用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点的制作方法

归因于抗体对于多种治疗性应用的重要性，需要选择性修饰抗体的稳健的方法以引入改善的特性或额外的功能。本申请公开了特定位点用于部分与抗体接合以产生修饰的抗体，如用于制备抗体-药物缀合物(ADC)。选择性缀合位点位于抗体的恒定区上并且因此可用于多种抗体。背景用于修饰抗体的方法的价值是熟知的，并且已经开发了用于缀合抗体以接合多种“有效载荷(payload)”部分的许多方法。这些方法中许多依赖于抗体上天然存在的可以用来接合有效载荷的特定反应性氨基酸残基，如赖氨酸和半胱氨酸。然而，依赖于天然氨基酸并不总是合乎需要，因为连接的有效载荷的位置和量取决于那些反应性氨基酸的数目和位置：过多或过少的这类残基导致难以有效控制有效载荷负载到抗体上。此外，反应性氨基酸的安置可能使其难以获得完整缀合，在缀合期间导致不均一产物。例如，药物有效成分的不均一性一般是不利的，因为它加重了向异质的受试者群体施用药物的不可预测性：十分优选施用均质产物，并且充分表征及预测不均一产品的行为是非常困难的。细胞毒药物通过例如工程化的半胱氨酸残基与抗体的位点特异性缀合导致显示出改善治疗指数的均一免疫缀合物(Junutula等人,(2008)NatBiotechnol.26(8):925-932))。已经工程化抗体以在特定位置中添加某些残基如半胱氨酸，其中这些残基可以用于缀合(Lyons等人,(1990)ProteinEng.,3:703-708)，但是特定置换的值可能随某些抗体而变动，因为工程化的半胱氨酸可能干扰抗体的折叠及正确分子内二硫键的氧化(Voynov等人,(2010)Bioconjug.Chem.21(2):385-392)。因为抗体生物合成期间通过二硫键用谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰哺乳动物细胞中表达的抗体中的工程化半胱氨酸(Chen等人(2009)mAbs1:6,563-571)，如初始表达的抗体药物缀合物产物中的修饰半胱氨酸对巯基反应性试剂无反应。工程化半胱氨酸的激活需要还原GSH和/或半胱氨酸加合物(其一般导致抗体的全部链间二硫键还原)，随后在缀合之前天然链间二硫键的再氧化和重新形成(Junutula等人,(2008)Nat.Biotechnol.26(8):925-32)。一些其中已经插入半胱氨酸的位点干扰了再氧化过程并随后产生不利的、非均质的缀合产物。因此重要的是鉴定抗体上引入半胱氨酸的位点不干扰在与硫醇反应性试剂如马来酰亚胺或溴乙酰胺、氯乙酰胺或碘乙酰胺基团缀合之前的再次氧化过程。半胱氨酸残基与溴乙酰胺、碘乙酰胺或氯乙酰胺的缀合导致稳定硫醚键的形成。(Alley等人,(2008)BioconjugChem.19(3):759-65)。然而，这种化学比马来酰亚胺缀合化学更低效。由于形成这类巯基-马来酰亚胺键是在接合有效载荷或接头至半胱氨酸时使用的流行和高度有效的方法，所以需要鉴定在抗体上可以使用马来酰亚胺键的半胱氨酸置换位点。更重要地，位点特异性缀合的免疫缀合物可以显示改善的治疗指数，因此依旧需要鉴定抗体中用于半胱氨酸置换的专用位点，所述专用位点能够使有效载荷到抗体上的缀合过程高效地形成，并且提供具有高稳定性的缀合物。本申请为缀合目的提供产生改善的抗体的这类专用半胱氨酸置换位点以及包含这类改善的抗体的免疫缀合物。发明概述本申请提供在抗体或抗体片段的恒定区中的特定位点，在所述位点，可以进行半胱氨酸(“Cys”)替换亲本抗体或抗体片段上的天然氨基酸，旨在提供Cys残基用于接合化学部分(例如，有效载荷/药物部分)以形成具有良好效率和稳定性的免疫缀合物。本申请进一步提供在一个或多个这些特定位点中具有一个或多个Cys残基的工程化抗体或抗体片段，以及由这类工程化抗体或抗体片段制成的免疫缀合物。在抗体的特定位置处插入Cys的方法是本领域已知的，参见，例如，WO2011/005481。但是，本申请公开了在抗体或抗体片段的恒定区中的特定位点，其中用Cys替换亲本抗体或抗体片段的一个或多个天然氨基酸提供了以下一个或多个优点：促进高效免疫缀合的良好反应性；当使用Cys-马来酰亚胺缀合接头时有效载荷丢失的倾向降低；形成不利二硫键如抗体之间交联或形成非天然分子内二硫键的倾向降低；和所产生的ADC的疏水性低。选择特定专用位点以便Cys替换亲本抗体或抗体片段恒定区中的天然氨基酸，以提供有效缀合，同时使不利影响最小化。首先，选择用于修饰的特定位点，从而在一个或多个选择的位置中用Cys替换亲本抗体或抗体片段的天然氨基酸提供了在新半胱氨酸上轻易缀合的抗体或抗体片段。选择表面充分可及的特定位置以允许半胱氨酸残基的硫氢基对水溶液中的亲电体有反应性。鉴定合适位点用于Cys替换亲本抗体或抗体片段的天然氨基酸涉及基于晶体结构数据分析天然氨基酸的表面暴露。因为本文所述的位点是充分可及和反应的，所以借助本领域熟知用于修饰天然存在的半胱氨酸残基的化学，它们可以用来形成免疫缀合物。Cys替换残基的缀合因此使用常规方法。当缀合中使用巯基-马来酰亚胺部分时，选择的修饰位点可以显示低的缀合逆转倾向性。巯基-马来酰亚胺缀合反应经常具有高度选择性并且极端有效的，并且可以用来接合有效载荷至蛋白质的半胱氨酸残基的巯基或作为蛋白质和有效载荷之间的键接中的其他地方的接头。例如，马来酰亚胺可以与蛋白质(例如，抗体或抗体片段)接合，并且可以添加具有接合的巯基的有效载荷至马来酰亚胺以形成缀合物。因此，在这个缀合步骤中，蛋白质(例如，抗体或抗体片段)可以是单圈或双圈；另一个代表有效载荷。免疫缀合物稳定性信息在此特别地涉及通过与马来酰亚胺基反应而缀合置换的半胱氨酸。在一些实施方案中，巯基来自蛋白质(例如，抗体或抗体片段)上的半胱氨酸，因而双圈代表蛋白质并且单圈代表有效载荷。尽管巯基-马来酰亚胺反应经常用于产生缀合物，但是如下文所述的缀合步骤逆转可能导致有效载荷丢失或其他含巯基的种类弄乱了有效载荷。已经报道，一些半胱氨酸置换位点比其他位点提供更稳定的马来酰亚胺缀合物，假定地认为是因为抗体表面上新半胱氨酸周围的某些点处的局部化学环境可以促进琥珀酰亚胺环水解并因此防止免疫缀合物中的巯基-马来酰亚胺键逆转(Shen等人,(2012),Nat.Biotechnol.30(2):184-9)。鉴定有利位点以符合这种标准涉及插入Cys替换许多具有合适表面暴露的天然氨基酸，产生含有巯基-马来酰亚胺键的免疫缀合物，并且评估免疫缀合物的稳定性，以消除其中缀合物的稳定性因去稳定化位点周围的局部微环境而降低的位点。因此，可以用来接合接头和有效载荷至Cys替换残基的化学不受与上文讨论的巯基-马来酰亚胺缀合物可逆性相关的稳定性问题限制。众多方法可以用来在半胱氨酸处形成缀合物，包括马来酰亚胺缀合法。当使用最常见的缀合方法之一时，本文所述的用于半胱氨酸置换的位点促进抗体缀合物产物的稳定性，使得这些位点有利于抗体工程化，因为修饰的抗体可以随熟知和高度有效的马来酰亚胺缀合法一起使用。选择的位点可以如此安置，从而最大限度减少可能干扰均匀缀合物形成的不利二硫键形成。当含有工程化半胱氨酸的抗体或抗体片段在哺乳动物细胞中产生时，Cys残基一般相对于游离Cys氨基酸或谷胱甘肽作为二硫键存在(Chen等人,(2009)mAbs16,353-571)。为了释放Cys残基用于具巯基反应基团的缀合，抗体或抗体片段需要被还原，破坏全部二硫键。抗体或抗体片段随后在促进抗体或抗体片段稳定化的天然二硫键形成的条件下再氧化。一旦再氧化，在抗体或抗体片段的表面上过于明显暴露的半胱氨酸残基可以通过与另一抗体或抗体片段上的Cys反应形成二硫键(“抗体间二硫键”)，或可以通过形成不利的抗体内二硫键来形成二硫键。已经发现置于本文所述特定位点中的半胱氨酸残基是可用于高效缀合而适当可及的，但是得到充分防护或适当安置以减少或消除形成抗体间和抗体内二硫键，所述抗体间和抗体内二硫键否则将在表达Cys修饰的抗体时通常需要的还原/再氧化过程期间出现。类似地，在再氧化后，发现一些位点产生似乎因工程化到蛋白质中的新Cys残基的位置所致的不均一缀合产物，并且本文中确定的特定位点是最大限度减少这类不均一性的那些位点。优选在使药物有效载荷与溶剂相互作用隔绝并且接合有效载荷时接合可以增加抗体疏水性的位点缀合药物有效载荷，因为通常认为减少蛋白质治疗药的疏水性有益的，原因在于它可能减少聚集和从循环清除。当每个抗体接合4、6或8个有效载荷时或当特别地使用疏水性有效载荷时，选择导致疏水性变化最小的接合位点可能是特别有益的。使用这些方法和本文实施例中描述的额外方法评价用于并入Cys的位点，这导致选出用于并入Cys的优选位点，用于工程化抗体或抗体片段以引入Cys作为缀合的位点，特别用于产生ADC。本文中提供了关于选择特定位点以将抗体的天然氨基酸替换为Cys的额外细节。半胱氨酸置换位点位于抗体或抗体片段的恒定区，并且本文中使用标准编号习惯进行确定。然而，熟知的是，可以出于多个目的使用抗体的部分或片段，代替完整全长抗体，并且还熟知的是，抗体可以按照影响恒定区中位点编号的多种方式修饰，尽管如此，它们基本上不影响恒定区发挥作用。例如，已经显示向抗体的环区域插入S6标签(短肽)允许保留抗体的活性，尽管它将改变抗体中许多位点的编号。因此，尽管通过基于完整抗体编号的标准编号体系确定本文所述的优选半胱氨酸置换位点，但是本申请包括在抗体片段中或在含有其他修饰(如肽标签插入)的抗体中的相应位点。在这些片段或修饰的抗体中的相应位点因此是用于片段或修饰的抗体中半胱氨酸置换的优选位点，并且通过数字对半胱氨酸置换位点的提及包括在修饰的抗体或抗体片段中保留全长抗体的有关部分的功能的相应位点。可以通过以下方式轻易鉴定在抗体片段或修饰的抗体中的相应位点：将抗体片段或修饰抗体的区段与全长抗体比对以确定在抗体片段或修饰的抗体中匹配本发明的优选半胱氨酸置换位点之一的位点。比对可以基于这样的区段，所述区段长到足以确保该区段匹配全长抗体的合适部分，如至少20个氨基酸残基、或至少50个残基、或至少100个残基、或至少150个残基的区段。比对还可以考虑可能已经工程化到抗体片段或修饰的抗体中的其他修饰，因此将允许因用于比对的区段中的工程化点突变(尤其对于保守性置换)所致的序列差异。因此，例如，Fc结构域可以从抗体切除，并且将含有对应于本文所述的半胱氨酸置换位点的氨基酸残基，尽管存在编号差异：Fc结构域中与本公开的半胱氨酸置换位点相对应的位点也将预计是Fc结构域中用于半胱氨酸置换的有利位点，并且纳入本申请的范围。在一个实施方案中，本申请提供式(I)的免疫缀合物：其中Ab代表抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含至少一个在本文所述的优选半胱氨酸置换位点之一处的半胱氨酸残基；LU是如本文所述的接头单元；X是有效载荷或药物部分；并且n是从1至16的整数。一般在式(I)的化合物中，LU在本文所述的半胱氨酸置换位点之一处与半胱氨酸接合，X是药物部分如抗癌药物，并且当Ab是抗体时，n是2-8，或当Ab是抗体片段时，n可以是1-8。在一个实施方案中，本申请提供一种包含修饰的抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上半胱氨酸对一个或多个氨基酸的置换，所述恒定区选自所述抗体或抗体片段的重链的位置121、124、152、171、174、258、292、333、360和375，其中所述位置根据EU系统编号。在一个实施方案中，本申请提供一种包含修饰的抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上半胱氨酸对一个或多个氨基酸的置换，所述恒定区选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、142、145、159、161和165，其中所述位置根据EU系统编号，并且其中所述轻链是人κ轻链。在一个实施方案中，本申请提供一种包含修饰的抗体或其抗体片段和药物部分的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上半胱氨酸对一个或多个氨基酸的置换，所述恒定区选自所述抗体或抗体片段的轻链的位置143、147、159、163和168，其中所述位置根据Kabat系统编号，并且其中所述轻链是人λ轻链。在一个实施方案中，本申请提供了包含在本文所述的位置处半胱氨酸对一种或多种氨基酸的置换的修饰抗体或其抗体片段。半胱氨酸置换位点位于抗体的恒定区中并因此适用于多种抗体，并且选择位点以提供稳定和均一的缀合物。修饰的抗体或片段可以具有两个或更多个半胱氨酸置换，并且这些置换可以与如本文所述的其他抗体修饰和缀合方法组合使用。在一个实施方案中，本申请提供了包含上文公开的免疫缀合物的药物组合物，和使用免疫缀合物的方法。在一个实施方案中，本申请提供编码本文所述的修饰的抗体或抗体片段的核酸，所述修饰的抗体或抗体片段在本文所述的位点处具有至少一个半胱氨酸置换。本申请还提供包含这些核酸的宿主细胞和使用核酸或宿主细胞表达并产生本文所述的抗体或片段的方法。在一个实施方案中，本申请提供选择抗体的氨基酸的方法，所述氨基酸适于被半胱氨酸替换以提供良好的缀合位点，所述方法包括：(1)确定抗体恒定区中具有合适的表面暴露的氨基酸，以提供一组初始候选位点；(2)对于每个初始候选位点，表达该位点处的天然氨基酸被半胱氨酸替换的抗体；(3)对于每种表达的抗体，确定表达的蛋白质是否在还原和再氧化后基本上均一，以提供在初始候选位点处具有游离半胱氨酸的抗体，(4)对于基本上均一和有功能的每种表达的蛋白质，使初始候选位点处的半胱氨酸与马来酰亚胺部分缀合并且确定巯基-马来酰亚胺键是否在该位点处稳定；(5)从一组初始候选位点移除表达的抗体基本上不均一及无功能的那些位点，和移除巯基-马来酰亚胺键去稳定化的那些位点，以提供一组用于半胱氨酸置换的优势位点。任选地，该方法还包括以下步骤：确定具有每个优势半胱氨酸置换位点的缀合物的熔化温度，并且从该组消除其中半胱氨酸置换和缀合造成熔化温度与天然抗体的熔化温度相差5℃或更多的任何位点。在一个实施方案中，本申请提供产生免疫缀合物的方法，所述方法包括将接头单元(LU)或接头单元-有效载荷组合(-LU-X)接合至抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基，其中半胱氨酸位于选自所述抗体或抗体片段的重链位置121、124、152、171、174、258、292、333、360和375以及所述抗体或抗体片段的轻链位置107、108、142、145、159、161和165的半胱氨酸置换位点，其中所述位置根据EU系统编号。本文中更详细地描述本申请的其他方面和实施方案。以下是本申请的实施方案。1.包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸置换两个或多个氨基酸的组合，其中组合包含选自抗体重链的位置360和抗体κ轻链的位置107的置换，其中所述位置根据EU系统编号。2.包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸置换两个或多个氨基酸的组合，其中组合包含选自抗体重链的位置152和375的置换，其中所述位置根据EU系统编号。3.包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，包含SEQIDNO:48的重链恒定区和包含SEQIDNO:61的κ轻链恒定区。4.包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，包含SEQIDNO:131的重链恒定区。5.实施方案1-4中任一项的免疫缀合物，其中免疫缀合物还包含药物部分。6.实施方案1-5中任一项的免疫缀合物，其中药物/抗体比是约4。7.实施方案1-6中任一项的免疫缀合物，其中所述药物部分通过所述半胱氨酸的硫和任选的接头与修饰的抗体或抗体片段连接。8.实施方案1－7的免疫缀合物，其中所述药物部分通过可切割或不可切割的接头与所述半胱氨酸的所述硫连接。9.实施方案8的免疫缀合物，其中所述药物部分通过不可切割的接头与所述半胱氨酸的所述硫连接。10.实施方案7-9的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含巯基-马来酰亚胺键。11.实施方案10的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含–S-CH2-C(＝O)-键或二硫键。12.实施方案11的免疫缀合物，其中所述药物部分是细胞毒性剂。13.实施方案12的免疫缀合物，其中所述药物部分选自紫杉烷类(taxanes)、DNA烷化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、微管溶素(tubulysin)类似物、倍癌霉素(duocarmycin)类似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、类美登素(maytansinoid)和Eg5抑制剂。14.实施方案1-13中任一项的免疫缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。15.实施方案1-13中任一项的免疫缀合物，其中所述抗体是嵌合抗体。16.实施方案1-13的免疫缀合物，其中所述抗体是人源化或全人抗体。17.实施方案14-16中任一项的免疫缀合物，其中所述抗体是双特异性或多特异性抗体。18.实施方案1-17中任一项的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段与肿瘤上的细胞表面标志物特异性结合。19.药物组合物，包含实施方案1-18中任一项的免疫缀合物。20.实施方案1-19中任一项的修饰的抗体或抗体片段，还包含至少一个用于酶介导缀合的Pcl或非天然氨基酸置换或肽标签和/或它们的组合。21.核酸，编码实施方案1-4中任一项的修饰的抗体或抗体片段。22.宿主细胞，包含实施方案21的核酸。23.产生修饰的抗体或抗体片段的方法，包括在表达抗体或抗体片段的合适条件下温育实施方案22的宿主细胞，并且分离所述抗体或抗体片段。24.产生免疫缀合物的方法，包括将接头单元(LU)或接头单元-有效载荷组合(-LU-X)接合至实施方案1-4中任一项的抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基。25.实施方案24的方法，其中免疫缀合物具有式(I)：其中Ab代表抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含至少一个在本文所述的优选半胱氨酸置换位点之一处的半胱氨酸残基；LU是如本文所述的接头单元；X是有效载荷或药物部分；并且n是从1至16的整数。26.修饰的抗体或其抗体片段，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸置换两个或多个氨基酸的组合，其中组合包含选自抗体重链的位置360和抗体κ轻链的位置107的置换，其中所述位置根据EU系统编号。27.修饰的抗体或其抗体片段，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸置换两个或多个氨基酸的组合，其中组合包含选自抗体重链的位置152和375的置换，其中所述位置根据EU系统编号。28.修饰的抗体或其抗体片段，包含SEQIDNO:48的重链恒定区和包含SEQIDNO:61的κ轻链恒定区。29.修饰的抗体或其抗体片段，包含SEQIDNO:131的重链恒定区。定义术语“氨基酸”指规范的、合成的和非天然的氨基酸，以及以类似于规范氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。