病毒18型的E6、E7蛋白及免疫增强分子佐剂蛋白。
[0007]本发明采用多价抗原线性排列的方式，对融合蛋白的T细胞表位未有影响。在治疗疫苗中起中心作用的是T细胞免疫反应，而T细胞抗原决定簇在递呈过程中被降解成线性短肽，而识别位点一般仅有大约8个氨基酸，所以各种抗原排列顺序也对免疫激发没有实质影响。本发明我们融合了 HPV16及18型的4抗原蛋白与热休克蛋白分子，融合更多HPV抗原有更大的优势:可以提供更多的潜在抗原决定簇，增强抗原的递呈及增加免疫反应，对更多不同基因型的HPV感染起作用。从而有效的提高潜在的疫苗免疫的受益人群；并且更大的蛋白更容易被降解提成，从而激发更强的免疫反应。
[0008]在本发明一个实施方案中，所述的融合抗原具有下述一或多个突变位点，其中，所述的人乳头瘤病毒16型E6蛋白的突变位点为:121位的谷氨酸突变为甘氨酸；122位的赖氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒16型E7蛋白的突变位点为:24位的半胱氨酸突变为甘氨酸；26位的谷氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒18型E6蛋白的突变位点为:116位的谷氨酸突变为甘氨酸；117位的赖氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒18型E7蛋白的突变位点为:27位的半胱氨酸突变为甘氨酸；29位的谷氨酸突变为甘氨酸。
[0009]本发明对HPV E6蛋白中与细胞p53蛋白的结合区域进行了氨基酸的点突变，同时也对E7蛋白中与细胞pRb蛋白的结合区域进行了氨基酸的点突变。突变后的蛋白将不再与上述两种蛋白特异结合，从而消除HPV E6及E7蛋白的潜在转化正常细胞的风险。需要说明的是，本发明仅在几处关键位点进行了点突变，对融合蛋白的抗原性未有影响。
[0010]其中，所述的免疫增强分子佐剂蛋白为原核生物或哺乳动物热休克蛋白，优选为结核杆菌的热休克蛋白。
[0011]在本发明一个具体的实施方案中，人乳头瘤病毒及免疫增强分子五基因型融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]进一步地，本发明提供一种表达所述的含有所述融合抗原的重组基因表达载体。
[0013]在本发明一个实施方案中，所述的载体优选还可以同时携带免疫刺激因子的表达盒。
[0014]优选的，所述的免疫刺激因子为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干扰素或细胞趋化因子，优选为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。
[0015]在本发明一个具体的实施方案中，所述的表达载体携带核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示的DNA片段。
[0016]其中，所述载体可为重组腺病毒载体(adenoviral vector)，亦可为重组腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector)、重组逆转录病毒载体(retroviral vector)、重组慢病毒载体(lentiviral vector)、重组疱疫病毒载体(Herpes viral vector)、重组痘苗病毒载体(Vaccinia vector)或者重组仙台病毒载体(Sandai viral vector);也可为非病毒载体，所述非病毒载体选自裸DNA载体、纳米颗粒，多聚物或脂质体。
[0017]进一步地，本发明还提供一种治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的药物制剂，其包含治疗有效量的所述的融合抗原，或包含治疗有效量的所述的重组基因表达载体。
[0018]在一个优选的实施方案中，所述的药物制剂包含治疗有效量的所述的融合抗原以及免疫刺激因子。
[0019]其中，所述的免疫刺激因子为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干扰素或细胞趋化因子，优选为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。
