一种利用特征诊断序列制备牛毛检测抗体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及文物检测技术领域，尤其设及一种利用特征诊断序列制备牛毛检测抗 体的方法。
【背景技术】
[0002] 中国历史悠久，从中国早期的墓葬中出±有大量的牛毛制品，运些古代牛毛制品 蕴藏着大量的考古信息。
[0003] 牛毛是一种天然动物毛纤维。牛毛由表皮鱗片层和皮质层两部分构成，是一种蛋 白纤维，其中角蛋白主要由18种a-氨基酸构成，并联结成呈螺旋形的长链分子，其上含有簇 基、径基和胺基等，在分子间形成氨键和盐桥键等。
[0004] 通常对牛毛制品的鉴定主要是对牛毛角蛋白的鉴定。牛毛角蛋白是一种硬化，不 易溶解的蛋白质，运对牛毛制品的鉴别造成了一定困难。目前，蛋白质检测技术如基于抗 原-抗体结合的酶联免疫技术是一种广泛应用的先进技术，但是具备高灵敏性和特异性的 抗体制备是一大难题。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用特征诊断序列制备牛毛检测抗体 的方法。本发明方法制备的牛毛检测抗体具有高灵敏性和高特异性。
[0006] 本发明的具体技术方案为：一种利用特征诊断序列制备牛毛检测抗体的方法，采 用如下步骤： a.特征诊断序列的合成:采用Fmoc多肤固相合成法合成特征诊断序列，并在所述特征 诊断序列的C端增加半脫氨酸残基用于偶联反应。
[0007] b.特征诊断序列与载体的偶联:选择血蓝蛋白作为载体蛋白，用SPDP连接法将所 述特征诊断序列与所述血蓝蛋白进行偶联制得完全抗原。
[000引C.初次免疫:用生理盐水将步骤b制得的完全抗原进行稀释，将稀释后的完全抗原 与完全弗氏佐剂按体积比1: (0.8-1.1)混合，然后加入青霉素和链霉素进行乳化处理，得到 初次免疫抗原乳化液;使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫。
[0009] d.抗血清制备：用生理盐水将步骤b得到的完全抗原进行稀释，将稀释后的完全抗 原与不完全弗氏佐剂按体积比1:(0.8-1.1)混合，然后加入青霉素和链霉素乳化处理，得到 强免疫抗原乳化液;在初次免疫后的第3周和第5周时，分别使用强免疫抗原乳化液对兔子 进行皮下多点注射，进行加强免疫;在进行初次免疫后的第7周和第9周时，重复进行加强免 疫，当兔子血样中的抗体效价达到1:20000时，收集兔子血液，并分离制得抗血清。
[0010] e.牛毛检测抗体的纯化:将蛋白A填料与憐酸盐缓冲溶液混合，揽拌后抽真空20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液;将蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到 蛋白柱;对蛋白柱进行清洗;对上述制得的抗血清进行稀释，稀释后加入到蛋白柱中进行上 样，重复上样一次;对蛋白柱再次清洗，用甘氨酸溶液对抗体进行洗脱，洗脱后清洗蛋白柱， 制得抗体。
[0011] 本发明制备的抗体具有较强的特异性，该抗体能够与牛毛角蛋白具有明显的免疫 反应，灵敏度高，能够对古代牛毛制品中已经断裂的牛毛角蛋白分子做出检测。
[0012] 作为优选，步骤a中所述的特征诊断序列为如序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序 列GLLD沈DCKLPCNPCATTNAYGK。
[001引作为优选，步骤C中稀释后的完全抗原的浓度为0.8-1.2mg/mL。
[0014] 作为优选，步骤d稀释后的完全抗原的浓度为0.25-0.75mg/mL。
[0015] 作为优选，在进行初次免疫、加强免疫时，每个注射点的注射量为10化L。
[0016] 作为优选，在步骤d中，从血液中分离得到抗血清的方法为:将收集到的血液置于 室溫下凝固，然后将凝固血液置于36-38°C的溫箱内放置25-35min，再置于4°C的冰箱中11-13h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清;收集粗抗血清，在4°C环境中，在3000g条 件下离屯、14-16min，取上清液，放置于-80°C储存备用。
[0017] 作为优选，步骤e的具体过程为:将蛋白A填料与憐酸盐缓冲溶液按1.5g/(6-7)mL 的配比混合，揽拌后抽真空20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液;然后将6-7体积份的蛋白 A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱;用20体积份的憐酸盐缓冲溶液对蛋 白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h;用憐酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积 份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次;用30体积份的憐酸盐缓冲溶液对蛋白 柱再次清洗，清洗流速为60mL/h;用浓度为0.2mol/L、抑为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗 脱;洗脱后用憐酸盐缓冲溶液洗涂蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离屯、管中并于4°C保存待 用。
[001引作为优选，步骤e中所用的憐酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，抑为7.4。