规范氨基酸是由遗传密码编码的蛋白质氨基酸并且包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸和其类似物吡咯啉-羧基-赖氨酸。氨基酸类似物指具有与规范氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物，例如，瓜氨酸、高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与规范氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以类似于规范氨基酸的方式发挥作用的化学化合物。如本文所用，术语“非天然氨基酸”意在代表不能在任何生物中使用来自(相同或不同的)任何生物的未修饰基因或修饰基因以生物合成方式生成的氨基酸结构。此外，这类“非天然氨基酸”一般需要修饰的tRNA和修饰的tRNA合成酶(RS)以并入蛋白质中。相对于规范氨基酸，这种tRNA/RS对偏好地并入非天然氨基酸。通过如Schultz等人(参见，例如，Liu等人,(2010)Annu.Rev.Biochem.79:413-444)开发的选择方法或相似程序产生这类正交tRNA/RS对。术语“非天然氨基酸”不包括天然存在的第22个蛋白质性氨基酸吡咯赖氨酸(pyrrolysine)(Pyl)以及它的去甲基化类似物：吡咯啉-羧基-赖氨酸(pyrroline-carboxy-lysine)(Pcl)，因为未修饰的天然存在的吡咯赖氨酰-tRNA/tRNA合成酶对介导这两种残基并入蛋白质中并且因为Pyl和Pcl以生物合成方式生成(参见，例如，Ou等人,(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:10437-10442；Cellitti等人,(2011)Nat.Chem.Biol.27；7(8):528-30)。还参见通过引用方式并入的美国临时申请61/76236，其定位抗体轻链和重链中可以置换为Pcl的特定氨基酸残基。如本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽，所述多肽能够非共价、可逆并以特异性方式结合相应的抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)(也称作“抗体重链”)和两条轻链(L)(也称作“抗体轻链”)的四聚体。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定结构域包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区，名为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域，名为构架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和4个FR，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))结合。术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼样抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，针对本发明公开抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。轻链和重链均分成具有结构同源性和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”以功能方式使用。在这个方面，将可以理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学特性如分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合、补体结合作用等。按常规，恒定区结构域的编号随着它们变得距抗体的抗原结合位点或氨基端更远而增加。N端是可变区并且在C端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。如本文所用的术语“抗体片段”指抗体的抗原结合片段或抗体的非抗原结合片段(例如，Fc)。如本文所用，术语“抗原结合片段”，指抗体的一个或多个部分，所述部分保留与抗原的表位特异性相互作用的能力(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。结合片段的例子包括但不限于单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature341:544-546,1989)；和分离的互补决定区(CDR)、或抗体的其他表位结合片段。另外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性接头连接，在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等人,Science242:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988。术语抗体的“抗原结合片段”也意在涵盖这类单链抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术，获得这些抗原结合片段，并且按照与完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。也可以将抗原结合片段并入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、纳米体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,2005,NatureBiotechnology,23:1126-1136,2005)。可以将抗原结合片段移植至基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)中(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽单体抗体)。可以将抗原结合片段并入单链分子中，其中所述单链分子包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,ProteinEng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有基本上同一的氨基酸序列或从相同遗传源衍生的多肽，包括抗体和抗体片段。这个术语还包括具有单一分子组成的抗体分子的制备物。一种单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。如本文所用，术语“人抗体”包括具有其中构架和CDR区均从人源序列衍生的可变区的抗体。另外，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自这类人序列，例如，人种系序列、或者突变形式的人种系序列或含有从人构架序列分析导出的共有构架序列的抗体，例如，如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)中所述。本申请的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外的随机或定点诱变或通过体内的体细胞突变而引入的突变、或保守替换，以促进稳定性或生产)。如本文所用，术语“人源化抗体”指一种保留非人类抗体的反应性，同时在人类中免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类CDR区并且抗体的剩余部分替换成它们的人类对应物来实现。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)；MorrisonandOi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。如本文所用的术语“识别”指发现表位并与之相互作用(例如，结合)的抗体或其抗原结合片段，无论该表位是否为线性或构象的。术语“表位”指抗原上与本公开的抗体或抗原结合片段特异性结合的位点。表位可以从连续氨基酸或因蛋白质的立体折叠而靠近的非连续氨基酸中形成。从连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因立体折叠形成的表位通一般用变性溶剂处理时丧失。表位一般包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15个处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如，X射线结晶学和2-二维核磁共振(参见，例如EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷,G.E.Morris编著(1996))。本文所用的术语“亲和力”(affinity)指，抗体与抗原在单个抗原部位上相互作用的强度。在每个抗原位点内部、抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。术语“分离的抗体”指一种抗体，其基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体。然而，与一种抗原特异性结合的分离抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。另外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。术语“保守性修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守性修饰的变体指编码相同或基本上同一的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上同一的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给出的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因而，在丙氨酸由某个密码子指定的每个位置，可以将该密码子变成任一个所述的相应密码子，而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默性变异”，它们是一个种类的保守性修饰变异。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每种可能沉默变异。技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(例外是AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默性变异内含于每个描述的序列中。对于多肽序列，“保守性修饰的变体”包括对多肽序列的各个置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本公开的多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。如本文所用的术语“优化的”指已经改变核苷酸序列以使用在生产性细胞或生物(通常是真核细胞，例如酵母细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、真菌细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中为优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列经工程化以完全或尽可能保留由起始核苷酸序列最初编码的起始氨基酸序列，也称作“亲本”序列。在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下，术语“百分数同一的”或“同一性百分数”指相同的两个或更多个序列或子序列。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视检查所测量，两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域范围内或当未指定时在整个序列范围内60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则这两个序列是“基本上同一的”。任选地，同一性存在于具有至少约30个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域内，或更多优选地存在于具有100个至500个或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)长度的区域内。对于序列比较，一般地一个序列充当检验序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将检验序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。基于程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列同一性百分数。如本文所用，“比较窗口”包括针对具有任一连续位置数的节段的参考，所述的连续位置数选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150，其中一个序列可以与具有相同连续位置数的参考序列在最佳比对这两个序列后进行比较。用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以按如下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c(1970)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGenetics软件包，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目视审查(见，例如，Brent等人,(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology，2003)。适用于确定序列同一性百分数和序列相似性百分数的两个算法例子是BLAST算法和BLAST2.0算法，它们分别在Altschul等人,Nuc.AcidsRes.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中描述。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。这种算法涉及首先通过确定查询序列中长度为W的短字，鉴定高评分序列对(HSP)，其中与数据库序列中具有相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足某些正值阈评分T。将T称作相邻字评分阈值(Altschul等人，上文)。这些初始相邻字命中充当种子，所述种子用于启动检索以找到含有这些种子的更长HSP。所述字命中在两个方向沿每个序列尽可能远地延伸，只要可以提高累积比对评分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的报酬评分；总是>0)和N(错配残基的惩罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。字命中在每个方向上的延伸在以下情况时停止：累积比对评分从其最大实现值跌落达量X；累积评分因积累一个或更多负评分残基比对结果而达到或低于零；或抵达两个序列中任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长度(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长度3和期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915)、比对结果(B)50、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认。BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(见，例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配会因偶然发生的概率指示。例如，如果最小总和概率在测试核酸与参考核酸的比较中小于约0.2、更优选小于约0.01并且最优选小于约0.001，则将认为核酸相似于参考核酸。还可以使用PAM120权重余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,1988)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。除上文所示的序列同一性的百分数之外，两个核酸序列或多肽基本上同一的另一个指标是由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽所产生的抗体发生免疫杂交反应，如下文描述。因此，在两种肽仅因保守性置换而不同的情况下，一个多肽一般与第二多肽基本上同一。两个核酸序列基本上同一的另一个指标是这两个分子或它们的互补物在严格条件下彼此杂交，如下文描述。两个核酸序列基本上同一的又一个指标是相同的引物可以用来扩增该序列。术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用并且指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链形式或双链形式的聚合物。本术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或已修饰的主链残基或键的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似参考核苷酸的方式代谢。这类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其沉默变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下文详述，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，实现简并密码子置换(Batzer等人,(1991)NucleicAcidRes.19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。术语“有效连接”在核酸的语境下指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。一般，它指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适宜的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列与编码序列有效连接。