[0020]在本发明一个具体的实施方案中，所述药物制剂所表达的抗原为所述人乳头瘤病毒16型18型的E6、E7多基因型融合抗原，所表达的免疫增强分子佐剂为结核杆菌的热休克蛋白并与前述多价融合蛋白再融合，所表达的免疫刺激因子为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。
[0021]在本发明另一个具体的实施方案中，所述的药物制剂还可以含有药学可接受的载体、赋形剂、辅料等。
[0022]在本发明一个具体的实施方案中，该药物制剂可作为疫苗直接一次性注射或一次以上的加强免疫注射到病人体内，以达到刺激和增强免疫的效果。也作为一种抗原，间接用于处理和孵育体外病人自体细胞或供体细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、脐带血细胞等。再分一次性或多次性注射到病人体内，以达到刺激和增强免疫的效果。
[0023]进一步地，本发明提供一种重组腺病毒，其携带所述的重组基因表达载体。
[0024]在本发明的一个具体实施方案中，所述的重组腺病毒表达人乳头瘤病毒16型18型的E6、E7，以及粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。
[0025]在本发明另一个具体实施方案中，所述的重组腺病毒优选表达人乳头瘤病毒16型18型的E6、E7蛋白和结核杆菌的热休克蛋白，以及粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。
[0026]其中， 所述的人乳头瘤病毒16型18型的E6、E7蛋白与结核杆菌热休克蛋白融合生成的多价融合蛋白。该融合蛋白表达盒与GM-CSF表达合在同一载体上共表达。
[0027]其中，所述的人乳头瘤病毒16型18型的E6、E7蛋白为多价融合蛋白，该蛋白可不与热休克蛋白融合。该融合蛋白表达盒与GM-CSF表达盒在同一载体上共表达。
[0028]进一步地，本发明还提供所述的融合抗原、所述的重组基因载体、所述的腺病毒、所述的药物制剂在制备治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
[0029]所述的人乳头瘤病毒感染引起的疾病属于与HPV慢性感染相关的疾病，优选宫颈癌、阴莖癌、肛门癌、喉癌、口腔癌、头颈部癌、宫颈癌前病变和/或宫颈增生。
[0030]体外T淋巴细胞激活实验结果表明，表达有HPV抗原HSP融合蛋白的载体，与共表达HPV抗原与GM-CSF的载体均能诱导比单纯表达HPV抗原的载体强的T细胞免疫反应。而同时表达HPV抗原HSP融合蛋白与GM-CSF的载体诱导的T细胞免疫反应最强。此外，GM-CSF的表达可以显著提高低剂量组的T细胞免疫水平，并诱导更多的肿瘤浸润T细胞。在小鼠体内的表达HPV抗原的肿瘤治疗实验中，对各组小鼠肿瘤发生率和肿瘤发生大小的评估结果显示，融合有HSP的载体与表达GM-CSF的载体具有更好的肿瘤清除和抑制再生作用。而同时表达HPV抗原与HSP的融合蛋白和GM-CSF的载体的作用最强，其结果与体外实验的结果一致。因此，本发明首次展示了 HSP融合蛋白与GM-CSF的协同免疫刺激作用，为增强宫颈癌治疗疫苗效果提供了新的方法。
[0031]依据现有在小鼠体内的实验结果，可以预见此种疫苗在人体内也能以同样的机制来激活对HPV病毒所表达抗原的特异性免疫反应，从而激发和强化特异性免疫细胞如T细胞对人乳头瘤病毒感染细胞及宫颈癌细胞的强大杀伤作用。鉴于此类疫苗所诱导的免疫反应是针对HPV病毒的二个关键癌蛋白，即E6和E7这二个长期表达并诱发被感染细胞慢性增生，最终导致癌变的二个癌抗原蛋白，因此此类疫苗可用于治疗HPV慢性感染所致的宫颈癌，宫颈癌前病变，宫颈增生以及其它与HPV慢性感染所致癌症如某些喉癌及口腔癌等坐寸O
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1.重组腺病毒的构建与鉴定a.利用Ad-easy系统制备相应重组腺病毒的5种cDNA结构模式图。b.Western blot检测重组腺病毒载体在HEK293细胞中的表达。腺病毒感染HEK293细胞，利用抗HPV16E7抗体检测外源基因表达。Ad-GFP作为阴性对照。c.Western blot检测相应的重组腺病毒在HEK293细胞中的GM-CSF表达。d.重组腺病毒Ad-E6E7hsp-GM表达的HPV18/16E6E7HSP融合蛋白在进行密码子优化后表达量较优化前有明显增加。
