病毒的细胞许可因子及其用途的制作方法

专利名称：病毒的细胞许可因子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了与产生许可Asfarviridae和动脉炎病毒科(Arteriviridae)病毒生长的宿主细胞有关的方法和组合物。
背景技术：
AsfarviridaeAsfarviridae是一种十二面体包膜病毒科，其基因组由长约150000-190000个核苷酸的线性双链DNA的单个分子组成。该科的名称由非洲猪瘟和相关病毒(African Swine Fever And Releted Viruses)派生而来。非洲猪瘟病毒(ASFV)是Asfivirus属的模式种并且是该科的唯一成员。近来，猪CD163多肽已被暗示推测为非洲猪瘟病毒(ASFV)的细胞受体(Sanchez-Torres et al.，2003)动脉炎病毒科动脉炎病毒科的病毒包括马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢酶升高病毒(LDV)和猿出血热病毒(SHFV)。具有最大经济学重要性的动脉炎病毒是猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)。
PRRSV猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)是猪经济学上最重要的疾病之一。20世纪80年代后期，该综合征几乎同时在北美和西欧出现，并且已自此在欧洲、亚洲和美洲的主要猪生产国蔓延变为地方病。PRRS的病源性因子是已被命名为PRRS病毒或PRRSV的病毒。对于欧洲和北美PRRS，该疾病特征为母猪和小母猪繁殖失败(新近术语流产、死产和干尸)、在幼猪当中高死亡率和所有年龄的猪中的呼吸道疾病。该疾病已是近来综述的主题(Mengeling and Lager，2000；Murtaugh et al.，2002；Nodelijk，2002；Plagemann，2003)。
在猪中，PRRSV感染限于单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞亚型。完全分化的猪肺泡巨噬细胞(PAM)细胞是病毒复制的主要靶细胞(Duanet al.，1997a；Duan et al.，1997b)。PAM细胞的无限增殖化是技术上的挑战，而且当成功时，产生不许可PRRS病毒生长的细胞系(Weingartl et al.，2002)。PRRS病毒粒体被巨噬细胞特异性结合并通过内吞作用内在化在网格蛋白包被的凹陷中。从内吞囊泡释放需要酸性pH(Nauwynck et al.，1999)。病毒粒体的最初结合由病毒基质蛋白与硫酸肝素粘多糖的相互作用来介导(Delputte et al.，2002)。210或220kDa膜糖蛋白可以促进内在化，因为PAM细胞与这些多肽的单克隆抗体的孵育阻断感染PRRS病毒(Duan et al.，1998；Wissink et al.，2003)。210kDa糖蛋白近来被鉴定为唾液酸粘附素-唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素的siglec家族的成员(Pensaert etal.，2003)。用猪唾液酸粘附素转染非许可PK-15(猪肾)细胞系赋予内在化PRRSV颗粒的能力，但是在脱壳阶段保持明显的阻断，因为病毒粒体进入细胞囊泡，但是不经历核壳分解和囊泡膜融合。病毒基因不表达，而且转染的PK-15细胞不为PRRS病毒提供许可(Vanderheijden et al.，2003)。据我们所知，用唾液酸粘附素转染并未显示足以将任何PRRSV非许可型细胞系转换为PRRSV许可表型。
除单核细胞/巨噬细胞谱系的主要猪细胞之外，已知许可PRRSV在细胞培养中生长的唯一其它细胞类型是无限增殖化的猴肾细胞系MA-104(Chladek et al.，1998)及其衍生物如MARC-145(Kim et al.，1993)和CL-2621。不知道为什么这一个特殊细胞系是许可型，而其它哺乳动物细胞系不是。PRRS病毒特异性结合许多不同的细胞类型，但是不启动感染(Kreutz，1998；Therrien et al.，2000)。在MARC-145细胞中，病毒通过内吞作用内在化和随后在低pH囊泡中脱壳似乎模拟PAM细胞中的相似事件(Kreutz and Ackermann，1996)。然而，与猪唾液酸粘附素结合的许多单克隆抗体没能在MARC-145细胞表面上检测到同源蛋白(Duan et al.，1998；Wissink et al.，2003)，提示MARC-145细胞可能使用相同蛋白家族的不同成员或完全不同的受体。
当前的PRRSV疫苗在猿细胞系繁殖，这是潜在危险的活动。使用猿细胞系制备疫苗有可能将有重大意义的灵长类病毒引入为异种移植目的设计的猪系。因为猪正日益被研究作为人的异种移植器官的来源，灵长类细胞系引入猪群体可能最终给接受异种移植器官的人造成风险。因此，将谨慎在猪疫苗制剂中避免使用猿细胞系。因此鉴定或产生能够支持PRRSV复制的非猿细胞或细胞系将合乎需要。为了这个目的，有必要鉴定可能负责赋予如某些猿细胞系以及PAM细胞中所见的PRRSV复制许可的基因产物。一旦鉴定了这种基因产物，非许可型细胞通过用必需基因转染它们有可能改变成许可型，由此提供更广阔的疫苗生产系。
一个实验室已经报道了来自MARC-145细胞的tetraspanin蛋白CD151，当转染到非许可性BHK-21细胞时，赋予PRRS病毒许可性(Kapiland Shanmukhappa，2003；Shanmukhappa and Kapil，2001)。这个观察结果还有待在独立实验室证实。
我们这里描述了不相关的多肽，其在转染至非许可型细胞时，赋予PRRS病毒许可性。
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发明概述本发明包括促进病毒感染一个或多个细胞的方法，该病毒选自动脉炎病毒科(Arteriviridae)和Asfarviridae，该方法包括引导所述细胞内CD163多肽表达增加的步骤。在优选实施方案中，CD163是膜结合的。在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。
CD163多肽表达增加可以通过诸如引入编码CD163多肽的外源核酸的方法完成，这种方法包括但不限于转染、电穿孔和与包含编码CD163多肽的多核苷酸的多核苷酸的载体融合。表达增加还可以通过化学处理诱导内源CD163表达来完成。
该方法可以致使以前非PRRSV许可型细胞许可PRRS。该方法还可以包括致使以前不表达CD163多肽的一个或多个细胞变为被诱导表达CD163多肽的细胞。
在优选实施方案中，该细胞是动物细胞。它们可以是脊椎动物或无脊椎动物细胞。该细胞可以是哺乳动物的。该细胞或细胞系可以是昆虫细胞系。该细胞可以是BHK21细胞。该细胞可以来源于猪肾细胞。该细胞或细胞系可以来源于猫肾细胞。该细胞或细胞系可以是但不限于BHK-21、NLST-1、NLFK-1、Vero或RL细胞。PRRSV可以是欧洲或北美基因型。