通常，与已转录的序列有效连接的启动子转录调节序列物理地与已转录的序列连续，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(如增强子)不需要物理上与它们增强的编码序列连续或与之紧邻。术语“多肽转录”和“蛋白质”在此互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。本术语适用于规范氨基酸聚合物以及非规范氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体。如本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体缀合物”指抗体或其抗体片段与另一种药物如化疗药、毒素、免疫治疗剂、成像探针、光谱探针等连接。连接可以借助一个或多个共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种接头(多数是本领域已知的)以形成免疫缀合物。额外地，可以将免疫缀合物以可以是从编码免疫缀合物的多核苷酸表达的融合蛋白的形式提供。如本文所用，“融合蛋白”指通过连接最初编码分离的蛋白质(包括肽和多肽)的两个或更多个基因或基因片段产生的蛋白质。可以通过在N末端或C末端连接或通过将基因或基因片段插入配偶体蛋白之一的容许区域中，产生融合蛋白。融合基因的翻译产生具有从每种原始蛋白质衍生的功能特性的单一蛋白。术语“受试者”包括人类和非人类动物。术语“非人其动物”包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人的灵长类、绵羊、犬、奶牛、鸡、两栖类和爬行类。除非另外指出，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。如本文所用，术语“细胞毒素”或“细胞毒药物”指对细胞的生长和增殖有害并可以发挥作用以减少、抑制或摧毁细胞或恶性肿瘤的任何物质。如本文所用，术语“抗癌药”指可以用来治疗细胞增殖性疾病如癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒药物、化疗药、放疗法和放疗药、靶向抗癌药和免疫治疗剂。术语“药物部分”或“有效载荷”互换使用并且指与本公开的抗体或抗体片段缀合的化学部分，并且可以包括可用于结合至抗体或抗体片段的任何部分。例如，药物部分或有效载荷可以是抗癌药、抗炎药、抗真菌剂、抗细菌药、抗寄生虫药、抗病毒药、麻醉药。在某些实施方案中，药物部分选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞司他汀、海兔毒素(dolastatin)、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、Eg5抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。合适的例子包括澳瑞司他汀如MMAE和MMAF；刺孢霉素如γ-刺孢霉素；和类美登素(maytansinoid)如DM1和DM4。用于将这些药物中每种药物接合至与本公开抗体和方法相容的接头的方法是本领域已知的。参见，例如，Singh等人,(2009)TherapeuticAntibodies:MethodsandProtocols,第525卷,445-457。此外，有效载荷可以是生物物理探针、荧光团、自旋标记物、红外探针、亲和力探针、螯合剂、光谱探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、聚合物、自旋标记物，DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米粒子、量子点、脂质体、PLGA粒子、糖或多糖、反应性官能团，或可以将缀合物与另一个部分、表面等连接的结合剂。术语“药物/抗体比”(也称作“DAR”)指免疫缀合物中与抗体连接的有效载荷或药物部分的数目。例如药物/抗体比2意指在免疫缀合物的样品中平均两个药物部分与一个抗体结合。在药物/抗体比为2的样品中个别免疫缀合物将会可能没有药物部分连接或仅具有一个药物部分连接；这份样品中的其他免疫缀合物将在单个抗体上具有两个、三个、四个或甚至更多个部分。但是样品中的平均数将是两。存在本领域已知的测量免疫缀合物的药物/抗体比的不同方法。在本申请的一个实施方案中，免疫缀合物的样品中的DAR可以是“均一”的。“均一的缀合样品”是具有DAR窄分布的样品。作为说明性实施方案，在DAR为2的均一缀合样品中，在这份样品内部可以含有未缀合的抗体，并且一些抗体具有按DAR约2缀合的超过两个部分。“大部分样本”意指样品中至少超过70％、或至少超过80％或至少超过90％的抗体将会与两个部分缀合。作为说明性实施方案，在DAR为4的均一缀合样品中，在这份样品内部可以含有这样的抗体，所述抗体具有按DAR约4缀合的超过4个部分或少于4个部分。“大部分样本”意指样品中至少超过70％、或至少超过80％或至少超过90％的抗体将会与四个部分缀合。作为说明性实施方案，在DAR为6的均一缀合样品中，在这份样品内部可以含有这样的抗体，所述抗体具有按DAR约6缀合的超过6个部分或少于6个部分。“大部分样本”意指样品中至少超过70％、或至少超过80％或至少超过90％的抗体将会与六个部分缀合。作为说明性实施方案，在DAR为8的均一缀合样品中，在这份样品内部可以含有这样的抗体，所述抗体具有按DAR约8缀合的超过8个部分或少于8个部分。“大部分样本”意指样品中至少超过70％、或至少超过80％或至少超过90％的抗体将会与8个部分缀合。具有“药物/抗体比约2”的免疫缀合物指其中药物/抗体比可以是约1.6-2.4个部分/抗体、1.8-2.3个部分/抗体或1.9-2.1个部分/抗体的免疫缀合物样品。具有“药物/抗体比约4”的免疫缀合物指其中药物/抗体比可以是约3.4-4.4个部分/抗体、3.8-4.3个部分/抗体或3.9-4.1个部分/抗体的免疫缀合物样品。具有“药物/抗体比约6”的免疫缀合物指其中药物/抗体比可以是约5.1-6.4个部分/抗体、5.8-6.3个部分/抗体或5.9-6.1个部分/抗体的免疫缀合物样品。具有“药物/抗体比约8”的免疫缀合物指其中药物/抗体比可以是约7.6-8.4个部分/抗体、7.8-8.3个部分/抗体或7.9-8.1个部分/抗体的免疫缀合物样品。“肿瘤”指无论是恶性还是良性的赘生性细胞生长和增殖，及所有癌变前和癌变的细胞和组织。“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞的增殖速率、存活力或转移活性的降低。显示抗肿瘤活性的一种可能方式是显示治疗期间出现的异常细胞的生长速率下降或者肿瘤尺寸稳定或缩减。这种活性可使用被接受的体外或体内肿瘤模型评估，包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、MMTV模型和本领域公知的用于研究抗肿瘤活性的其他已知模型。术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”包括以失调节或失控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌症包括癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞没移行至受试者身体中除原始肿瘤部位之外的部位的那些)和继发性恶性肿瘤(例如，因转移、肿瘤细胞移行至与原始肿瘤部位不同的继发部位而产生的那些)。如本文所用，术语“光学异构体”或“立体异构体”指对本申请的给定化合物而言可以存在多种立体异构构型的任一者并且包括几何异构体。可以理解，取代基可以在碳原子的手性中心接合。术语“手性”指具有在其镜像配偶体上不可叠加特性的分子，而术语“非手性”指可叠加在其镜像配偶体上的分子。因此，本公开包括化合物的对映异构体、非对映异构体或消旋物。“对映异构体”是彼此为不可叠加镜像的一对立体异构体。对映异构体的1:1混合物是“消旋”混合物。根据需要，该术语用来指外消旋混合物。“非对映异构体”是具有至少两个非对称原子，但彼此不是镜像的立体异构体。绝对立体化学根据Cahn-lngold-PrelogR-S体系规定。当化合物是纯对映异构体时，每个手性碳处的立体化学可以由R或S指定。其绝对构型未知的拆分化合物可以根据它们在钠D线波长处转动平面偏振光的方向(右旋或左旋)，命名为(+)或(-)。本文所述的某些化合物含有一个或多个非对称中心或轴并且因此可以产生可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的对映异构体、非对映异构体及其他立体异构形式。取决于原料和程序的选择，化合物可以按可能异构体之一的形式存在或作为其混合物存在，例如作为纯的光学异构体，或作为异构体混合物，如消旋物和非对映异构体混合物，这取决于非对称碳原子的数目。本申请意在包括全部这类可能的异构体，包括外消旋混合物、非对映异构混合物和光学纯形式。光学活性的(R)-异构体和(S)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备或可以使用常规技术拆分。如果化合物含有双键，则取代基可以是E构型或Z构型。如果化合物含有双取代的环烷基，则环烷基取代基可以具有顺-构型或反-构型。还意在包括全部互变异构形式。如本文所用，术语“一种盐”或“多种盐”指本申请化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”包括尤其“可药用盐”。术语“可药用盐”指保留本申请化合物的生物学作用和特性并且一般不是生物学不利或不良的盐。在许多情况下，本申请的化合物能够因存在氨基和/或羧基或与之类似的基团而形成酸盐和/或碱盐。可以与无机酸和有机酸形成可药用的酸加成盐，例如，乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、重碳酸盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐(ethandisulfonate)、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐(octadecanoate)、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。可以从其衍生盐的无机酸例如包括氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以从其衍生盐的有机酸例如包括乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可以与无机碱和有机碱形成可药用的碱加成盐。可以从其衍生盐的无机碱例如包括铵盐和来自周期表I族至XII族的金属。在某些实施方案中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可以从其衍生盐的有机碱例如包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苯乍生(benzathine)、胆酸盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇(tromethamine)。可以通过常规化学方法从碱性部分或酸性部分合成本申请的可药用盐。通常，这类盐可以通过这些化合物的游离酸形式与化学计量数量的适宜碱(如氢氧化钠、钙、镁或钾、碳酸钠、钙、镁或钾、重碳酸钠、钙、镁或钾等)反应，或通过这些化合物的游离碱形式与化学计量数量的适宜酸反应来制备。这类反应一般在水中或在有机溶剂中或在二者的混合物中实施。通常，在可行的情况下，使用非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是合乎需要的。额外的合适盐的名单可以例如存在于以下文献中：“Remington'sPharmaceuticalSciences”,第20版,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,(1985)；和Stahl与Wermuth的“HandbookofPharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse”(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002。本文中给出的任何式还意在代表化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有由本文中给出的式描述的结构，除了一个或多个原子由具有选定原子质量或质量数的原子替换之外。可以掺入本申请化合物的同位素的例子分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、125I。本公开包括同位素标记的多种如本文定义的化合物，例如其中存在放射性同位素(如3H和14C)的那些或其中存在非放射性同位素(如2H和13C)的那些。同位素标记的这类化合物可用于代谢研究(采用14C)、反应动力学研究(采用例如2H或3H)、检测或成像技术，如正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算机断层成像(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定法，或用于患者的放射性治疗中。尤其对于PET或SPECT研究，18F或标记的化合物可以是特别地合乎需要的。通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与后附实施例和制备法中所述的那些方法类似的方法，使用适宜的同位素标记试剂而非先前所用的非标记试剂，制备同位素标记的式(I)化合物。另外，用更重的同位素(尤其氘(即，2H或D))取代可以因代谢稳定性更大而提供某些治疗优势，例如体内半寿期增加或剂量需求减少或治疗指数改善。可以理解在这种情况下，氘视作式(I)化合物的取代基。这种更重同位素(尤其氘)的浓度可以由同位素富集系数限定。如本文所用的术语“同位素富集系数”意指指定同位素的同位素丰度和天然丰度之间的比率。如果本申请化合物中的取代基指定为氘，则这类化合物对于每个指定的氘原子具有至少3500(在每个指定的氘原子处52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)的同位素富集系数。如本文所用，术语“可药用载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合，这为本领域普通技术人员已知(参见，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990,第1289-1329页)。除了任何常规载体与有效成分不相容的情况之外，构思了所述载体在治疗组合物或药物组合物中的用途。术语本申请化合物的“治疗有效量”指本申请化合物的量，所述量将激发患者的生物学反应或医学反应，例如减少或抑制酶或蛋白质活性、或改善症状、减轻病状、减慢或延迟病情进展或预防疾病等。在一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”指本申请化合物的量，当施用至受试者时，所述量有效地至少部分减轻、抑制、预防和/或改善病状、或病症或疾病，或至少部分抑制所靶向的酶或受体的活性。如本文所用，术语“抑制了”、“抑制”或“抑制着”指减少或抑制给定的病状、症状、或病症、或疾病，或显著减少生物学活动或过程的基线活性。如本文所用，术语对任何疾病或病症的“治疗了”、“治疗着”或“治疗”在一个实施方案中指改善该疾病或病症(即，延缓或停滞或减少疾病或其至少一个临床症状的形成)。在另一个实施方案中，“治疗了”、“治疗着”或“治疗”指缓和或缓解至少一个身体参数，包括患者可能不可察觉的那些身体参数。在又一个实施方案中，“治疗了”、“治疗着”或“治疗”指在身体上(例如，稳定可察觉症状)、生理上(例如，稳定身体参数)或这两方面或生理上调节疾病或病症。在又一个实施方案中，“治疗了”、“治疗着”或“治疗”指防止或延迟疾病或病症的发作或形成或进展。如本文所用，如果受试者将在生物学上、医学上或在生活质量方面从这类治疗获益，则这名受试者“需要”治疗。如本文所用，在本申请的上下文(尤其在权利要求的上下文中)所用的术语“一个”、“一种”和“该”应解释为涵盖单数和复数，除非本文另外说明或与上下文明显矛盾。如本文所用的术语“巯基-马来酰亚胺”描述由巯基与马来酰亚胺反应形成的基团，其具有这个通式其中Y和Z是借助巯基-马来酰亚胺键连接的基团并且可以是接头单位，并且可以与抗体或有效载荷接合。在一些情况下，Y是本申请的工程化抗体，并且该式中所示的硫原子来自本文所述的取代位点之一处的半胱氨酸；而Z代表与有效载荷连接的接头单元。如本文所用的“接头单元”(LU)指在两个部分如抗体和有效载荷之间的共价化学连接。每个LU可以包含本文所述的一种或多种组分如L1、L2、L3、L4、L5和L6。可以选择接头单元以提供所连接的各部分之间的合适间距，或以提供某些物理化学特性，或以允许在某些条件下切割接头单元。如本文所用的“可切割”指通过共价连接连接两个部分，但在生理条件下分解以服务于所述部分之间共价连接的接头或接头单元(LU)。切割可以是酶促或非酶促的，但是通常在不降解抗体的情况下从抗体释放有效载荷。如本文所用的“不可切割”指生理条件下不易分解的接头或接头单元(LU)。尽管可以在生理学上修饰接头，但是它维持有效载荷与抗体连接直至抗体基本上降解，即在体内，抗体降解先于接头的切割。如本文所用的“环辛炔”指含有碳-碳叁键(炔)的8元环。该环任选地与一个或两个苯环稠合，所述苯环可以用以下基团取代：1-4个C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤素、羟基、COOH、COOL1、-C(O)NH-L1、O-L1或相似基团、并且可以含有N、O或S作为环成员。在优选的实施方案中，环辛炔可以是C8烃环，尤其除叁键之外饱和并且可以用F或羟基取代的孤立环，以及可以通过–O-、–C(O)、C(O)NH或C(O)O连接至接头或LU。如本文所用的“环辛烯”指含有至少一个双键、尤其反式双键的8元环。该环任选地与一个或两个苯环稠合，所述苯环可以用以下基团取代：1-4个C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤素、羟基、COOH、COOL1、-C(O)NH-L1、O-L1或相似基团、并且可以含有N、O或S作为环成员。在优选的实施方案中，环辛烯可以是除反式双键之外饱和并且任选地用F或羟基取代的孤立C8烃环，以及可以通过–O-、–C(O)、C(O)NH或C(O)O连接至接头或LU。除非本文另外说明或除非与语境明显矛盾，否则本文所述的全部方法可以按任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文中提供的任何和全部实施例或示例性表述(例如，“如”)的用途仅意图在于更好地说明本申请而不显示本申请的范围。附图说明图1描述曲妥珠单抗(SEQIDNO:155)、人IgG1(SEQIDNO:151)、IgG2(SEQIDNO:152)、IgG3(SEQIDNO:153)和IgG4(SEQIDNO:154)的恒定区的氨基酸序列比对。