[0033]图2.T淋巴细胞增生实验。在E7多肽刺激下，相应重组腺病毒免疫小鼠脾细胞增生倍数。纵坐标为相对增生倍数，为E7多肽刺激脾细胞0.D.值比上未有E7多肽刺激脾细胞 0.D.值。n=3;bars, SE;星号表示 p〈0.05。
[0034]图3.ELISP0T实验。A.在E6多肽刺激下，相应重组腺病毒免疫小鼠IFN Y分泌脾细胞数。B.在E7多肽刺激下，相应重组腺病毒免疫小鼠IFNy分泌脾细胞数。纵坐标，每IO6脾细胞中的斑点形成细胞数量。n=3;bars，SE;星号表示p〈0.05。
[0035]图4.肿瘤浸润的T淋巴细胞。重组腺病毒免疫可增加肿瘤浸润的⑶8+和⑶4+T细胞数量。纵坐标为每个视野下CD4+或CD8+T淋巴细胞数量，经4个视野计数后的平均值。bars, SE;星号代表与对照Ad-GFP相比ρ〈0.05。
[0036]图5.重组腺病毒载体剂量实验。3种剂量相应的重组腺病毒分别免疫小鼠，进行ELISP0T实验，对IFNy分泌脾细胞数量进行对比。n=3;bars，SE。
【具体实施方式】
[0037]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0038]实施例1质粒构建与病毒包装
[0039]以 HPV18 型 E6 (Genbank access number:AF373109)、E7 (AF373110)及 HPV16型E6 (AB818691)、E7 (KC736931)和结核杆菌HSP (EU747334)基因为模本，以人的表达适应性进行密码子优化，并去除中间的终止密码子，依次拼接成一个融合基因开放读码框，由Genescript公司全序列合成。为了消除E6、E7的细胞恶变转化威胁，在HPV18及16的E6和E7蛋白的重要位点进行了点突变:18型E6蛋白(Glull6Gly;Lysll7Gly) ; 16型 E6 蛋 S (Glul21Gly;Lysl22Gly) ; 18 型 E7 蛋 S (Cys27Gly;Glu29Gly) ；E7 蛋白(Cys24Gly;Glu26Gly)0 HPV18&16/E6/E7 的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示，HPV18&16/E6/E7HSP的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。人源GM-CSF基因cDNA通过RT-PCR扩增获得(SEQ ID N0.4)。
[0040]Ad-Easy 腺病毒包装系统(购自 Agilent Technologies, SantaClara, California)用于生产5型重组腺病毒。首先，5种插入不同基因的带有CMV启动子的pshuttle质粒被构建出来:(l)pshuttle-E6E7 表达 HPV16E6 和 E7 融合蛋白；(2) pshuttle-E6E7hsp表达HPV16E6和E7及hsp融合蛋白；(3) pshuttle-E6E7_GM在前一种的基础上共表达人源 GM-CSF ；(4) pshuttle-E6E7hsp-GM 共表达 HPV18/16E6 和 E7 及 hsp 融合蛋白及人源GM-CSF ；(5)pshuttle-GFP表达eGFP作为对照(图la)。之后，按照常规方法，5种重组腺病毒被包装出来，分别为 Ad-E6E7，Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7_GM，Ad_E6E7hsp-GM 和 Ad-GFP。
[0041]实施例2重组外源蛋白表达检测
[0042]将实施例1制备的包装重组腺病毒感染人胚肾细胞293 (HEK293)细胞系购于美国典型生物储存中心(ATCC，Rockville, MD)，感染滴度为两个噬斑形成单位(pfu) /细胞。感染2天后，PBS清洗2次，然后用Laemmli裂解缓冲液裂解细胞，将总细胞蛋白通过煮沸5分钟变性，进行SDS电泳，再将蛋白电转到醋酸纤维素膜，并用相应的抗体进行检测:抗 HPV16E7 蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)和抗 GM-CSF 抗体(Biolegend, San Diego, CA)。显色使用增强的化学发光系统(ECL)。GM-CSF的ELISA检测试剂盒(Biolegend, San Diego, CA)被用来检测小鼠体内的GM-CSF浓度。