如上所述，CD163多肽的表达增加可以通过包括但不限于以下的方法来完成转染、电穿孔和与包含编码CD163多肽的多核苷酸的多核苷酸的载体融合。包括任何CD163多肽。优选含有跨膜区的那些多肽。示例的CD163多肽选自下列多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO2具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多20个保守氨基酸置换而与SEQID NO2不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO2不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO1所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO14所述多肽具有至少99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO14不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO14不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO14的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO13所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多2个保守氨基酸置换而与SEQID NO24不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO24的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO23所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO27所述多肽具有至少96％、97％、98％或99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多20个保守氨基酸置换而与SEQID NO27不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO27不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO27的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO26所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO32所述多肽具有至少98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO32不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO32不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO32的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO31所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO34所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO34不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO34不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO34的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO33所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO36所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO36不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO36不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO36的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO35所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO42所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO42不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO42不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO42的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO41所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO44所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO44不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO44不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO44的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO43所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO46所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO46不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO46不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO46的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO45所述序列的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO48所述多肽具有至少90％、91、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO48不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO48不同的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO48的多肽的多核苷酸。
一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO47所述序列的多核苷酸。
如上所述促进感染的方法可以进一步包括制备病毒培养物的步骤。
本发明进一步包含通过如上所述方法分离的培养物。
如上所述的任何方法可以进一步包括制备PRRS或其它病毒疫苗的步骤。该疫苗可以是灭活的或减毒活疫苗。
本发明还包括细胞或细胞系，其中一个或多个细胞被选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的能力通过引导所述细胞内CD163多肽表达增加而被改变。
在优选实施方案中，CD163多肽包含跨膜区。在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。
本发明的细胞或细胞系可能以前是PRRSV非许可型并通过引导所述细胞或细胞系内CD163多肽表达增加致使变为PRRSV许可型细胞或细胞系。
本发明的细胞或细胞系包括不表达CD163多肽并且被诱导表达CD163多肽的细胞或细胞系。
在优选实施方案中，该细胞是动物细胞。它们可以是脊椎动物或无脊椎动物细胞。该细胞可以是哺乳动物的。该细胞或细胞系可以是昆虫细胞或细胞系。该细胞可以是BHK21细胞。该细胞可以来源于猪肾细胞。该细胞或细胞系可以来源于猫肾细胞。该细胞可以是但不限于BHK-21、NLST-1、NLFK-1、Vero或RL细胞。PRRSV可以是北美或欧洲的。
本发明包括测定试验细胞或细胞系允许选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的倾向的方法，该方法包括a)提供含有来自试验细胞或细胞系的核酸的样品；b)测定所述样品中编码CD163多肽的多核苷酸或其互补链的量；其中编码CD163多肽的多核苷酸相对于来源于已知不支持所述病毒生长的对照细胞或细胞系的对照样品增加的量表明试验细胞或细胞系支持所述病毒复制的倾向。
在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。
编码CD163多肽的多核苷酸的量可以通过杂交测定。
编码CD163多肽的多核苷酸的量可以通过PCR测定。
本发明还包括测定试验细胞或细胞系允许选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的倾向的方法，该方法包括(a)提供含有来自试验细胞或细胞系的多肽的样品；(b)测定所述样品中CD163多肽的量；其中CD163多肽相对于来源于已知不支持所述病毒生长的对照细胞或细胞系的对照样品增加的量表明试验细胞或细胞系支持所述病毒复制的倾向。
在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。
在一个实施方案中，通过使CD163多肽在CD163多肽的特异性抗体结合CD163多肽的条件下接触该抗体完成测定。
本发明包括测定猪被选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的倾向的方法，该方法包括a)提供含有来自待试验猪的核酸的样品；b)测定所述样品中编码CD163多肽的多核苷酸或其互补链的量；其中编码CD163多肽的多核苷酸相对于来源于已知对所述病毒感染有抗性的猪的对照样品增加的量表明待试验猪被所述病毒感染的倾向。
在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。
在一个实施方案中，通过杂交完成该测定。在另一个实施方案中，通过PCR完成该测定。
本发明还包括测定猪被选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的倾向的方法，该方法包括(a)提供含有来自待试验猪的多肽的样品；(b)测定所述样品中CD163多肽的量；其中CD163多肽相对于来源于已知对所述病毒感染有抗性的猪的对照样品增加的量表明待试验猪被所述病毒感染的倾向。
在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。
在一个实施方案中，通过使CD163多肽在CD163多肽的特异性抗体结合CD163多肽的条件下接触该抗体完成测定。
本发明还包括分离的多肽，其中该多肽选自如下所述的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO2具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多20个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO2不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO2不同的多肽。
一个这种多肽包含SEQ ID NO2。
因此本发明还包括与SEQ ID NO14所述多肽具有至少99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO14不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO14不同的多肽。
一个这种多肽包含SEQ ID NO14。
因此本发明还包括经至多2个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO24不同的分离的多肽。
一个这种多肽包含SEQ ID NO24。