图2是描述抗体药物缀合物在表达cKIT的细胞上的细胞杀伤活性的图，所述抗体药物缀合物包含在其恒定区中具有两个cys突变的cKIT抗体。抗体与抑制Eg5的接头-有效载荷复合物缀合。方形数据点针对表5中包含化合物A的免疫缀合物；三角形数据点针对表5中包含化合物B的免疫缀合物；方形数据点针对表5中包含化合物C的免疫缀合物。图3描述这样的图，所述图说明在H526肿瘤小鼠异种移植模型中包含半胱氨酸工程化的cKIT抗体的免疫缀合物按5mg/kg(图3A)和10mg/kg(图3B)剂量施用时的活性和按剂量5.9mg/kg(图3A)和11.8mg/kg(图3B)施用的包含野生型cKIT抗体的免疫缀合物的活性。图4是描述与Eg5抑制剂缀合的抗Her2免疫缀合物在小鼠Her2阳性MDA-MB-231克隆16乳腺癌异种移植模型中的体内效力的图。图5是描述与Eg5抑制剂缀合的抗Her2免疫缀合物在小鼠Her2阳性MDA-MB-453乳腺癌异种移植模型中的体内效力的图。图6是描述与Eg5抑制剂缀合的抗Her2免疫缀合物在小鼠Her2阳性HCC1954乳腺癌异种移植模型中的体内效力的图。图7是描述来自与化合物F缀合的抗cKITADC在小鼠的H526肿瘤异种移植模型中体内效力研究的结果的图。化合物F与半胱氨酸工程化cKIT抗体或野生型cKIT抗体缀合。包括抗Her2免疫缀合物作为无结合作用的对照。图8是描述来自抗体抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F(图8A)和抗体抗cKIT-化合物F(图8B)ADC按剂量1mg/kg在未用过药的小鼠中药代动力学研究的结果的图。图9是描述两种不同化合物缀合至两种不同半胱氨酸工程化抗体的抗cKIT免疫缀合物在小鼠的H526肿瘤异种移植模型中体内效力的图。发明详述本申请提供位点特异性标记抗体或抗体片段的方法，所述方法通过将特定位置处亲本抗体或抗体片段的一个或多个氨基酸替换为半胱氨酸氨基酸(“Cys”)，从而工程化抗体或抗体片段能够缀合至多种药剂(例如，细胞毒性剂)。本申请还提供通过使用本文所述的方法产生的免疫缀合物。当半胱氨酸工程化到亲本抗体或抗体片段中时，首先从表达培养基回收修饰的抗体或抗体片段，其具有半胱氨酸或谷胱甘肽(GSH)借助二硫键在工程化的半胱氨酸位点接合(Chen等人,(2009)mAbs16,353-571)。接合的半胱氨酸或GSH随后在还原步骤移除，所述还原步骤也还原亲本抗体或抗体片段的全部天然链间二硫键。在第二步骤中，这些二硫键在缀合发生前再氧化。本公开显示，当半胱氨酸在某些位点工程化时，再氧化步骤进展不良，这推定地归因于不正确的二硫键形成。因此，本申请分别在抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区上提供独特的位点集合，其中如本文所述的Cys置换产生修饰的抗体或抗体片段，所述修饰的抗体或抗体片段在再氧化过程中进展良好并且还产生稳定的和行为良好的免疫缀合物。本申请的位点特异性抗体标记可以用多种化学可及的标记试剂如抗癌药、荧光团、肽、糖、去垢剂、聚乙二醇、免疫增效剂、放射成像探针、前药和其他分子实现。因此，本申请提供制备用于癌疗法和其他适应症以及成像试剂的具有确定药物/抗体比的均一免疫缀合物的方法。本申请还提供藉此制备的免疫缀合物，以及包含这些免疫缀合物的药物组合物。本申请的方法可以与本领域已知的其他缀合方法组合使用。以下列举的实施方案代表本申请的某些方面和变型：其中Ab代表抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含至少一个在本文所述的优选半胱氨酸置换位点之一处的半胱氨酸残基；LU是如本文所述的接头单元；X是有效载荷或药物部分；并且n是从1至16的整数。在这些实施方案中，n优选地是约2、约4、约6或约8。LU一般是式–L1-L2-L3-L4-L5-L6-的基团，其中L1、L2、L3、L4、L5和L6独立选自-A1-、-A1X2-和-X2-；其中：A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；每个X2独立地选自键、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在这些实施方案的一些实施方案中，免疫缀合物包含下式的基团或者其中硫原子是修饰的抗体或抗体片段中半胱氨酸残基的硫并且位于本文中确定的置换位点之一处。在任一前述实施方案中，半胱氨酸置换位点可以是与通过位置编号确定的位点之一对应的位置，尽管序列中位点的位置已经因修饰或截短全长抗体而改变。可以通过抗体或片段与全长抗体比对，轻易地确定相应位点。1.位点特异性半胱氨酸工程化抗体位点特异性标记本申请的抗体(例如，亲本抗体，任选地含有一个或多个非规范氨基酸)根据如Edelman等人,(1969)Proc.Natl.Acad.USA63:78-85中所述的EU编号体系编号，但除了λ轻链根据如Kabat等人,(1991)第5版,NIH出版编号91-3242中所述的Kabat编号体系编号外。本申请通篇范围内使用人IgG1恒定区作为代表。然而，本申请不限于人IgG1；可以通过序列比对轻易地导出相应氨基酸位置。例如，图1显示以下重链恒定区的序列比对结果：抗体曲妥珠单抗野生型重链恒定区(其序列是STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO:155))、人IgG1重链恒定区(其序列是STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO:151))、IgG2重链恒定区(其序列是STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO:152))、IgG3重链恒定区(其序列是STKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG(SEQIDNO:152))、和IgG4重链恒定区(其序列是STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQIDNO:153))，从而IgG1恒定区中确定的Cys工程化位点可以轻易地对IgG2、IgG3和IgG4进行确定，如图1中所示。对于轻链恒定区，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4是相同的(人抗体曲妥珠单抗的全长野生型轻链序列是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:90))。下表1列出了抗体重链恒定区中可以被半胱氨酸替换的氨基酸位置。表2A列出了抗体κ轻链恒定区中可以被半胱氨酸替换的氨基酸位置。表2B列出了抗体λ轻链恒定区中可以被半胱氨酸替换的氨基酸位置。表1.在人IgG1的重链恒定区中确定的半胱氨酸置换位点(位点根据EU编号体系编号)。表2A.在人IgG1的κ轻链恒定区中确定的半胱氨酸置换位点(位点根据EU编号体系编号)。表2B.在人IgG1的λ轻链上确定的半胱氨酸置换位点因为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体的恒定区的序列同源性高，本申请的发现不限于任何具体抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本申请提供包含修饰的抗体或其抗体片段及药物部分的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或其抗体片段包含在其重链恒定区上一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的置换。在本申请的一个实施方案中，本文所述的氨基酸置换是包含巯基的半胱氨酸。在本申请的一些方面，巯基用于化学缀合并且与接头单元(LU)和/或药物部分接合。在一些实施方案中，本申请的免疫缀合物包含药物部分，所述药物部分选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞司他汀、海兔毒素、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、Eg5抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。在一些实施方案中，本申请的免疫缀合物包含作为抗癌药的药物部分。本申请的修饰的抗体或抗体片段可以是本领域已知的任何样式，如单克隆、嵌合、人源化、全人、双特异性或多特异性抗体或其抗体片段。根据本申请，修饰的抗体重链和/或轻链(或其抗体片段)可以在其恒定区中含有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个半胱氨酸置换。在一个实施方案中，修饰的抗体或抗体片段在其恒定区中含有2、4、6、8个或更多个半胱氨酸置换。在一些实施方案中，修饰的抗体、其抗体片段或免疫缀合物包含4个或更多个Cys置换。在一个实施方案中，亲本抗体(无半胱氨酸置换的抗体)是IgG、IgM、IgE或IgA抗体。在一个具体实施方案中，亲本抗体是IgG1抗体。在另一个具体实施方案中，亲本抗体是IgG2、IgG3、或IgG4抗体。本申请还提供了在其选自表1中确定的位置中的重链恒定区上包含一个或多个氨基酸置换的修饰抗体或其抗体片段。在一些实施方案中，本申请提供了在其选自表2A或表2B中确定的位置中的轻链恒定区上包含一个或多个氨基酸置换的修饰抗体或其抗体片段。在其他实施方案中，修饰抗体或其抗体片段在其选自表1中确定的位置中的重链恒定区上包含一个或多个氨基酸，并在其选自表2A中确定的位置中的轻链恒定区上包含一个或多个氨基酸。在某些实施方案中，使用与本领域已知的其他缀合方法组合的本申请方法，标记本文中提供的修饰的抗体或抗体片段，所述其他缀合方法包括但不限于通过赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、甲酰基-甘氨酸、吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸、非天然氨基酸和用于酶介导缀合的蛋白质标签(例如，S6标签)的化学选择性缀合。2.缀合化学本文提供的缀合抗体或其抗体片段通过翻译后修饰至少一个半胱氨酸残基产生，其中所述半胱氨酸残基通过位点特异性标记方法并入如上文所述的抗体或其抗体片段中。可以通过本领域已知用于目的有效载荷与蛋白质中天然存在的半胱氨酸残基缀合的方法和通过描述用于缀合至下述蛋白质的方法，制备缀合的抗体或抗体片段，所述蛋白质经工程化以含有用额外的半胱氨酸残基置换天然蛋白质序列的另一个氨基酸。在某些实施方案中，使用如以下方案Ia所示的其中并入的半胱氨酸(cys)与马来酰亚胺衍生物缀合的已知方法，缀合本文中提供的修饰的抗体或其抗体片段。经历这种类型缀合的本申请的修饰抗体含有巯基-马来酰亚胺键。方案Ia.通过形成巯基-马来酰亚胺加合物的缀合。其中：LU是接头单元(LU)，并且X是有效载荷或药物部分。在其他实施方案中，通过与α-卤素羰基化合物如氯乙酰胺、溴乙酰胺或碘乙酰胺反应，缀合在修饰的抗体或抗体片段中并入的Cys，如下文方案Ib中所示。可以理解，卤素之外的其他离去基团如甲苯磺酸盐、三氟甲烷磺盐和其他烷基或芳基磺酸盐，可以用作离去基团Y。尽管方案Ib描述了Cys巯基与α-卤素乙酰胺的反应，但是该方法包括用式Y-CHR-C(＝O)-的基团对所并入的Cys的硫的任何烷基化，其中R是H或C1-4烷基，Y是离去基团(一般Cl、Br或I、并且任选地是烷基磺酸盐或芳基磺酸盐)；它不限于酰胺。方案Ib.通过与α-卤素羰基化合物反应而缀合。Y是离去基团(Cl、Br、I、OTs、OTf等)LU是接头单元X是有效载荷或药物部分备选地，可以通过在诱导二硫键于外部巯基和所并入的半胱氨酸残基的硫原子之间形成的条件下与外部巯基的反应，缀合修饰的抗体或抗体片段中并入的Cys，如以下方案Ic中所显示。在这些例子中，R可以是H；然而，已经发现其中一个或两个R基团代表烷基例如甲基的化合物增加二硫键的稳定性。方案Ic.通过形成二硫键而缀合。每个R独立地是H或C1-4烷基LU是接头单元X是有效载荷或药物部分仅以举例方式，这类翻译后修饰在上文方案(Ia)-(Ic)中显示，其中起始结构代表在抗体轻链或重链中本文确定的特定位点之一处并入的半胱氨酸。用于实施这些缀合方法中每一者的方法是本领域熟知的。抗体可以通过这些方法在其轻链或其重链、或在轻链和重链中被修饰。其中已经修饰每条轻链或每条重链以含有单个并入的半胱氨酸的抗体通常将含有两个缀合位点，因为抗体一般含有两条轻链和两条重链。一旦缀合，本申请的修饰抗体一般含有1-12个、往往2-8个和优选地2、4或6个–LU-X(接头单元-有效载荷)部分。在一些实施方案中，修饰抗体轻链或重链以在本文中确定用于Cys置换的两个特定位点处并入两个新Cys残基(或备选地，一个Cys并入轻链中和一个Cys并入重链中)，从而四聚体抗体最终含有四个缀合位点。类似地，可以通过在轻链或重链或其组合中本文确定的特定位点处将其3或4个天然氨基酸替换为Cys，从而在四聚体抗体中产生6或8个缀合位点，修饰抗体。这些缀合物中的X代表有效载荷，所述有效载荷可以是可用于接合至抗体任何化学部分。在一些实施方案中，X是选自细胞毒素、抗癌药、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药、免疫增效剂和麻醉药或任何其他治疗药、或生物活性部分或药物部分中的药物部分。在其他实施方案中，X是标记物如生物物理探针、荧光团、亲和力探针、光谱探针、放射性探针、自旋标记物或量子点。在其他实施方案中，X是调节抗体的物理化学特性的化学部分如脂质分子、聚乙烯二醇、聚合物、多糖、脂质体或螯合剂。在其他实施方案中，X是有功能的或可检出的生物分子如核酸、核糖核酸、蛋白质、肽(例如，酶或受体)、糖或多糖、抗体或抗体片段。在其他实施方案中，X是锚定部分如纳米粒子、PLGA粒子、或表面、或使缀合物特异性结合另一个部分的任何结合部分如组氨酸标签、多聚G、生物素、亲和素、链霉亲和素等。在其他实施方案中，X是可以用来使抗体缀合物接合另一个化学部分(如药物部分、标记物、另一种抗体、另一个化学部分或表面)的反应性官能团。接头单元(LU)可以是使巯基反应性基团(例如，马来酰亚胺、α-卤素羰基、乙烯基羰基(例如，丙烯酸酯或丙烯酰胺)、乙烯基砜、乙烯基吡啶或巯基)共价接合至有效载荷的任何合适的化学部分。许多合适的LU是本领域已知的。例如，LU可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或多于六个本文中称作L1、L2、L3、L4、L5和L6接头。在某些实施方案中，LU包含选自非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头、光可切割接头或其任何组合，并且LU任选地含有自降解(self-immolative)间隔子。在一些实施方案中，LU是式-L1-L2-L3-L4-或-L1-L-L3-L4-L5-L6-的基团。用于LU中的连接基L1、L2、L3、L4、L5和L6包括亚烷基团-(CH2)n-(其中n是1-20，一般是1-10或1-6)、乙二醇单位(-CH2CH2O-)n(其中n是1-20，一般是1-10或1-6)、酰胺–C(＝O)-NH-或–NH-C(＝O)-、酯–C(＝O)-O-或–O-C(＝O)-、具有两个可用接合点的环如二价苯基、C3-8环烷基或C4-8杂环基团、氨基酸–NH-CHR*-C＝O-或–C(＝O)-CHR*-NH-，其中R*是已知氨基酸的侧链(往往是规范氨基酸之一，但也包括例如正缬氨酸、正亮氨酸、高丝氨酸、同型半胱氨酸、苯基甘氨酸、瓜氨酸和其他指定的α-氨基酸)、具有已知氨基酸的多肽(例如，二肽、三肽、四肽等)、巯基-马来酰亚胺键(来自添加–SH至马来酰亚胺)、-S-CR2-和其他硫醚如-S-CR2-C(＝O)-或-C(＝O)-CR2-S-，其中R是如上文对方案Ic定义，-CH2-C(＝O)-和二硫键(-S-S-)、以及上述这些与下述其他接头(例如，键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头、光可切割接头或包含自降解间隔子的接头)的任何组合。在一些实施方案中，当LU是-L1-L2-L3-L4-L5-L6-时，L1、L2、L3、L4、L5和L6可以选自：-A1-、-A1X2-和-X2-；其中：A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；每个X2独立地选自键、R8、-S-、-Si(OH)2O-、CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在一些实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6至少之一是稳定或不可切割的接头。在一些实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6至少之一是可切割的接头，所述接头可以是化学可切割的(腙、二硫化物)或酶促可切割的。在一些实施方案中，酶促可切割的接头是一个轻易由肽酶切割的接头：Val-Cit接头(缬氨酸-瓜氨酸)是一个这样的接头，其是具有两个已知氨基酸的二肽。在其他实施方案中，酶促可切割的接头是一个由葡糖醛酸糖苷酶的活性触发的接头：是这种接头的例子，所述接头还包含在生理条件下一旦葡糖醛酸糖苷酶切割糖苷键就自发降解的自降解间隔子。在一些实施方案中，本申请的免疫缀合物包含式IIA或式IIB的修饰半胱氨酸残基：或者其中–CH2-S-代表在本文所述的选定Cys置换位点之一处并入的Cys的侧链，并且L2–L6和X分别代表连接基团和有效载荷，如本文进一步描述。在IIA的一些实施方案中，L2是键。在IIB的一些实施方案中，L2是NH或O。在IIA和IIB二者的一些实施方案中，L3选自(CH2)1-10和(CH2CH2O)1-6。L4、L5和L6是选自本文所述那些接头的额外的任选接头。在某些实施方案中，L6可以是羰基(C＝O)或包含自降解间隔子的接头。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中：L1是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头；L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头；L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头，并且L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头、光可切割接头或包含自降解间隔子的接头。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中L1是非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头；L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头；L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头，并且L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头、光可切割接头或包含自降解间隔子的接头。在LU的一些实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6的至少之一是可切割接头，并且LU视为可切割的。