[0043]五种重组腺病毒按照标准方法进行制备并经过两次超速离心纯化。通过Western-Blots的方法，检测感染有重组病毒的293细胞上的外源基因表达。结果显示在预期分子量条带位置检测出表达条带，而在Ad-GFP感染的阴性对照样品中相应位置没有条带(图lb，c)。此结果表明HPV抗原相关的融合蛋白与GM-CSF得到了高效的表达。小鼠血清GM-CSF浓度经ELISA检测结果显示其浓度在注射5天后较对照组增高大约7倍，2个月后大约仍有1.5倍增高。
[0044]密码子优化后显著提高了 HPV抗原的表达效率，表达量与优化前相比提高3倍以上(图1d)。
[0045]实施例3体外淋巴细胞增殖实验和ELISP0T实验
[0046]雌性的 C57BL/6 小鼠(H_2b;6 - 8 周龄)购于 Jackson Lab (BarHarbor, MA)通过皮下注射 107pfu/ 只鼠的 Ad-E6E7, Ad_E6E7hsp，Ad-E6E7_GM、Ad_E6E7hsp-GM 和 Ad-GFP 病毒。4周后，分离培养小鼠脾细胞(I X IO5/孔)，每只小鼠的脾细胞分别与或不与10 μ g/ml的E7多肽共孵育5天。在第四天时加入BrdU。融合入细胞的BrdU含量通过Calbiochem细胞增殖试剂盒检测(Millipore，Billerica, MA)。检测结果表示为相对增殖倍数，其为含有E7多肽的0.D.读值与不含有E7多肽的0.D.读值通过对比换算而来。
[0047]进行ELISP0T实验通过特异针对E6和E7多肽的干扰素IFN Y分泌型T淋巴细胞计数，评估T细胞免疫反应。首先，雌性C57BL/6小鼠按上述方面免疫接种重组病毒。2-4周后，小鼠脾细胞在96孔板内分离培养，数量为IX IO5细胞/孔。每只小鼠培养细胞分别分为E6多肽刺激和E7多肽刺激组，分别刺激以2 μ g E648_57 (EVYDFAFRDL, H_2Db - restricted)多肽和E749_57 (RAHYNIVTF, H-2Db - restricted)多肽，未经多肽刺激的细胞为阴性对照。在37°C孵育24小时。之后，丢弃细胞，并用含0.5%吐温20的PBS (PBST)清洗3遍。再孵育以抗IFNy的酶标抗体,最后通过ACE底物显色。显色终止干燥后，IFN Y反应斑点通过ELISP0T计数仪计数，并进行分析。
[0048]通过T细胞增殖实验和ELISP0T实验结果可以在体外检测抗原特异性的T细胞免疫反应。在细胞增殖实验中，第五天相对细胞数量可以通过掺入细胞DNA的BrdU含量表现出来。所有接种有表达HPV抗原重组病毒的小鼠脾细胞在E7特异性多肽的刺激下增生显著高于阴性对照的Ad-GFP免疫的小鼠脾细胞(图2)。重组病毒Ad-E6E7hsp和Ad-E6E7_GM免疫的小鼠脾细胞比Ad-E67接种小鼠脾细胞的增殖倍数更高，并且，Ad-E6E7hsp-GM免疫小鼠获得了最高的增殖。ELISP0T实验结果可以显示抗原特异性的杀伤性T细胞免疫反应强度。结果显示，在E6多肽的刺激下，所有表达HPV抗原重组病毒免疫小鼠都获得了抗原特异性的杀伤性T细胞免疫反应。具体表现为，Ad-E6E7hsp，Ad-E6E7-GM和Ad_E6E7hsp-GM免疫小鼠的IFN Y分泌型脾细胞数量远高于Ad-E6E7接种小鼠，并且，Ad_E6E7hsp-GM免疫小鼠具有最高的IFNy分泌型脾细胞数量(图3A)。在E7多肽刺激下，IFNy分泌型脾细胞分布的相对结果与E6多肽刺激的结果类似，只是每组的绝对数值远高于E6多肽的刺激。这表明，在小鼠中E7多肽激发的杀伤性T细胞免疫反应也远高于E6多肽激发的强度(图3B)。综上所述，T细胞增殖实验和ELISPOT实验的结果比较一致地反映出HSP和GM-CSF分别可以单独或协同增强E6E7抗原特异性的T淋巴细胞免疫反应。
[0049]实施例4肿瘤浸润T淋巴细胞分析
[0050]C57BL/6小鼠接种TC-1细胞(转化有HPV16型E6和E7癌抗原的C57BL/6小鼠肿瘤细胞，是一种最常用的宫颈癌模型用细胞系，受赠于T.C.Wu教授Johns HopkinsUniversity)。C57BL/6小鼠TC-1细胞生长于含有10%胎牛血清(FBS)和50U/ml双抗的RPMI1640完全培养基，其它细胞生长于DMEM完全培养基(Gibco)，待皮下肿瘤长至约5毫米直径，再分别皮下免疫接种 I X IO7 的 Ad-E6E7，Ad_E6E7hsp，Ad-E6E7_GM，Ad_E6E7hsp-GM和Ad-GFP重组腺病毒。7天后收集肿瘤进行H&E染色和抗⑶4+和⑶8+细胞的免疫荧光分析。具体步骤如下，取出的肿瘤组织经过冰冻，OCT包埋，切割为5.0ym厚的切片，经4%丙酮固定后10%马血清封闭30分钟。后于室将其温孵育抗小鼠⑶4及⑶8抗体(BD Bioscience, San Jose, CA) I 小时，经 PBS 清洗后与 2mg/mL 羊抗大鼠的二抗 Alexa647(Invitrogen, Carlsbad, CA)孵育,后经DAPI染核,和显微镜分析。计数4个视野下的阳性细胞数，以均数土标准误标记并进行统计分析。