因此本发明还包括与SEQ ID NO27所述多肽具有至少96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多20个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO27不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO27不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO27的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO32所述多肽具有至少98％、99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO32不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO32不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO32的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO34所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO34不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO34不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO34的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO36所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO36不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO36不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO36的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO38所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO38不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO38不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO40的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO40所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO40不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO40不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO40的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO42所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO42不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO42不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO42的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO44所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO44不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO44不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO44的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO46所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO46不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO46不同的多肽。
一个这种多肽是包含SEQ ID NO46的多肽。
因此本发明还包括与SEQ ID NO48所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。
一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO48不同的多肽。
一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO48不同的多肽。
一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO48的多肽的多核苷酸。
本发明还包括分离的CD163多核苷酸，其中所述多核苷酸选自以下列举的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs1或5所述的多核苷酸序列，(b)编码与SEQ ID NO2所述多肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸，(c)编码SEQ ID2的多肽的多核苷酸，(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs12或13所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO14所述多肽具有至少99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID14的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NO s22或23所述的多核苷酸序列(b)编码SEQ ID24的多肽的多核苷酸(c)与(a)或(b)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs25或26所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO27所述多肽具有至少96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID27的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs30或31所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO32所述多肽具有至少98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID32的多肽的多核苷酸
(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs33所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO34所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID34的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs35所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO36所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID36的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs37所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO38所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID38的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs39所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO40所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID40的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs41所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO42所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸
(c)编码SEQ ID42的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs43所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO44所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID44的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs45所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO46所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID46的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含(a)SEQ ID NOs47所述的多核苷酸序列(b)编码与SEQ ID NO48所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸(c)编码SEQ ID49的多肽的多核苷酸(d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。
因此本发明还包括跨膜区被缺失的CD163多肽。
因此本发明还包括编码跨膜区被缺失的CD163多肽的多核苷酸。
除上文之外，本发明在另外的方面包括以任何方式比上面具体提及的变型的范围窄的本发明的全部实施方案。
序列表简述
SEQ ID NO1-编码猪susCD163v1的cDNA序列SEQ ID NO2--预测的猪susCD163v1的氨基酸序列SEQ ID NO3--cDNA序列，Genbank登录号AJ311716SEQ ID NO4---预测的氨基酸序列，来源于Genbank登录号AJ311716SEQ ID NO5-含有侧翼(非编码)序列的susCD163v1的cDNA序列。
SEQ ID NO6-11---引物序列SEQ ID NO12---含有侧翼(非编码)序列的编码猪susCD163v2的cDNA序列。
SEQ ID NO13--编码猪susCD163v2的cDNA序列SEQ ID NO14---预测的猪susCD163v2的氨基酸序列SEQ ID NO15-16---引物序列SEQ ID NO17---含有侧翼(非编码)序列的编码人CD163v2的cDNA序列。
SEQ ID NO18--编码人CD163v2的cDNA序列SEQ ID NO19--预测的人CD163v2的氨基酸序列SEQ ID NO20-21---引物序列SEQ ID NO22---含有侧翼(非编码)序列的编码鼠CD163v2的cDNA序列。
SEQ ID NO23--编码鼠CD163v2的cDNA序列SEQ ID NO24--预测的鼠CD163v2的氨基酸序列SEQ ID NO25---含有侧翼(非编码)序列的编码鼠CD163v3的cDNA序列。
SEQ ID NO26--编码鼠CD163v3的cDNA序列SEQ ID NO27--预测的鼠CD163v3的氨基酸序列SEQ ID NO28-29---引物序列SEQ ID NO30---含有侧翼(非编码)序列的编码MARC-145CD163v3的cDNA序列。
SEQ ID NO31---编码MARC-145CD163v3的cDNA序列SEQ ID NO32---预测的MARC-145CD163v3的氨基酸序列SEQ ID NO33--编码Vero细胞CD163v2转录物的cDNA序列SEQ ID NO34--预测的Vero细胞CD163v2的氨基酸序列SEQ ID NO35--编码Vero细胞CD163v3转录物的cDNA序列SEQ ID NO36--预测的Vero细胞CD163v3的氨基酸序列SEQ ID NO37--编码Vero细胞CD163v4转录物的cDNA序列SEQ ID NO38--预测的Vero细胞CD163v4的氨基酸序列SEQ ID NO39--编码Vero细胞CD163v5转录物的cDNA序列SEQ ID NO40--预测的Vero细胞CD163v5的氨基酸序列SEQ ID NO41--编码Vero细胞CD163v6转录物的cDNA序列SEQ ID NO42--预测的Vero细胞CD163v6的氨基酸序列SEQ ID NO43--编码Vero细胞CD163v7转录物的cDNA序列SEQ ID NO44--预测的Vero细胞CD163v7的氨基酸序列SEQ ID NO45--编码犬CD163v2转录物的cDNA序列SEQ ID NO46--预测的犬CD163v2的氨基酸序列SEQ ID NO47--编码犬CD163v3转录物的cDNA序列SEQ ID NO48--预测的犬CD163v3的氨基酸序列附图简述

图1susCD163v1与AJ311716的示意图比较图2susCD163v1(SEQ ID NO2)与AJ311716(SEQ ID NO4)的氨基酸序列比对图3susCD163v1与AJ311716的核苷酸序列比对图4DNA片段的产生和连接以将CD163直接放置于RSV启动子之后。用DraIII或DrdI消化质粒，之后用Klenow酶发生平端反应。清洗后，用NotI消化质粒。凝胶纯化产生DNA片段，随后利用粘性NotI末端连接。来自RSV(pRSV)和SV40(pSV40)的启动子用箭头表示。