类似地，在LU的一些实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6至少之一是不可切割的接头。在这些实施方案的某些中，LU的每个接头是不可切割的，并且LU视为不可切割。在LU是–L1–L2–L3–L4–的一些前述实施方案中，L1、L2、L3和L4至少之一是选自-A1-、-A1X2-和-X2-的接头；其中：A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；每个X2独立地选自键、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在这些实施方案中，LU的其他接头独立选自键、-A1-、-A1X2-、-X2-、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头、光可切割接头和包含自降解间隔子的接头。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；其中：A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；每个X2独立地选自键、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头；L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头，并且L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头、光可切割接头或包含自降解间隔子的接头。在某些实施方案中，L1是C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-CH2CH2-S-，因此LU是–C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-CH2CH2-S-L2-L3-L4-。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；其中：A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；每个X2独立地选自键、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头；L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头；L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头、光可切割接头或包含自降解间隔子的接头。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；其中：A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；每个X2独立地选自键、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；L2是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头；L3是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头或光可切割接头，并且L4是键、非酶促可切割的接头、不可切割的接头、酶促可切割的接头、光稳定性接头、光可切割接头或包含自降解间隔子的接头。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；其中：A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；每个X2独立地选自键、R8、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；L2是键、非酶促可切割的接头或不可切割的接头；L3是键、非酶促可切割的接头或不可切割的接头；L4是键、酶促可切割的接头或包含自降解间隔子的接头。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；L2是键、-A2-或-A2X2-；L3是键、-A3-或-A3X2-；L4是键、-A4-、-A4X2-、A1是-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；A2是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NR4-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nS-、-(C(R4)2)nS-、-S(CH2)n-、-S(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH-、-(C(R4)2)nNH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(＝O)NH(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、A3是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nS-、-(C(R4)2)nS-、-S(CH2)n-、-S(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-,-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(＝O)NH(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(CH2)n(O(CH2)n)mOC(＝O)-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mOC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mC(＝O)-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mC(＝O)-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、A4是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)m-、-(O(C(R4)2)n)m-,-((CH2)nO)m-、-((C(R4)2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(((C(R4)2)nO)mC(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-NHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-S(C(R4)2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)NH(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(C(R4)2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)n(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(C(R4)2)nNHC(＝O)(C(R4)2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(C(R4)2)nNH((C(R4)2)nO)m(C(R4)2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或-(O(C(R4)2)n)mNHC(＝O)(C(R4)2)n-；每个X2独立地选自键、R8-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；L2是键、-A2-或-A2X2-；L3是键、-A3-或-A3X2-；L4是键、-A4-、-A4X2-、A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；A2是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或A3是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或A4是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-S(CH2)nC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-C(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)-、-(CH2)n(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；每个X2独立地选自键、-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在某些实施方案中，接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，其中L1是键、-A1-、-A1X2-或-X2-；L2是键、-A2-或-A2X2-；L3是键、-A3-或-A3X2-；L4是键、-A4-、-A4X2-、A1是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；A2是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-,-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或A3是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-、-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-或A4是-C(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)n-、-C(＝O)NH(CH2)nS-、-(O(CH2)n)m-、-((CH2)nO)m(CH2)n-、-NHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-、-(CH2)nNH((CH2)nO)m(CH2)n-或-(O(CH2)n)mNHC(＝O)(CH2)n-；每个X2独立地选自键、R8-S-、-Si(OH)2O-、-CHR4(CH2)nC(＝O)NH-、-CHR4(CH2)nNHC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；每个R4独立地选自H、C1-4烷基、已知氨基酸的侧链、-C(＝O)OH和-OH，每个R5独立地选自H、C1-4烷基、苯基或以1至3个–OH基团取代的C1-4烷基；每个R6独立地选自H、氟、以-C(＝O)OH取代的苄氧基、以–C(＝O)OH取代的苄基、以-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和以–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；R7独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；R8独立地选自R9独立地选自H和C1-6卤代烷基；每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9，并且每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在一个实施方案中，L1是–(CH2)1-10-C(＝O)-，例如，–(CH2)5-C(＝O)-；并且L2、L3和L4各自代表键。在某些实施方案中，LU包含这种式的val-cit接头，其中X代表有效载荷，一般是药物部分，如具有抗癌活性的一种药物部分：当L4-L5-L6是如上显示的val-cit接头时，L3优选地是–(CH2)2-6-C(＝O)-。在某些实施方案中，X基团是类美登素如DM1或DM4、或海兔毒素类似物或衍生物如海兔毒素10或15和澳瑞司他汀MMAF或MMAE、或刺孢霉素如N-乙酰基-γ-刺孢霉素、或标记物或染料如罗丹明或四甲基罗丹明。如本文所用，“接头”是能够连接抗体或其片段至X基团(有效载荷)以形成免疫缀合物的任何化学部分。接头可以在化合物或抗体仍保持活性的条件下易受切割，如，酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。备选地，接头可以基本上抵抗切割。接头可以包括或可以不包括自降解间隔子。如本文用来使X1基团与本文提供的修饰抗体或其抗体片段缀合的非酶促可切割接头的非限制性例子包括酸不稳定接头、含有二硫键部分的接头、含有三唑部分的接头、含有腙部分的接头、含有硫醚部分的接头、含有重氮基部分的接头、含有肟部分的接头、含有酰胺部分的接头和含有乙酰胺部分的接头。如本文用来使X基团与本文提供的修饰抗体或其抗体片段缀合的酶促可切割接头的非限制性例子包括但不限于受蛋白酶切割的接头、受酰胺酶切割的接头和受β-葡糖醛酸糖苷酶或另一种糖苷酶切割的接头。在某些实施方案中，这类酶可切割接头是受组织蛋白酶切割的接头，所述组织蛋白酶包括组织蛋白酶Z、组织蛋白酶B、组织蛋白酶H和组织蛋白酶C。在某些实施方案中，酶促可切割的接头是受组织蛋白酶切割的二肽，所述二肽包括受组织蛋白酶Z、组织蛋白酶B、组织蛋白酶H或组织蛋白酶C切割的二肽。在某些实施方案中，酶促可切割的接头是组织蛋白酶B可切割的肽接头。在某些实施方案中，酶促可切割的接头是组织蛋白酶B可切割的二肽接头。在某些实施方案中，酶促可切割的二肽接头是缬氨酸-瓜氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸。如本文用来使X基团与本文提供的修饰抗体或其抗体片段缀合的酶促可切割接头的其他非限制性例子包括但不限于受β-葡糖醛酸糖苷酶切割的接头，例如，参见Ducry等人,BioconjugateChem,(2010)vol.21(1),5-13。“自降解间隔子”是双官能化学部分，所述双官能化学部分在一个末端与第一化学部分共价连接并且在另一个末端与第二化学部分共价连接，因而形成稳定的三部分分子。接头可以包含与化学或酶促地从间隔子可切割的第三化学部分结合的自降解间隔子。一旦切割自降解间隔子和第一化学部分或第三化学部分之间的键，则自降解间隔子发生快速和自发的分子内反应并且因而从第二化学部分分离。这些分子内反应通常涉及电子重排如1,4、或1,6、或1,8消去反应或环化以形成高度有利的五元或六元环。在本申请的某些实施方案中，第一或第三部分是酶可切割的基团，并且这种切割因酶促反应所致，而在其他实施方案中，第一或第三部分是酸不稳定基并且这种切割因pH的变化而发生。如适用于本申请，第二部分是如本文定义的“有效载荷”基团。在某些实施方案中，第一或第三部分从自降解间隔子中的切下因蛋白水解酶的切割作用所致，而在其他实施方案中，它因水解酶切割所致。在某些实施方案中，第一或第三部分从自降解间隔子中的切下因组织蛋白酶或葡糖醛酸糖苷酶的切割作用所致。在某些实施方案中，酶可切割接头是肽接头并且自降解间隔子在其一个末端共价连接至肽接头并且在另一个接头共价连接至药物部分。这个三部分分子是稳定的并且在不存在酶的情况下无药理学活性，但是所述分子是由酶在共价连接间隔子部分和肽部分的键处酶促可切割的。肽部分从三部分分子切下，这启动间隔子部分的自我降解特征，导致自发切割间隔子部分与药物部分共价连接的键，因而实现药物以药理活性形式释放。在其他实施方案中，接头包含在一个末端直接或间接连接至肽和在另一端连接至有效载荷的自降解间隔子；并且间隔子与可以从间隔子(如由葡糖醛酸糖苷酶)酶促切下的第三部分接合。一旦切割第三部分，则间隔子以引起有效载荷释放的方式降解或重排。具有这种类型的自降解间隔子的接头的例子是葡糖醛酸糖苷酶可切割的这种接头，其中葡糖醛酸酶催化的缩醛水解释放了生理条件下自发降解的酚化合物：任选地用于X1基团与本文提供的修饰的抗体或其抗体片段缀合中的自降解间隔子的非限制性例子包括但不限于以下部分：包含苄基羰基部分、苄基醚部分、4-氨基丁酸酯部分、半硫胺(hemithioaminal)部分或N-酰基半硫胺部分。自降解间隔子的其他例子包括但不限于对氨基苯甲氧基羰基、电子上类似于对氨基苯甲氧基羰基的芳香族化合物如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物和邻氨基苄基乙缩醛或对氨基苄基乙缩醛。在某些实施方案中，当酰胺键水解时经历环化的本文所用的自降解间隔子包括取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺和2-氨基苯基丙酸酰胺。在某些实施方案中，自降解间隔子是而在其他实施方案中，自降解间隔子是其中n是0或1。在其他实施方案中，自降解间隔子是其中n是1或2。在其他实施方案中，自降解间隔子是其中n是1或2。在其他实施方案中，自降解间隔子是其中n是1或2。在其他实施方案中，自降解间隔子是其中n是1或2。方案(2a-2c)显示本文提供的修饰抗体或其抗体片段的翻译后修饰，其中接头单元(LU)是–L1–L2–L3–L4–，并且在每种情况下L1是与新Cys反应的基团。方案2a.方案2b.方案3c.在方案2a-2c的每个方案中，起始物质是如本文所述修饰的抗体或抗体片段中的Cys替换残基，其中划虚线的键表示连接至抗体或抗体片段的毗邻残基；每个R是H或C1-4烷基、一般是H或甲基；L2、L3和L4是连接单元LU的组件，如上文描述的那些；X是有效载荷；并且使L2与本申请的取代基Cys的硫连接的基团是L1。在本申请的一些实施方案中，X是可以用来通过与合适的互补的官能团相互作用，使缀合的抗体与另一个化学部分连接的反应性官能团。表3描述X可以代表的反应性官能团的一些例子，以及可以用来使包含X的缀合物与另一种化合物连接的互补官能团。使用X连接至相应互补官能团的方法是本领域熟知的。使用叠氮化物的连接一般使用‘点击(Click)’或无铜点击化学进行；涉及肼、烷氧基胺或酰基肼的反应一般通过与羰基官能团之一形成西夫碱推进。表3使用这些组件产生的示例性连接产物在表4中描述，其中Y1代表本申请的抗体，A1代表连接抗体至有效载荷Xa的连接单元(LU)，式II-a中的-L2-L3-L4-代表可以在分子中存在以通过Xa与缀合的抗体连接的接头单元，并且X1代表有效载荷。有效载荷Xa是反应性官能团，并且在式II-a上的Xb是相应的互补官能团，并且式II-a本身代表与缀合的抗体连接的分子。表4中的第三列描述了来自Xa与Xb反应的产物。表4在某些实施方案中，本文提供的修饰的抗体或其抗体片段以约1和16之间如1-12、或1、2、3、4、5、6、7或8的“X基团对抗体”(有效载荷对抗体)比率缀合，其中修饰的抗体或其抗体片段含有1、2、3、4、5、6、7或8个在本文公开的特定位点处并入的半胱氨酸残基。