[0019] 与现有技术对比，本发明的有益效果是： (1)利用特征诊断序列制备牛毛检测抗体具有灵敏度高、特异性强等特点，能够祀向识 别牛角蛋白，可W应用于酶联免疫吸附检测、免疫巧光技术等。
[0020] (2)采用特征诊断序列制备牛毛检测抗体能够对早期墓葬中牛毛织品的检测提供 了一种敏感、特异、快捷的辨识方法，为牛毛考古和起源问题提供了新的科学依据。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述。下列实施例中特征诊断序列和合成W 及特征诊断序列与载体的偶联均委托杭州华安生物技术有限公司进行完成。
[0022] 实施例1 一种利用特征诊断序列制备牛毛检测抗体的方法，采用如下步骤： a.特征诊断序列的合成:采用Fmoc多肤固相合成法合成特征诊断序列，并在所述特征 诊断序列的C端增加半脫氨酸残基用于偶联反应。所述特征诊断序列的氨基酸序列如序列 表沈Q ID No. 1 所示为化LD沈DCKLPCNPCATTNAYGK。
[0023] b.特征诊断序列与载体的偶联:选择血蓝蛋白作为载体蛋白，用SPDP连接法将所 述特征诊断序列与所述血蓝蛋白进行偶联制得完全抗原。
[0024] C.初次免疫:用生理盐水将步骤b制得的完全抗原稀释浓度至Img/mL，将稀释后的 完全抗原与完全弗氏佐剂按体积比1:0.95混合，然后加入青霉素和链霉素进行乳化处理， 得到初次免疫抗原乳化液;使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射，进行初次 免疫。在进行初次免疫时，每个注射点的注射量为10^Ld
[0025] d.抗血清制备：用生理盐水将步骤b得到的完全抗原稀释浓度至0.5mg/mL，，将稀 释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂按体积比1:0.95混合，然后加入青霉素和链霉素乳化处 理，得到强免疫抗原乳化液;在初次免疫后的第3周和第5周时，分别使用强免疫抗原乳化液 对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫;在进行初次免疫后的第7周和第9周时，重复进行 加强免疫，在进行加强免疫时，每个注射点的注射量为10化L。
[00%]当兔子血样中的抗体效价达到1:20000时，收集兔子血液，将收集到的血液置于室 溫下凝固，然后将凝固血液置于37°C的溫箱内放置30min，再置于4°C的冰箱中12h，使血块 充分收缩并得到完全析出的粗抗血清;收集粗抗血清，在4°C环境中，在3000g条件下离屯、 15min，取上清液，制得抗血清，放置于-80°C储存备用。
[0027] e .牛毛检测抗体的纯化:将蛋白A填料与憐酸盐缓冲溶液按1.5g/6.5mL的配比混 合，揽拌后抽真空22.5min，得到无气泡的蛋白A填料液;然后将6.5mL的蛋白A填料液在无气 泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱;用20mL的憐酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗 流速为60mL/h;用憐酸盐缓冲溶液将15mL的抗血清稀释至20mL，稀释后加入到蛋白柱中进 行上样，重复上样一次；用30mL的憐酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h; 用浓度为0.2mol/L、抑为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱;洗脱后用憐酸盐缓冲溶液洗涂 蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离屯、管中并于4°C保存待用。上述的憐酸盐缓冲溶液的浓度 为0.05111〇1/1，口出％7.4。
[0028] f.特异性检测：取牛毛角蛋白用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液配制成化g/ mL的浓度包被在酶标板中12h，用抑7.4的憐酸盐缓冲溶液洗涂S次;每孔加入20化L，质量 浓度为1%的牛血清白蛋白溶液在37°C下封闭化;用抑7.4的憐酸盐缓冲溶液洗涂3次，然后 将牛毛检测抗体分别用质量浓度为1 %的牛血清白蛋白溶液稀释1: 240000，1: 60000，1: 20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100化牛毛检测抗体，37 °C下解育比，用 pH7.4的憐酸盐缓冲溶液洗涂5次;每孔加入10化L的辣根过氧化酶标二抗，37°C下解育化， 所述二抗采用质量浓度为1 %的牛血清白蛋白稀释5000倍;最后每孔加入I(K)化的质量浓度 为1 %的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，IOmin后，加入10化L 2mol/L的出S〇4终止反应;用 酶标仪测定〇〇4日血m，根据0〇4日(wf直，对抗原抗体的结合性等情况进行判断；当OD值达到阳性 标准时就可W确定样品中含有牛角蛋白；若样品中不含有牛角蛋白，则OD值就会低于阳性 标准，根据此标准，可W判断牛毛的存在。
[0029] 实施例2 一种利用特征诊断序列制备牛毛检测抗体的方法，采用如下步骤： a.特征诊断序列的合成:采用Fmoc多肤固相合成法合成特征诊断序列，并在所述特征 诊断序列的C端增加半脫氨酸残基用于偶联反应。所述特征诊断序列的氨基酸序列如序列 表沈Q