图5pCDNA3.1定向V5/His/TOPO克隆载体的6用PRRSV分离株P129感染三个BHK/CMV/v1细胞系#3、#5和#12以及非许可BHK细胞系并用SDOW17-FITC染色。A图显示非许可BHK21细胞克隆。B图显示BHK/CMV/v1克隆#3。C图显示BHK/CMV/v1克隆#5。D图显示BHK/CMV/v1克隆#12。
图7用PRRSV分离株P129感染三个BHK/RSV/v1细胞系#2、#3和#4，并用SDOW17-FITC染色。A图显示BHK/RSV/v1克隆#2。B图显示BHK/RSV/v1克隆#3。C图显示BHK/RSV/v1克隆#4。
图8稳定表达猪CD163v1的猫肾细胞系，显示PRRSV噬斑。用北美PRRSV分离株P129感染都在第4代的细胞系NLFK-CMV-susCD163v1-G4F和NLFK-CMV-susCD163v1-G4L并培养6天。用80％丙酮固定单层并用单克隆抗体SDOW17-FITC染色。相差显微技术(右)显示病毒CPE(噬斑)的定位区，而FA检测(左)显示病毒核壳抗原的共同定位。
图9用PRRSV分离株P129感染四个FK/RSV/v1细胞系#1、#2、#3和#4，并用单克隆抗体SDOW17-FITC染色。A图显示FK/RSVv1#1细胞克隆。B图显示FK/RSV/v1克隆#2。C图显示FK/RSV/v1克隆#3。D图显示FK/RSV/v1#4。
图10用PRRSV分离株P129感染19代的PK-CMV-susCD163v1-A10细胞。左用80％丙酮固定单层并用对于PRRSV核壳特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies Inc)染色。右亮视野照明下相同孔，显示细胞分布。
图11用PRRSV分离株P129感染17代的BHK-CMVScript-susCD163v2-A9。用80％丙酮固定单层并用对于PRRSV核壳特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural TechnologiesInc)染色。
图12BHK/RSV/v2细胞系的三个代表性实例。用PRRSV分离株P129感染细胞并随后用SDOW17-FITC染色。A图显示细胞系BHK/RSV/v2#1，B图显示细胞系BHK/RSV/v2#34，和C图显示细胞系BHK/RSV/v2#47。
图13用PRRSV分离株P129感染15代的FK-cDNA 3.1D-humCD163v2-A6。然后用80％丙酮固定单层并用对于PRRSV核壳特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(RuralTechnologies Inc)染色。
图14使用PRRSV的NVSL94-3分离株，以生长曲线实验测定由稳定表达susCD163v1的四个重组细胞系和MARC-145细胞产生的子代PRRSV的量。以12小时间隔收获的样品在MARC-145细胞单层上滴定。
图15CD163特异性抗体存在下，PRRSV感染的流式细胞术分析。由瞬时转染而表达MARC-145CD163的BHK-21细胞与CD163特异性抗体或正常山羊IgG(NGS)孵育并用表达GFP的PRRSV感染。每个数据点表示一式三份的孔的结果。
图16CD163特异性抗体存在下，PRRSV感染的流式细胞术分析。稳定表达人CD163的NLFK细胞与CD163特异性抗体或正常山羊IgG(NGS)孵育并用表达GFP的PRRSV感染。感染24小时后，测定表达GFP的受感染细胞的百分比。每个数据点表示细胞单一孔的结果。
图17.从Vero细胞回收的CD163mRNA的六个可变剪接变异体的图形描述。六个变异体在存在或缺少三个外显子(命名为E6、E105和E83)方面不同。外显子E6和E105长度是三的倍数，因此当缺乏时不引起阅读框改变。相比之下，E83的缺乏引起阅读框移动和蛋白羧基末端的可变氨基酸序列(在图中用阴影图案表示)。疏水跨膜(TM)区编码在E105内。
图18.用PRRSV分离株P129感染的PK-RSVScript-susCD163v2#9细胞。来自PRRSV分离株P201感染的PAMs的未稀释上清液用于感染PK-RSVScript-susCD163v2#9细胞。培养两天后，如实施例11所述固定细胞并用单克隆抗体SDOW17染色。
图19.用PRRSV分离株P129感染的FK-RSVScript-susCD163v2#51细胞。来自PRRSV分离株P201感染的PAMs的未稀释上清液用于感染FK-RSVScript-susCD163v2#51细胞。感染两天后，如实施例11所述丙酮固定细胞并用单克隆抗体SDOW17染色。
图20.用PRRSV分离株P201感染PK-RSVScript-susCD163v2克隆#9细胞。A图显示用PRRSV P201感染二十四小时后的第1代细胞单层。B图显示用无细胞上清液PRRSV P201感染后2天的第10代细胞单层。
图21.检测NLFK亲本细胞和FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6的一个亚克隆的CD163表达。80％丙酮固定细胞并与山羊抗人CD163(R&DSystem；1∶200)反应一个小时，随后用PBS洗涤。对于显象，使用与偶联FITC的驴抗山羊IgG(Biodesign Inc，1∶100)。在NLFK亲本细胞中没有检测到特异性荧光，如图21A所示。大多数FK.A6.A2亚克隆显示好的荧光染色，表明CD163的存在(图21B)。
发明详述一般的定义细胞和细胞系可以是“病毒许可型”或“非病毒许可型”。例如，病毒许可型细胞或细胞系能够允许病毒感染、随后的复制和病毒产生。非病毒许可型细胞或细胞系不能允许病毒感染、随后的复制和病毒产生。已经在某种程度上许可的细胞系通过本发明的方法可致使更许可。
动脉炎病毒科是指属于Nidovirales目的有包膜、正链RNA病毒科。该科包括小鼠乳酸脱氢酶病毒(lactatedehydrogenase-elevating virus，LDV)、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)和PRRSV。
Asfarvidae是icosohedral、有包膜病毒科，其基因组由长约150000-190000个核苷酸的线性双链DNA的单个分子组成。该科的名称由非洲猪瘟和相关病毒派生而来。非洲猪瘟病毒(ASFV)是Asfivirus属的模式种并且是该科的唯一成员。
术语“PRRSV”或PRRS病毒是指欧洲和北美PRRS病毒基因型。每个基因型内，分离株典型地共享85％或更高的核苷酸同一性。然而在基因型之间，序列同一性水平仅约60％。