例如，可以通过并入两个Cys残基至抗体重链中，实现“X基团对抗体”比率4，所述抗体重链将会含有4个缀合位点，每条重链各有两个。这类抗体的免疫缀合物将含有高达4个有效载荷基团，所述有效载荷基团可以相似或不同，且优选地是全部相似。在另一个例子中，可以通过将一个Cys残基并入抗体的重链中并将第二个Cys残基并入抗体的轻链中，实现“X基团对抗体”比率4，导致4个缀合位点，两个在两条重链中和两个在两条轻链中。可以通过在抗体的重链和轻链中组合本申请的3、4个或更多个半胱氨酸置换，实现6、8或更高的比率。将多个半胱氨酸基团置换至抗体中可能导致不适宜的二硫键形成和其他问题。因此对于负载多于4个有效载荷基团到一个抗体分子上，本申请的方法可以备选地与不依赖在半胱氨酸硫处反应的方法(如在赖氨酸处酰化或通过S6标签或Pcl方法学缀合)组合。尽管对于特定缀合物分子而言，有效载荷对抗体比率具有确切的值，但是可以理解当用来描述含有许多分子的样品时，该值将经常是平均值，原因在于某种程度的均一性，一般在缀合步骤中。免疫缀合物样品的平均载量在本文中称作药物对抗体比率或“DAR”。在一些实施方案中，DAR在约4至约16之间，并且一般是约4、5、6、7、8。在一些实施方案中，以重量计至少50％的样品是具有加或减2的平均比率的化合物，并且优选地至少50％的样品是含有平均比率加或减1的缀合物。优选实施方案包括其中DAR是约2或约8，例如约2、约4、约6或约8的免疫缀合物。在一些实施方案中，‘约n’的DAR意指DAR的测量值在n的10％内部(在式(I)中)。3.Fc区构架的进一步改变本申请提供位点特异性标记的免疫缀合物。本申请的免疫缀合物可以包含修饰的抗体或其抗体片段，所述修饰的抗体或其抗原结合片段还在VH和/或VL内部包含对构架残基的修饰，例如以改善抗体的特性。一般地，进行这种构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方案是将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地，已经历过体细胞突变的抗体可以含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。可以通过将抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列比较而确定这类残基。为了使构架区序列恢复其种系构型，可以例如通过位点定向诱变，将体细胞突变“回复突变”成种系序列。此类“回复突变的”抗体也意在由本申请涵盖。另一个类型的构架修饰涉及使构架区内部、或甚至一个或多个CDR区内部的一个或多个残基突变，以移除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，并进一步详细描述于Carr等的美国专利公开号20030153043中。除在构架区或CDR区内进行的修饰外，本申请的抗体还可以或备选地可以被改造以包括Fc区内的修饰，通常用来改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半寿期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可化学修饰(例如，一个或多个化学部分可连接到抗体上)或修饰本申请的抗体以改变其糖基化，进而改变抗体的一种或多种功能性质。下文中进一步详细描述了这些实施方案中的每一个方案。在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得改变例如增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。Bodmer等的美国专利号5,677,425中进一步描述了该方法。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，例如用来便于轻链和重链的装配、或提高或降低抗体的稳定性。在另一实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物半寿期。更特别地，可以向Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得抗体相对于天然的Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。在Ward等人的美国专利号6,165,745中更详细地描述了这种方法。还在其他实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同氨基酸残基，改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可用不同氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变对配体的亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中描述。在另一实施方案中，可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中描述这种方法。在另一实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。在例如Bodmer等人的PCT公开WO94/29351中描述了这种方法。在一个具体实施方案中，将本申请的抗体或其抗体片段的一个或多个氨基酸替换为一个或多个异型氨基酸残基。异型氨基酸残基还包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所描述。还在另一实施方案中，修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力，和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。在例如Presta的PCT公开WO00/42072中描述了这种方法。另外，已经绘制了人IgG1上FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改进的结合作用的变体(见Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。还在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以产生非糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以便例如增加抗体对抗原的亲和力。这类糖修饰也可以通过例如改变抗体序列内部的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以产生一个或多个氨基酸置换，所述氨基酸置换导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除在这个位点处的糖基化。这种非糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中描述了这种方法。额外地或备选地，可以产生一种抗体，所述抗体具有改变的糖基化类型，如岩藻糖残基数量减少的过低岩藻糖基化的抗体或对分型GlcNac结构增加的抗体。这类改变的糖基化模式已经展示增加抗体的ADCC能力。这类糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化装置的宿主细胞中表达这种抗体而完成。已经在本领域中描述了具有改变的糖基化装置的细胞，并且该细胞可用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP1,176,195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上遭破坏的细胞系，从而在这种细胞系中表达的抗体显示过低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO03/035835描述了一种变异CHO细胞系(Lecl3细胞)，所述细胞系具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)联糖的能力，这也导致在这种宿主细胞中表达的抗体过低岩藻糖基化(还见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而在这种工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的对分GlcNac结构，这导致抗体的增加的ADCC活性(还参见Umana等人,Nat.Biotech.17:176-180,1999)。在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物半寿期。可使用多种方法。例如，可以引入以下一种或多种突变：T252L、T254S或T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述。备选地，为了增加生物半寿期，可以在CH1或CL区内部改变抗体以含有救援受体(salvagereceptor)结合表位，所述救援受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如Presta等人的美国专利5,869,046和6,121,022中所述。4.抗体缀合物本申请提供位点特异性标记方法、修饰的抗体及其抗体片段和如此制备的免疫缀合物。使用本申请的方法，可将修饰的抗体或其抗体片段缀合于标记物，如药物部分，例如，抗癌药、自身免疫治疗药、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药、或麻醉药、或成像试剂如PET成像用螯合剂、或荧光标记物、或MRI造影试剂(contrastreagent)。也可以使用几个相同或不同标记部分，将本申请方法与其他缀合方法组合，来缀合抗体或抗体片段。在某些实施方案中，本申请的免疫缀合物包含药物部分，所述药物部分选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞司他汀、海兔毒素、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、拓扑异构酶抑制剂、RNA合成抑制剂、驱动蛋白抑制剂、蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂、Eg5抑制剂、和DHFR抑制剂。另外，本申请的修饰的抗体或抗体片段可以与调节给定生物学反应的药物部分缀合。药物部分不得解释为限于经典的化学治疗药。例如，药物部分可以是免疫调节物，如免疫增效剂、小分子免疫增效剂、TLR激动剂、CpG寡聚体、TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR9激动剂、TLR8激动剂、T细胞表位肽等。药物部分也可以是寡核苷酸、siRNA、shRNA、cDNA等。备选地，药物部分可以是拥有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素、蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活物、细胞因子、凋亡剂、抗血管生成剂、或生物学应答调节物，例如淋巴因子。在一个实施方案中，本申请的修饰的抗体或抗体片段与药物部分、如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。细胞毒素的例子包括但不限于紫杉烷类(参见例如，国际(PCT)专利申请号WO01/38318和PCT/US03/02675)、DNA烷化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、微管溶素类似物、倍癌霉素(duocarmycin)类似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、类美登素和细胞毒药物，包含反应性聚乙二醇部分(参见例如，Sasse等人,J.Antibiot.(Tokyo),53,879-85(2000)；Suzawa等人,Bioorg.Med.Chem.,8,2175-84(2000)；Ichimura等人,J.Antibiot.(Tokyo),44,1045-53(1991)；Francisco等人,(2003)(电子出版先于印刷出版))、美国专利号5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931、美国专利申请公开号2001/0036923A1、待决美国专利申请系列号10/024,290和10/116,053和国际(PCT)专利申请号WO01/49698)、紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙碱、多柔比星、佐柔比星、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、消融剂(例如，氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仓、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂、蒽环类(例如，佐柔比星(以前称作柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前称作放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂药(例如，长春新碱和长春碱)。(参见例如，SeattleGeneticsUS20090304721)。可以与本申请的修饰的抗体或抗体片段缀合的治疗性细胞毒素的其他例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生和澳瑞司他汀和其衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的例子是可商业获得的(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。关于各种细胞毒素、接头和用于治疗药与抗体缀合的方法的进一步讨论，还参见Saito等人,(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215；Trail等人,(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；Payne,(2003)CancerCell3:207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。根据本申请，修饰的抗体或其抗体片段也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药物，称作放射免疫缀合物。可以与抗体缀合的用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的例子是可商业获得的，包括ZevalinTM(IDECPharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals)，并且相似的方法可以用来利用本申请的抗体制备放射免疫缀合物。在某些实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子附着到抗体上。这类接头分子是本领域共知的并且在Denardo等人,(1998)ClinCancerRes.4(10):2483-90；Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中描述，所述文献每篇通过引用的方式完整并入。本申请还提供了与抗原特异性结合的修饰的抗体或其片段。修饰的抗体或片段可以与异源蛋白或多肽(或其片段、优选地与至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)缀合或融合以产生融合蛋白。特别地，本申请提供融合蛋白，所述融合蛋白包含本文所述的抗体片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)和异源蛋白、多肽或肽。在一些实施方案中，本申请的无抗原结合特异性的修饰抗体片段，如但不限于半胱氨酸残基工程化的修饰Fc结构域，用来产生包含这种抗体片段(例如，工程化Fc)和异源蛋白、多肽或肽的融合蛋白。可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)技术，产生其他融合蛋白。可利用DNA改组来改变本申请抗体或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人,(1997),Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,(1998),TrendsBiotechnol.16(2):76-82；Hansson等人,(1999),J.Mol.Biol.287:265-76；和Lorenzo和Blasco,(1998),Biotechniques24(2):308-313(这些专利和出版物的每篇每因而通过引用方式完整地并入)。可以通过在重组之前借助易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法经历随机诱变，改变抗体或其片段或编码的抗体或其片段。编码与抗原特异性结合的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、节段、部分、结构域、片段等重组。另外，本申请的修饰的抗体或其抗体片段可以缀合于标记序列，如促进纯化的肽。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的标签等，它们中的许多是可商业获得的。如Gentz等,(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824中所述，例如，六组氨酸为纯化融合蛋白提供了便利。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,(1984)Cell37:767)，和“FLAG”标签(A.Einhauer等人,J.Biochem.Biophys.Methods49:455–465,2001)。根据本申请，抗体或抗体片段也可以与渗透肿瘤的肽缀合以提高它们的效力。在其他实施方案中，本申请的修饰抗体或抗体片段与诊断物质或可检测物质缀合。这类免疫缀合物可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的功效)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。可以通过将抗体与可检测物质偶联实现这类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质，如但不限于AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于鲁米诺；生物发光物质，如但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn和117Sn；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。