[0051]当荷瘤小鼠肿瘤直径达到5mm左右时， 小鼠接受不同重组腺病毒免疫治疗，7天后将肿瘤取出做组织学分析，评价不同病毒免疫的小鼠肿瘤T淋巴细胞浸润程度。CD8+细胞染色结果显示，接受表达HPV抗原的重组病毒小鼠其肿瘤组织内较接受Ad-GFP免疫的阴性对照小鼠有更多的⑶8+T淋巴细胞浸润(图4)。而融合HSP的融合蛋白与GM-CSF分别表达或共表达的载体均可以显著增强荷瘤小鼠⑶8+T淋巴细胞浸润(图4)。⑶4+细胞染色结果显示，接受有GM-CSF表达的重组腺病毒免疫小鼠的肿瘤组织中⑶4+T淋巴细胞浸润数量显著增多。然而，接受HSP融合蛋白表达的小鼠，其肿瘤组织中表达⑶4+T细胞数量并未比Ad-E6E7和Ad-GFP免疫小鼠有显著增多，虽然HSP能显著增加⑶8+T淋巴细胞浸润(图4)。
[0052]实施例5重组腺病毒免疫剂量实验
[0053]三种剂量的Ad-E6E7，Ad_E6E7hsp，Ad-E6E7_GM，Ad_E6E7hsp-GM 和 Ad-GFP 分别用来免疫小鼠，剂量为2 X IO5,1 X IO6和I X 107pfu/只。免疫四周后小鼠被处死，收集脾细胞进行ELISPOT实验。通过对各种重组腺病毒不同剂量免疫小鼠的脾细胞IFNy反应斑点进行读取分析，判定不同剂量诱导的T细胞免疫强度。
[0054]为了判定不同重组病毒在不同剂量下激发T细胞免疫反应能力，我们进行了剂量实验。在2X IO5和IXlO6Pfu/只的低剂量条件下，依据IFNy分泌细胞数量，重组病毒Ad-E6E7-GM和Ad-E6E7hsp-GM诱发较其他种类病毒较强的T细胞免疫反应，并且Ad-E6E7hsp-GM诱导最强的T细胞免疫反应。在I X 107pfu/只的高剂量条件下，所有表达HPV抗原的重组病毒都能有效的激发免疫反应。有趣的是，Ad-E6E7hsp重组病毒免疫小鼠较Ad-E6E7-GM免疫小鼠有更多数量的IFN Y分泌性脾细胞。而Ad_E6E7hsp-GM免疫组仍然拥有最多数量的IFNy分泌性脾细胞(图5)。此结果表明，GM-CSF的表达可以有效增强低剂量组的T细胞免疫反应，而HSP融合蛋白则在高剂量情况下起更好的作用。如果二者同时表达则可获得协同效应。
[0055]GM-CSF增强低剂量杀伤性T淋巴细胞免疫反应，可以使用较低剂量取得较好的免疫效果，降低可能的副反应。
[0056]实施例6小鼠体内肿瘤治疗实验
[0057]本实验为评价重组腺病毒治疗效果最为重要的实验。首先，受试小鼠均在皮下接种I X IO5/只的TC-1细胞，大约9天左右，小鼠皮下形成可触及肿瘤包块，随后皮下注射 Ad-E6E7，Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7_GM，Ad_E6E7hsp-GM 和 Ad-GFP，剂量分别采用 I X IO6 和I X 107pfu/K ο初次治疗2周后，再以相同剂量加强免疫。初次治疗2个月后，所有肿瘤被清除的小鼠再次以相同TC-1细胞接种。每3天对小鼠的肿瘤观察一次，持续4个月。通过对不同重组病毒接种小鼠的肿瘤发生率和肿瘤体积进行对比，以确定不同重组腺病毒的治疗和肿瘤清除效果。
[0058]以上肿瘤治疗实验结果表明，不同重组病毒在体内对瘤细胞的清除能力各异。我们依据前期剂量试验的结果，以IXlO6和IXlO7Pfu/只这两种剂量用于治疗实验。在
IX IO6Pfu/只的剂量条件下，经过治疗后2个月，对照组所有5只Ad-GFP治疗的小鼠全部生成肿瘤。10只Ad-E6E7治疗小鼠仅2只免于荷瘤，10只Ad-E6E7hsp治疗小鼠6只免于荷瘤，10只Ad-E6E7-GM治疗小鼠5只免于荷瘤，而10只Ad_E6E7hsp-GM治疗小鼠7只免于荷瘤。该结果表明后者的治疗效果最佳。另外，在IXlO7Pfu/只的剂量条件下，经过两个月，对照组所有5只Ad-GFP治疗小鼠全部生成肿瘤，而Ad-E6E7治疗小鼠5只中有4只免于荷瘤。并且，经Ad-E6E7hsp，Ad-E6E7-GM和Ad_E6E7hsp-GM治疗的小鼠全部免于荷瘤(表1)。此外，在相同时间内，Ad-E6E7hsp治疗的荷瘤小鼠肿瘤尺寸也小于Ad-E6E7治疗小鼠(结果未出示)。初次治疗2月后，所有未荷瘤小鼠再次接种TC-1肿瘤细胞。直到半年实验结束，再次接种肿瘤的小鼠仍全部免于荷瘤。综上结果显示，HSP和GM-CSF可以单独也可协同作用而达到增强HPV特异的T细胞 免疫反应，进而清除小鼠体内肿瘤并防止复发。