PRRS病毒是动脉炎病毒科的成员。动脉炎病毒基因组是正极性的单链RNA，长度在12和16kb之间、5′端加帽和3′端聚腺苷酸化。基因组三分之二以上用作开放读框(ORFs)1a和1b，它们编码该病毒的非结构功能。ORF1b是ORF1a的延伸，是核糖体移码的结果。ORFs1a和1b直接从基因组RNA翻译而来。这些大的多肽产物被病毒蛋白酶切割产生12个或13个分开的较小肽。编码病毒结构蛋白的剩余ORFS由一系列3′共同末端亚基因组RNAs(sgRNAs)表达。sgRNAs由负链RNA不连续转录产生，以致共同的5′前导序列变得与每个转录物融合。主要结构蛋白是核壳(N，由ORF7编码)、基质蛋白(M，由ORF6编码)和主要包膜糖蛋白(GP5，由ORF5编码)。剩余蛋白GP4(ORF4)、GP3(ORF3)、GP2(ORF2a)和E(ORF2b)是病毒粒体的次要结构组分，其功能还未被阐明。PRRSV的分子生物学已是最近的综述(Dea et al.，2000；Meulenberg，2000；Snijder and Meulenberg，2001)的主题。
本文使用的术语“CD163多肽”意思是由哺乳动物CD163基因编码的蛋白，包括含有保守或非保守改变的等位变异体。已经报道了编码猪CD163多肽的cDNA序列(Genbank登录号AJ311716)。也已报道了鼠CD163多肽(Genbank登录号AF274883)，以及多个人变异体，Genbank登录号AAH51281和CAA80543是示例。我们在本文报道了编码猪、人、鼠、犬和非洲绿猴CD163多肽的多核苷酸，其包含SEQ IDNO 1、5、12、13、17、18、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、42、43、45和47所述序列。“CD163多肽”是清除性受体富含半胱氨酸(SRCR)家族跨膜糖蛋白的成员，并被认为仅在单核细胞和巨噬细胞上表达。CD163的一个确定作用是通过内吞作用消耗血红蛋白结合珠蛋白复合物，来抑制溶血后氧化组织损伤。白介素-10的随后释放和血红素加氧酶-1的合成引起抗炎和细胞保护作用(Philippidis et al.，2004；Graversen et al.，2002)。人CD163基因跨越染色体12上的35kb并由17个外显子和16个内含子组成。CD163多肽的很多同工型，包括膜结合型、胞质型和分泌型，已知通过可变剪接产生(Ritter et al.，1999)。特别优选包含跨膜结构域的同工型。
跨膜结构域的特征为暴露于膜两面的较大序列的多肽片段。胞质和胞外域被至少一个横越脂质双分子层疏水环境的跨膜片段分隔开。跨膜片段由具有非极性侧链的氨基酸残基组成，通常是α螺旋形式。含有约20-30个疏水残基的片段长度足以如α螺旋跨越膜，和它们常常可以通过亲水性图鉴定。SEQ ID NO2和14的预测跨膜结构域在说明书中用粗体表示。为了确定其它CD163序列是否含有相似序列，通过序列检测或亲水性图可容易地确定该特征。SEQ ID NOS37-40是代表性的变异CD163蛋白它不含有跨膜结构域及其编码核酸。
在下文使用的“多核苷酸”泛指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单和双链DNA、单和双链区混合DNA、单和双链RNA、单和双链区混合RNA、和包含单链或更典型双链的或单和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA的三链区。术语“多核苷酸”也包括含有一个或多个修饰碱基的DNAs或RNAs和具有为稳定性或其它理由而修饰的主链的DNAs或RNAs。“修饰”碱基包括例如三苯甲基化碱基和稀有碱基如肌苷。DNA和RNA可以进行各种修饰；因而“多核苷酸”包含如在自然界中典型发现的化学、酶学或代谢修饰型多核苷酸，以及病毒和细胞特征性的化学形式的DNA和RNA。“多核苷酸”也包含相对短的多核苷酸，常常称为寡核苷酸。
在下文使用的“多肽”是指包含通过肽键或修饰肽键彼此连接的氨基酸的任何肽或蛋白。“多肽”是指皆为短链，通常称为肽、寡肽或低聚物，和较长链，泛指蛋白。多肽可以含有除20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过自然加工，如翻译后加工修饰的，或者通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这种修饰在基础正文中很好描述和在专题论文以及长篇研究参考文献中更详细描述。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应该理解相同类型的修饰可以在给定多肽的几个位点以相同或不同程度存在。同样，给定多肽可以含有很多类型修饰。由于遍在蛋白化，多肽可以分支，和它们可以是环状的，有或者没有分支。环状、分支和分支环状多肽可以在翻译后自然加工产生，或可以通过合成方法制备。修饰或修改型包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化外消旋、氢硒化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸添加至蛋白如氨酰化和遍在蛋白化(参见例如Proteins-Structure andMolecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freemanand Company，New York，1993；Wold，F.，Post-translationalProtein ModificationsPerspectives and Prospects，pgs.1-12in Postranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifteretal.，″Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors″，Meth Enzymol(1990)182626-646and Rattan et al.，″ProtreinSynthesisPost-translational Modifications and Aging″，Ann NYAcad Sci(1992)6634842)。
下文使用的“分离的”是指由人工从自然状态改变而来。如果自然界存在“分离的”组合物或物质，它与其原始环境已经变化或远离该环境，或二者皆是。例如，天然存在于活动物的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其自然状态的共存材料分离的同一多核苷酸或多肽是″分离的″，如同本文使用的术语。因此本文使用的和本领域理解的“分离的”，无论是指“分离的”多核苷酸还是多肽，意思是与通常发现多肽或核酸的原始细胞环境分离。因此本文使用的，仅举例来说，用本发明多核苷酸构建的转基因动物或重组细胞系使用“分离的”核酸。特别从本发明的分离的多核苷酸定义中排除的是来自最初获得该多核苷酸的天然宿主细胞的完整分离的染色体。