本申请的修饰的抗体或抗体片段也可以接合至固相支持物，所述支持物特别可用于免疫测定法或靶抗原的纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。5.药物组合物为了制备包含免疫缀合物的药物组合物或无菌组合物，将本申请的免疫缀合物与可药用载体或赋形剂混合。该组合物可以额外地含有一种或多种适于治疗或预防癌症(乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤(例如，神经鞘瘤)、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、胶质母细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症和子宫内膜异位症)的其他治疗药。可以通过与生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合以例如冻干散剂、膏剂、水溶液剂、洗剂或混悬剂的形式制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见，例如，Hardman等人,GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.,2001；Gennaro,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,NewYork,N.Y.,2000；Avis等人,(编著),PharmaceuticalDosageForms:ParenteralMedications,MarcelDekker,NY,1993；Lieberman等人,(编著),PharmaceuticalDosageForms:Tablets,MarcelDekker,NY,1990；Lieberman等人,(编著)PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystems,MarcelDekker,NY,1990；Weiner和Kotkoskie,ExcipientToxicityandSafety,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,2000)。治疗剂施用方案的选择取决于若干因素，包括该实体的血清或组织周转率、症状水平、该实体的免疫原性、及在生物基质中的靶细胞可达性。在某些实施方案中，符合可接受的副作用水平，施用方案使递送给患者的治疗剂的量最大化。因此，递送的生物剂的量部分取决于具体实体和所治疗病症的严重性。选择适宜剂量抗体、细胞因子和小分子的指南是可获得的(参见，例如，Wawrzynczak,AntibodyTherapy,BiosScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996；Kresina(编著),MonoclonalAntibodies,CytokinesandArthritis,MarcelDekker,NewYork,N.Y.,1991；Bach(编著),MonoclonalAntibodiesandPeptideTherapyinAutoimmuneDiseases,MarcelDekker,NewYork,N.Y.,1993；Baert等人,NewEngl.J.Med.348:601-608,2003；Milgrom等人,NewEngl.J.Med.341:1966-1973,1999；Slamon等人,NewEngl.J.Med.344:783-792,2001；Beniaminovitz等人,NewEngl.J.Med.342:613-619,2000；Ghosh等人,NewEngl.J.Med.348:24-32,2003；Lipsky等人,NewEngl.J.Med.343:1594-1602,2000)。由临床医生，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的参数或因素确定适宜的剂量。通常，剂量始于或多或少小于最佳剂量的量并此后将它以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所需的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。可改变本申请的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得活性成份的下述量，所述量就具体患者、组合物和施用方式而言可以有效达到所希望的治疗反应，并同时对患者无毒性。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本申请具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域已知的因素。可以通过连续输注或通过以例如，1日、1周或每周1-7次的时间间隔，提供包含本申请的抗体或其片段的组合物。可通过静脉内、皮下、局部、口服、鼻、直肠、肌肉内、脑内或通过吸入来提供剂量。具体剂量方案可以涉及避免显著不良副作用的最大剂量或剂量频率。对于本申请的免疫缀合物，向患者施用的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg、或0.01至0.10mg/kg患者体重之间。可以用以千克(kg)计的患者体重乘以以mg/kg计的待施用剂量来计算本申请的抗体或其片段的剂量。可以重复本申请免疫缀合物的剂量并且各次施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2月、75天、3个月或至少6个月。在一个具体实施方案中，每3周重复本申请的免疫缀合物的剂量。特定患者的有效量可以根据多种因素变动，如正在治疗的病状、患者的总体健康、施用方法、途径和剂量和副作用的严重程度(参见，例如，Maynard等人,AHandbookofSOPsforGoodClinicalPractice,InterpharmPress,BocaRaton,Fla.,1996；Dent,GoodLaboratoryandGoodClinicalPractice,UrchPubl.,London,UK,2001)。施用途径可以是通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑室椎管内、病灶内或通过缓释系统或植入物借助例如局部或皮肤施加、注射或输注(参见例如，Sidman等人,Biopolymers22:547-556,1983；Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.12:98-105,1982；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692,1985；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。如果需要，组合物也可以包含增溶剂和局部麻醉药，如利多卡因，以便减轻注射部位处的疼痛。此外，也可以利用肺部施用法，例如，通过使用吸入器或雾化器和含有雾化剂的制剂。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346和WO99/66903，每份专利通过引用方式完整并入本文。也可用本领域已知的多种方法中的一种或多种方法，经由一种或多种施用途径，施用本申请的组合物。熟练技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变。用于本申请免疫缀合物的所选择施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。胃肠外施用可以是除了肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射进行，并包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。备选地，本申请的组合物可经非胃肠外途径，例如局部、表皮或黏膜施用途径施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。在一个实施方案中，通过输注法施用本申请的免疫缀合物。在另一个实施方案中，皮下施用本申请的免疫缀合物。如果本申请的免疫缀合物在控释或缓释系统中施用，则泵可以用来实现控释或缓释(参见Langer，上文；Sefton,CRCCrit.RefBiomed.Eng.14:20,1987；Buchwald等人,Surgery88:507,1980；Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574,1989)。高分子材料可以用来实现本申请治疗药的控释或缓释(参见例如，MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise(编著),CRCPres.,BocaRaton,Fla.,1974；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(编著),Wiley,NewYork,1984；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1983；还参见Levy等人,Science228:190,1985；During等人,Ann.Neurol.25:351,1989；Howard等人,J.Neurosurg.71:105,1989；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO99/15154；和PCT公开号WO99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤的杂质、储存时稳定、无菌和可生物降解。可以将控释或持续释放系统靠近预防靶或治疗靶布置，因此仅需要全身性剂量的一部分(见，例如，Goodson,引自MedicalApplicationsofControlledRelease,上文,第2卷,第15-138页,1984)。控释系统在Langer,Science249:1527-1533,1990的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术可以用来产生包含本申请的一种或多种免疫缀合物的持续释放制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938，PCT公开WO91/05548，PCT公开WO96/20698，Ning等人,Radiotherapy&Oncology39:179-189,1996；Song等人,PDAJournalPharmaceuticalScience&Technology50:372-397,1995；Cleek等人,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854,1997；和Lam等人,Proc.Int'l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760,1997，所述的每篇文献通过引用方式完整并入本文。如果局部施用本申请的免疫缀合物，则可以将它们按油膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、洗发剂、喷雾剂、气溶胶剂、溶液剂、乳剂的形式或本领域技术人员熟知的其他形式配制。参见，例如，Remington'sPharmaceuticalSciencesandIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,第19版,MackPub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对不可喷雾的局部剂型，通常使用黏性至半固体或固体形式，该形式包含与局部施用相容的载体或一种或多种赋形剂，并在某些情况下具有大于水的动态黏度。合适的制剂包括但不限于溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、油膏剂、散剂、搽剂、药膏剂等，如果需要，将它们进行消毒或与影响多种特性(例如，渗透压)的助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲液或盐)混合。其他合适的局部用剂型包括可喷雾气溶胶制品，其中与固体或液体惰性载体组合的有效成分在一些情况下包装在含有加压的挥发性物质(例如，气态推进剂，如FreonTM)的混合物中或挤瓶中。如果需要，也可以将润湿剂或湿润剂添加至药物组合物和剂型。这类额外成分的例子是本领域熟知的。如果鼻内施用包含免疫缀合物的组合物，则可以将它以气溶胶剂、喷雾剂、雾化剂形式或以滴剂形式配制。具体而言，根据本申请用的预防药或治疗药可以在采用合适推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)的情况下，以从加压的包装或雾化器中提供的气溶胶喷雾剂形式便利地递送。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门、确定剂量单位、以提供经计量的量。可以配制用于吸入器或吹入器中的胶囊剂和套筒剂(cartridge)(由例如明胶组成)，其含有所述化合物及合适散剂基底(powderbase)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。与第二治疗药例如细胞因子、类固醇、化疗药、抗生素或辐射共施用或治疗的方法是本领域已知的(参见，例如，Hardman等人,(编著)(2001)GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第10版,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.；Poole和Peterson(编著)(2001)PharmacotherapeuticsforAdvancedPractice:APracticalApproach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编著)(2001)CancerChemotherapyandBiotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量的治疗剂可使症状减少至少10％、至少20％、至少约30％、至少40％或至少50％。可以与本申请的免疫缀合物组合施用的额外治疗(例如，预防药或治疗药)可以按照与本申请的免疫缀合物间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时，按间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时、或间隔96小时至120小时施用。可在同一次患者就诊中施用2种或更多种疗法。在某些实施方案中，可以配制本申请的免疫缀合物以确保恰当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保本申请的治疗性化合物跨过BBB(如果希望)，可将它们配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见，例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中的部分，因而增强靶向的药物递送(参见，例如Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(见，例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman等人,(1995)FEBSLett.357:140；Owais等人,(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180)；表面活性蛋白质A受体(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4:273。本申请提供向有需求的受试者单独或与其他治疗药组合下施用包含本申请免疫缀合物的药物组合物的方案。本申请联合疗法的治疗(例如，预防药或治疗药)可以同时或依次向受试者施用。本申请联合疗法的治疗(例如，预防药或治疗药)也可以循环施用。循环治疗涉及施用第一治疗药(例如，第一预防药或治疗药)一段时间，随后施用第二治疗药(例如，第二预防药或治疗药)一段时间并重复这种依次施用，即，重复该循环，以减少对一种治疗药(例如药物)的耐药性形成，以避免或减少一种治疗药(例如药物)的副作用和/或以改善治疗药的效力。本申请联合疗法的治疗(例如，预防药或治疗药)可以同时施用至受试者。术语“同时”不限于在完全相同的时间施用治疗(例如，预防药或治疗药)，而是意指将包含本申请抗体或其片段的药物组合以这样的顺序并在这样的时间间隔内施用至受试者，从而本申请的抗体可以与另一种治疗或多种治疗一起发挥作用，以提供与如果另外施加它们相比而言增加的益处。例如，可在同一时间或在不同时点以任意顺序顺次对个体施用各疗法；然而，如果不在同一时间施用，则应在足够接近的时间内施用，以提供希望的治疗效果或预防效果。可以以任意合适的形式和通过任意合适的途径对受试者分开施用各疗法。在多个实施方案中，将治疗(例如，预防药或治疗药)相隔小于15分钟、小于30分钟、小于1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、48小时、72小时或1周施用至受试者。在其他实施方案中，将两种或更多种治疗(例如，预防药或治疗药)在相同的患者访视中施用。联合疗法的预防剂或治疗剂可在同一药物组合物中施用给个体。备选地，联合疗法的预防药或治疗药可以在分立的药物组合物中同时施用至受试者。可通过相同或不同的施用途径对个体施用这些预防剂或治疗剂。已经充分描述了本申请，通过以下实施例和权利要求进一步说明本发明，所述实施例和权利要求是说明性的并且不意图是进一步限制性的。实施例实施例1.有效载荷化合物下表5列出了在产生如本申请实施例中所述的抗体药物缀合物中使用的各种有效载荷化合物的结构。化合物A-E和合成这些化合物的方法例如在PCT/US2014/024795中公开，并且化合物F例如在PCT/US2014/070800中公开，所述两份文献均通过引用方式完整并入本文。下文公开化合物G的合成方法。化合物G：合成过程合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(MC-MMAF，化合物G)MMAF-OMe(135mg，ConcortisBiosystems)溶解于CH3CN(10mL)中。向所产生的清亮溶液添加5mL水，随后添加0.375mL1N氢氧化钠水溶液(认证的，FisherScientific)。将反应混合物在21℃磁力搅拌18小时，此时LCMS分析显示完全反应。将反应混合物冷冻并冻干，产生MMAF钠盐。LCMS保留时间为0.911分钟。MS(ESI+)m/z732.5(M+1)。