[0059]结果表明以HSP和GM-CSF的协同治疗作用为最佳。
[0060]表1肿瘤治疗实验中的未成瘤小鼠率
[0061]
【权利要求】
1.一种人乳头瘤病毒及免疫增强分子五基因型融合抗原，其含有人乳头瘤病毒16型的E6、E7蛋白和人乳头瘤病毒18型的E6、E7蛋白及免疫增强分子佐剂蛋白。
2.如权利要求1所述的融合抗原，其特征在于，其具有下述一或多个突变位点，其中，所述的人乳头瘤病毒16型E6蛋白的突变位点为:121位的谷氨酸突变为甘氨酸；122位的赖氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒16型E7蛋白的突变位点为:24位的半胱氨酸突变为甘氨酸；26位的谷氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒18型E6蛋白的突变位点为:116位的谷氨酸突变为甘氨酸；117位的赖氨酸突变为甘氨酸；所述的人乳头瘤病毒18型E7蛋白的突变位点为:27位的半胱氨酸突变为甘氨酸；29位的谷氨酸突变为甘氨酸。
3.如权利要求1或2所述的融合抗原，其特征在于，所述的免疫增强分子佐剂蛋白为原核生物或哺乳动物热休克蛋白，优选为结核杆菌的热休克蛋白。
4.一种表达权利要求1~3任一项所述融合抗原的重组基因表达载体。
5.如权利要求4所述的重组基因表达载体，其特征在于，其携带有表达权利要求1~3任一项所述的融合抗原的表达盒，以及表达免疫刺激因子的表达盒。
6.如权利要求5所述的重组基因表达载体，其特征在于，所述的免疫刺激因子为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干扰素或细胞趋化因子，优选为粒单核细胞集落刺激因子 GM-CSF。
7.如权利要求4-6任一项所述的重组基因表达载体，其特征在于，其携带核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的DNA片段。
8.如权利要求4-6任一项所述的重组基因表达载体，其特征在于，其为重组腺病毒载体、重组腺相关病毒载体、重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体、重组疱疹病毒载体、重组痘苗病毒载体或重组仙台病毒载体。
9.如权利要求4-6任一项 所述的重组基因表达载体，其特征在于，其为非病毒载体，所述非病毒载体选自裸DNA载体、纳米颗粒，多聚物或脂质体。
10.一种治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的药物制剂，其包含治疗有效量的权利要求I~3任一项所述的融合抗原,或包含治疗有效量的权利要求4-9任一项所述的重组基因表达载体。
11.如权利要求10所述的药物制剂，其特征在于，其包含治疗有效量的权利要求1~3任一项所述的融合抗原以及免疫刺激因子。
12.如权利要求11所述的药物制剂，其特征在于，所述的免疫刺激因子为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干扰素或细胞趋化因子，优选为粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF。
13.—种重组腺病毒，其特征在于，其携带权利要求4-9任一项所述的重组基因表达载体。
14.权利要求1-3任一项所述的融合抗原、权利要求4-9任一项所述的重组基因表达载体、权利要求10-12任一项所述的药物制剂、权利要求13所述的腺病毒在制备治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒感染引起的疾病属于与HPV慢性感染相关的疾病，优选宫颈癌、阴茎癌、肛门癌、喉癌、口腔癌、头颈部癌、宫颈癌前病变和/或宫颈增生。
【文档编号】C12N15/861GK103772508SQ201410017909
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】边涛, 刘娟, 肖啸 申请人:南京勉益生物药业有限公司