在随后的公开内容中，我们将常常使用应用于多肽氨基酸序列的术语“同一性”或相似性。对于多肽的氨基酸序列“同一性”百分比在本文定义为候选序列和靶序列比对，和如有必要，为达到最大序列同一性百分比而引入缺口，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分后，候选序列中与靶序列中残基相同的氨基酸残基的百分比。通过传统方法测定序列同一性百分比。例如，BLASTP2.2.6[TatusovaTA and TL Madden，″BLAST 2 sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences.″(1999)FEMS Microbiol Lett.174247-250.]。
简言之，如上所述，比对两个氨基酸序列，使用Henikoff和Henikoff(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8910915-10919.1992)的缺口开放罚分为10、缺口延伸罚分为0.1和“blosum62”得分矩阵，优化比对得分。
然后如下计算同一性百分比 对于本发明多肽的序列“相似性”(常常称为“同源性”)百分比在本文定义为候选序列和靶序列比对，和如有必要，为达到最大序列同一性百分比而引入缺口(如上所述)，并且也不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分后，候选序列中与靶序列中残基相同的氨基酸残基的百分比。
可以根据物理性能和对二级和三级蛋白结构的贡献对氨基酸进行分类。本领域公认保守置换为一个氨基酸被具有相似性能的另一个氨基酸置换。
示例的保守置换在下表1、2和3中列出。
表1保守置换I侧链特征氨基酸脂肪族的非极性的GAPILV极性-不带电荷的 CSTMNQ极性-带电荷的 DEKR芳香族的HFWY其他NQDE可供选择地，保守氨基酸可以如Lehninger，[Biochemistry，Second Edition；Worth Publishers，Inc.NYNY(1975)，pp.71-77]所述进行分组，如就在下面表2所列。
表2保守置换II侧链特征氨基酸非极性的(疏水的)A、脂肪族的 ALIVPB、芳香族的 FWC、含硫的 MD、边界的 G不带电荷-极性的
A、羟基STYB、酰胺NQC、巯基CD、边界的 G正电荷(碱性) KRH负电荷(酸性) DE仍如另一选择方案，示例的保守置换在就在下面的表3中列出。
表3保守置换III原始残基 示例的置换Ala(A) Val、Leu、IleArg(R) Lys、Gln、AsnAsn(N) Gln、His、Lys、ArgAsp(D) GluCys(C) SerGln(Q) AsnGlu(E) AspHis(H) Asn、Gln、Lys、ArgIle(1) Leu、Val、Met、Ala、PheLeu(L) Ile、Val、Met、Ala、PheLys(K) Arg、Gln、AsnMet(M) Leu、Phe、IlePhe(F) Leu、Val、Ile、AlaPro(P) Gly
Ser(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp、Phe、Thr、SerVal(V)Ile、Leu、Met、Phe、Ala涉及生产本发明病毒和宿主细胞的方法本发明提供了在细胞中生产动脉炎病毒科和Asfarviridae科成员的病毒的改进方法，包括指导所述细胞表达CD163多肽的步骤。这可以包括致使病毒非许可型细胞变成病毒许可型细胞，或可以包括致使细胞对病毒更许可。
在一个实施方案中，动脉炎病毒科或Asfarviridae科成员的病毒选自小鼠LDV、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、猪PRRSV和猪ASFV。
在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。
本发明进一步提供了制备病毒培养物的方法，该病毒是动脉炎病毒科成员，包含步骤提供细胞系；指导所述细胞系表达CD163多肽；用病毒感染所述细胞系；和使所述细胞系生产病毒子代。
在一个实施方案中，动脉炎病毒科成员的病毒选自小鼠LDV、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、猪PRRSV和猪ASFV。
在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。
以上全部方法利用表达CD163多肽的细胞和细胞系。包括外源核酸引入细胞的方法可以促进或增加CD163。这种细胞可以以允许所编码CD163多肽表达的方式包含多核苷酸或载体。
编码CD163的多核苷酸可以作为环状质粒的一部分，或作为包含分离蛋白编码区的线状DNA，或在病毒载体中引入宿主细胞。本领域熟知和常规实施的外源核酸引入宿主细胞的方法包括转化、转染、电穿孔、核注射、或与载体融合，如脂质体、胶束、血影细胞和原生质体。本发明的宿主细胞系统包括无脊椎动物和脊椎动物细胞系统。宿主可以包括但不限于下列昆虫细胞、猪肾(PK)细胞、猫肾(FK)细胞、猪睾丸(ST)细胞、非洲绿猴肾细胞(MA-104、MARC-145、VERO和COS细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、婴儿hampster肾细胞、人293细胞和鼠3T3成纤维细胞。昆虫宿主细胞培养系统也可以用来表达CD163多肽。在另一个实施方案中，使用果蝇表达系统表达CD163多肽。
表达CD163多肽的合适表达载体的选择当然将取决于使用的具体宿主细胞，并且在本领域普通技术人员范围之内。合适表达载体的实例包括pSport和pcDNA3(Invitrogen)、pCMV-Script(Stratagene)和pSVL(Pharmacia Biotech)。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括来源于病毒基因组的转录和翻译控制序列。可以用于本发明的通常使用的启动子序列和修饰序列包括但不限于来源于人巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、多形瘤病毒和猿猴病毒40(SV40)的序列。例如Okayama and Berg(Mol.Cell.Biol.3280(1983))；Cosman et al.(Mol.Immunol.23935(1986))；Cosman et al.(Nature 312768(1984))；EP-A-0367566和WO 91/18982中公开了构建哺乳动物表达载体的方法。
因为已知CD163序列存在于各个物种的细胞，所以内源基因可以被修饰以允许或增加CD163多肽表达。细胞可以被修饰(例如通过同源重组)以提供表达增加，通过用全部或部分异源启动子全部或部分取代天然存在的CD163启动子，以致细胞以较高水平表达CD163多肽。异源启动予以它与内源CD163编码序列可操作连接的方式插入。[参见例如PCT国际
发明者J·G·卡尔弗特, S·L·希尔兹, D·E·斯莱德, S-K·W·韦尔奇 申请人:法玛西雅厄普约翰有限责任公司