先前反应中如此获得的全部MMAF钠盐溶解于10mLDMSO中。在独立反应容器中，将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(95mg)用3.0mLDMSO中的HATU(165mg)和DIEA(0.126mL)在21℃处理25分钟。将活化酯的完整反应混合物添加至MMAF钠盐溶液并且将反应混合物在相同温度搅拌3小时。反应混合物在40mLEtOAc和20mL5％含水柠檬酸之间分配。将有机层分离并将水层用20mLEtOAc提取。将合并的有机层用10mLNaCl饱和溶液洗涤、经无水MgSO4干燥、过滤并在降低的压力下浓缩。在ISCOCombiFlash仪上使用ISCOC18gold15.5g柱纯化残余物。将所需的物质用H2O中的50％CH3CN洗脱。将含有所需产物的级分合并并冻干，产生作为白色固体的化合物。LCMS保留时间为1.392分钟。MS(ESI+)m/z925.6(M+1)。表5：测试的接头-有效载荷实施例2.曲妥珠单抗Cys突变抗体的制备将编码曲妥珠单抗(一种抗HER2抗体(术语“曲妥珠单抗”、“抗HER2抗体”和“TBS”在本文中可互换地使用))重链可变区和轻链可变区的DNA化学合成并克隆至含有人IgG1和人κ轻链的恒定区的两个哺乳动物表达载体pOG-HC和pOG-LC中，分别产生两个野生型构建体：pOG-曲妥珠单抗HC和pOG-曲妥珠单抗LC。在载体中，抗体重链和轻链构建体在哺乳动物细胞中的表达受CMV启动子驱动。载体在重链或轻链的N末端含有合成的24氨基酸信号序列：MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA(SEQIDNO:99)，以导引它们从哺乳动物细胞分泌。已经验证该信号序列有效指导数百种哺乳动物蛋白质在293FreestyleTM细胞中的蛋白质分泌。寡核苷酸定向诱变法用来制备曲妥珠单抗中的Cys突变构建体。化学合成用于每个Cys突变位点的成对突变引物(表6)。有义和反义的突变引物对在PCR扩增之前混合。以pOG-曲妥珠单抗HC和pOG-曲妥珠单抗LC作为模板，通过使用PfuUltraII融合HSDNA聚合酶(Stratagene)进行PCR反应。在PCR反应后，将PCR产物在琼脂糖凝胶上确认，并用DpnI处理，随后在DH10b细胞中转化(Klock等人,(2009)MethodsMolBiol.498:91-103)。表6.用来制备人IgG1的11个分别的Cys突变重链和轻链的突变引物的DNA序列。在一些情况下，在曲妥珠单抗的相同链中产生两个或更多个突变。使用与上文相同的方法，但是使用pOG-曲妥珠单抗Cys突变质粒作为系列轮次诱变的模板，将寡核苷酸定向诱变法用来制备多重Cys突变构建体。通过DNA测序证实全部Cys突变构建体的序列。表7和表8中分别显示HC和LCCys突变IgG1构建体的恒定区的编码的蛋白质序列。人IgG1重链和人κ轻链中的氨基酸残基依据EU编号体系(Edelman等人,(1969)ProcNatlAcadSciUSA,63:78-85)编号。表7.人IgG1重链中Cys突变构建体的恒定区的氨基酸序列。SEQIDNO:1是全长曲妥珠单抗的序列，其中恒定区加下划线。额外的序列是人IgG1重链中的Cys突变构建体，仅显示恒定区的序列。突变cys位置由加粗和加下划线的文本显示。表8.3个人κ轻链Cys突变构建体的恒定区的氨基酸序列。SEQIDNO:90是全长曲妥珠单抗的(人κ轻链)序列，其中恒定区加下划线。额外的序列是人κ轻链的恒定区中Cys突变构建体的序列ID编号。实施例3.转移曲妥珠单抗重链和轻链Cys突变至不同的抗体。对于曲妥珠单抗，用于接合药物有效载荷的全部Cys突变均选择位于其人IgG1重链和人κ轻链的恒定区中。因为抗体的恒定区在一级序列和结构方面高度保守，所以在曲妥珠单抗的背景下被确定为良好的有效载荷接合位点的Cys突变残基也将充当其他抗体中的优选接合残基。为了展示这些类属缀合位点向其他抗体的可转移性，我们克隆了一组Cys突变至抗cKIT抗体中。抗cKIT抗体是具有与cKIT蛋白结合的人IgG1重链和人κ轻链的抗体。将编码抗cKIT抗体可变区的DNA克隆至三个选择的pOG曲妥珠单抗-HCCys突变质粒构建体和两个选择的pOG曲妥珠单抗LCCys突变质粒构建体中(表9中列出的SEQIDNO)以替代质粒中曲妥珠单抗构建体的可变区，如实施例2中所述。作为结果，抗cKIT抗体和曲妥珠单抗的相应5个Cys构建体中的重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列是相同的。后续实施例显示，这些位点可以轻易地缀合。相反地，归因于不同的人IgG同种型的一级序列和三级结构的高程度相似性，曲妥珠单抗κ轻链上的Cys突变可以轻易地转移至含有不同的同种型重链的人抗体上的等同轻链。以相同方式，IgG1恒定区中确定的位点可以转移至IgG2、IgG3和IgG4。表9.用于克隆抗cKIT抗体可变区的曲妥珠单抗Cys构建体的序列ID编号。曲妥珠单抗Cys构建体的序列IDNO：SEQIDNO:48SEQIDNO:61SEQIDNO:77SEQIDNO:129SEQIDNO:131实施例4.293FreestyleTM细胞中Cys突变抗体的表达和纯化。通过缀合至赖氨酸残基或部分还原的天然二硫键所产生的抗体缀合物经常以药物对抗体比(DAR)在3和4之间为特征。Cys工程化抗体更一般以DAR是2为特征。对于某些适应症，可能想要产生DAR较高的ADC，这原则上可以通过在抗体中引入多个Cys突变实现。随着Cys突变数目增加，这类突变在ADC制备期间干扰需要的再氧化过程并且因此产生不均一产物的可能性也增加。在这项研究中，确定了具有良好再氧化行为的大量重链和轻链单位点Cys突变。为了显示可以组合几种缀合位点用于产生DAR大于2的ADC，在293FreestyleTM细胞中共表达曲妥珠单抗和抗cKIT抗体(表10)的轻链和重链的几个单位点Cys构建体。表10.产生DAR为4或6的ADC的Cys工程化抗体恒定区的序列ID通过使用如先前描述的瞬时转染方法(Meissner等人,BiotechnolBioeng.75:197-203(2001))共转染重链质粒和轻链质粒，在293FreestyleTM细胞中表达Cys突变抗体。使用Qiagen质粒制备试剂盒根据制造商的方案，制备共转染中使用的DNA质粒。将293FreestyleTM细胞在37℃在5％CO2下在FreestyleTM表达培养基(Invitrogen)中悬浮培养。在转染前三天，将细胞分成0.25x106个细胞/ml置于新鲜的培养基中。在转染当日，细胞密度一般达到1.5-2x106个细胞/ml。使用PEI方法，将细胞用比率1:1的重链质粒和轻链质粒混合物转染(Meissner等人,BiotechnolBioeng.75:197-203(2001))。进一步培养转染的细胞5天。通过将培养物以2000g离心20分钟并通过0.2微米滤器过滤，从培养物收获培养基。使用蛋白A-琼脂糖凝胶TM(GEHealthcareLifeSciences)，从过滤的培养基纯化表达的抗体。将抗体IgG通过洗脱缓冲液(pH3.0)从蛋白A-琼脂糖凝胶TM柱洗脱并立即用1MTris-HCl(pH8.0)中和，随后将缓冲液交换成PBS。瞬时转染的293FreestyleTM中曲妥珠单抗和抗cKITCys突变抗体的表达水平类似于野生型抗体，产率为12-25mg/L，表明选择的位点中单点突变至三点突变并未显著地改变细胞分泌装置对表达抗体的滞留。使用非还原性SDSPAGE分析纯化的Cys突变抗体表明Cys突变抗体未形成由工程化半胱氨酸通过二硫键连接的寡聚体。实施例5.Cys突变抗体的还原、再氧化和与各种有效载荷的缀合。因为抗体生物合成期间一般通过加合物(二硫化物)如谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰哺乳动物细胞中表达的抗体中的工程化Cys(Chen,2009)，初始表达的产物中的修饰Cys对巯基反应性试剂如如马来酰亚胺基或溴乙酰胺基或碘乙酰胺基无反应。为了在表达后缀合工程化的半胱氨酸，需要通过还原这些二硫化物移除谷胱甘肽或半胱氨酸加合物，这通常导致表达的蛋白质中的全部二硫键还原。这可以通过以下方式完成：首先使抗体暴露于还原剂如二硫苏糖醇(DTT)，随后进行允许抗体的全部天然二硫键再氧化以恢复和/或稳定功能抗体结构的操作。因此，为了还原全部天然二硫键和在工程化半胱氨酸残基的半胱氨酸或GSH加合物之间结合的二硫键，将新鲜制备的DTT添加至曲妥珠单抗和抗cKIT抗体的纯化Cys突变体至终浓度10或20mMDTT。抗体在37℃与DTT温育1小时后，将混合物对PBS透析3天，每天交换缓冲液以移除DTT并再氧化天然二硫键。通过能够使完整IgG与单个重链和轻链分子分离的反相HPLC，监测再氧化过程。在加热到80℃的PRLP-S4000A柱(50mmx2.1mm,Agilent)上缀合反应混合物进行分析，并且通过含有0.1％TFA的水中30-60％乙腈的线性梯度以流速1.5ml/分钟实施柱洗脱。在280nm监测从柱洗脱蛋白质的过程。允许透析继续直至再氧化完成。再氧化恢复了链内二硫键，而透析允许透析掉与新引入的半胱氨酸连接的半胱氨酸和谷胱甘肽。在再氧化后，抗体为缀合做好准备。一般按比率1.5:1、2:1或10:1添加含有马来酰亚胺的化合物至PBS缓冲液(pH7.2)中的再氧化抗体。实施温育1小时至24小时。通过大多数情况下能够使缀合的抗体与未缀合的抗体分离的反相HPLC监测缀合过程。在280nm、254nm和215nm波长依据UV吸光度监测从柱洗脱蛋白质的过程。通过反相HPLC分析缀合混合物时，许多Cys位点生成均一的缀合产物，如均一、单峰洗脱图所提示，而一些Cys位点生成不均一的缀合产物或仅显示匹配未缀合抗体的峰。上文描述的操作过程涉及天然二硫键的还原和再氧化以及还原在工程化半胱氨酸残基的半胱氨酸和GSH加合物之间的键。在再氧化过程期间，工程化的半胱氨酸残基可以通过二硫键改组过程干扰再形成正确的天然二硫键。这可能导致在工程化的半胱氨酸和天然半胱氨酸残基之间或在不正确匹配的天然二硫键之间形成错配的二硫键。这类错配的二硫键可能影响在反相HPLC柱上保留抗体。除了所需的工程化的半胱氨酸之外，错配过程还可以产生未配对的半胱氨酸残基。马来酰亚胺-化合物与抗体上的不同位置接合差异地影响保留时间(参见下文对均一缀合的ADC的讨论)。此外，除与工程化半胱氨酸残基的目的缀合之外，不完全的再氧化还将留下带天然半胱氨酸残基的抗体，其将与马来酰亚胺化合物反应。阻碍正确和完全形成天然二硫键的任何过程将导致与Cys反应性化合物缀合时复杂的HPLC特性。虽然选择位点是表面暴露的，但是如果在抗体的一些或全部构象中引入的游离半胱氨酸是马来酰亚胺-药物不可及的或否则不能有效地与马来酰亚胺-药物相互作用，则终产物中也可能存在不均一性。如果游离半胱氨酸是无反应性的，最终的DAR将会低并且产物可能是完全修饰、部分修饰和未修饰的Cys突变抗体的不均一混合物。在引入两个或更多个游离半胱氨酸的抗体情况下，如果药物在一个位点的接合干扰(即因空间位阻)第二药物在第二位点的结合作用，则能引入额外的复杂性。这种竞争将会导致较低的最终DAR和不均一产物。如果两个引入的半胱氨酸非常靠近并且恰当地取向，则随后它们还可以形成非天然的二硫键，而不是形成两个游离半胱氨酸。在这种情况下，抗体将对马来酰亚胺-药物化合物无反应性并且结果将是较低的最终DAR或甚至均匀的未缀合产物。如通过未纯化的反应混合物的RP-HPLC依据UV吸收所测量的均匀ADC产率取决于Cys突变以及所用的接头-有效载荷化合物而变动。使用上文描述的还原/再氧化方案和缀合程序，对于这类小型试验缀合，本文描述的45种多重Cys突变曲妥珠单抗或抗cKIT抗体中有26种产生最终DAR可接受的均一缀合产物(对于双重Cys突变，DAR为3.4-4.4；对于三重Cys突变，为5.1-6.0，表11)。当制备ADC时，这些Cys位点和药物组合是有利的。表11.从RP-HPLC分析计算的并通过LCMS验证的由上述方法与多种药物缀合的45种多重Cys突变抗体样品中完整、还原、去糖基化抗体链的DAR。在多种测定法中详细分析表11中45份ADC样品的子集：差异性扫描荧光测定(DSF)用来测量热稳定性。分析性大小排阻色谱(AnSEC)和多角度光散射(MALS)用来测量聚集。通过细胞生存力测定法测量体外抗原依赖性细胞杀伤效力并且在小鼠中测量药代动力学行为。通常，多重Cys突变ADC显示类似于单个Cys突变ADC的热稳定性。ADC优势地为单体，如通过分析性大小排阻色谱所测定。实施例6.与多种化合物缀合的抗cKIT和曲妥珠单抗Cys突变ADC的制备。使用如上文所述的几种有效载荷，制备曲妥珠单抗和抗cKITcys突变抗体HC-E152C-S375C和HC-K360C-LC-K107C的抗体药物缀合物。表12中显示这些ADC的一些特性。如实施例7中所述测试这些ADC的体外细胞杀伤效力并且在表13和表14中汇总结果。如实施例8中所述在未用过药的小鼠中对化合物进行进一步的药代动力学(PK)研究。表15和表16中汇总PK特性。表12.与多种化合物缀合的抗Her2Cys突变ADC的特性。a名称由突变抗体的描述和化学缀合步骤中所用化合物的名称组成。b根据反相HPLC的药物对抗体比率。c通过分析性大小排阻色谱测量的聚集；包括二聚体种类和低聚体种类。BLQ＝低于定量限。实施例7.测量Cys突变ADC的体外细胞杀伤效力的细胞增殖测定法天然表达靶抗原的细胞或经工程化以表达靶抗原的细胞系往往用来分析ADC的活性和效力。为了在体外评价曲妥珠单抗ADC的细胞杀伤效力，使用两种工程化的细胞系，即MDA-MB231克隆16和克隆40、及HCC1954细胞(GazdarA,RabinovskyR,YefenofE,GordonB,VitettaES.BreastCancerResTreat.(2000)61:217-228)。MDA-MB231克隆16细胞稳定表达高拷贝数(约5x105个拷贝/细胞)的重组人Her2，而克隆40表达低拷贝数(约5x103个拷贝/细胞)的人Her2。HCC1954细胞在表面中内源表达高水平(约5x105个拷贝/细胞)的人Her2。为了测定抗cKITADC的细胞杀伤效力，使用H526、KU812、CMK11-5和Jurkat细胞。虽然CMK11-5、H526和KU812细胞在细胞表面表达针对抗cKIT抗体的高水平抗原，但在Jurkat细胞中没有检测到抗原表达。抗原依赖性细胞毒效应应当仅杀伤在细胞表面表达足量抗原的细胞并且不杀伤缺少该抗原的细胞。在细胞与多种浓度的ADC温育5天后，用Cell-Titer-GloTM(Promega)实施细胞增殖测定法(Riss等人,(2004)AssayDrugDevTechnol.2:51-62)。在一些研究中，基于细胞的测定法是高通量的并且在自动化系统中实施(Melnick等人,(2006)ProcNatlAcadSciUSA.103:3153-3158)。曲妥珠单抗Cys突变ADC特异性杀伤表达Her2的MDA-MB231克隆16和HCC1954，但是不杀伤以很低水平表达Her2的MDA-MB231克隆40细胞(表13)。用化合物F制备的曲妥珠单抗ADC也杀伤JimT1细胞。曲妥珠单抗Cys突变ADC的IC50因细胞类型和取决于所用的化合物而变动(表13)。类似地，抗cKITCys突变ADC在细胞增殖测定法中显示抗原依赖性细胞杀伤。抗cKITCys-药物ADC杀伤表达抗原的NCI-H526、KU812和CMK115细胞，但是不杀伤抗原阴性的Jurkat细胞。抗cKITADC的IC50随所用的细胞类型和化合物变动(表14)。表13.与多种化合物缀合的抗Her2ADC的体外细胞杀伤效力。a名称由突变抗体的描述和化学缀合步骤中所用化合物的名称组成。b测定法中使用的最高浓度是6.7E-02μM。因此IC50值6.7E-02μM指ADC在测定法中无活性。表14.与多种化合物缀合的抗cKITADC的体外细胞杀伤活性。a名称由突变抗体的描述和化学缀合步骤中所用化合物的名称组成。b测定法中使用的最高浓度是6.7E-02μM。因此IC50值6.7E-02μM指ADC在测定法中无活性。实施例8.Cys突变ADC的药代动力学研究已经证实，长血清半寿期对ADC的体内高效力至关重要(Hamblett等人,“Effectsofdrugloadingontheantitumoractivityofamonoclonalantibodydrugconjugate,”ClinCancerRes.,10:7063-7070(2004)；Alley等人,BioconjugChem.19:759-765(2008))。通常疏水性药物有效载荷与抗体的接合可以显著地影响抗体的特性，并且这可以导致ADC在体内快速清除(Hamblett等人，2004)和体内效力低劣。为了评价不同缀合位点在体内对清除多重Cys-药物ADC的影响，在非携瘤小鼠中实施药代动力学研究。为了检测鼠血浆中含有药物的ADC，生成抗MMAF抗体。使用抗人IgG(抗hIgG)捕获来自血浆的人IgG分子及使用抗人IgG(抗hIgG)抗体和抗MMAF抗体在两个独立测定法中生成信号，在GyrosTM平台上开发了检测ADC的ELISA测定法。两种ELISA测定法分别测量抗体的和“完整”ADC的血清浓度，如下文更详细地讨论。对每组三只小鼠按1mg/kg施用单次剂量的CysADC。在3周期间采集8份血浆样品并且通过如上文所述的ELISA测定。使用与注入小鼠相同的材料，分别生成每种ADC的标准曲线。如通过抗hIgGELISA所测量，Cys突变ADC(表15和表16)显示与未缀合的野生型抗体相似的药代动力学曲线，这表明突变和与这些位点缀合的有效载荷未显著地影响抗体的清除。为了确定小鼠中循环期间各个Cys位点处马来酰亚胺有效载荷和抗体之间的键的化学稳定性，对于用化合物F制备的ADC，将通过抗MMAFELISA测定法所测量的和通过抗hIgGELISA测定法所测量的ADC浓度彼此比较，其轻易地用抗MMAFELISA检测到(表15和表16)。对于这些ADC，从抗MMAF(AUC-MMAF)和抗hIgGELISA(AUC-IgG)的量值计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)值。相似分析的先前结果提示不确定性>25％。由于如果不出现药物损耗，则比率应当保持接近1，比率>0.7表示在测量的准确度范围内，对采用化合物F制备的曲妥珠单抗ADC和抗cKITADC在小鼠中施用后几乎观察不到药物损耗(表15和表16)。为了进一步理解ADC药物有效载荷的停留，尤其通过抗MMAFELISA不可检出的有效载荷(如化合物A-E)，通过免疫沉淀质谱法(IP-MS)分析样品。特别地，从通过末梢采血采集的小鼠血清亲和纯化ADC并且通过MS分析法分析与ADC接合的药物有效载荷。在常见过程中，将200μl血浆用等量含有10mMEDTA的PBS稀释。向稀释物添加10μl亲和树脂(IgG选择琼脂糖凝胶6Fastflow；GEHealthcare17-0969-01；50％浆液)。通过施加轻微搅拌以避免树脂沉降，树脂与稀释的血浆样品在室温温育1小时。随后将树脂滤除并用200μlPBS洗涤2次。为了使抗体去糖基化，将10μlPBS稀释的10μlPNGaseF(1mg/mL，1/2xTBSpH7.4，2.5mMEDTA，50％甘油)添加至树脂并将混合物在37℃温育2-3小时。通过用200μlPBS洗涤亲和树脂2次移除PNGaseF后，通过添加20μl1％甲酸并滤除树脂从亲和树脂洗脱样品2次。合并的洗脱物用20μl6M盐酸胍和5μl还原缓冲液(0.66MTCEP，3.3M乙酸铵，pH5)稀释。为了有效还原抗体，将样品在分析前在室温温育至少30分钟。用AgilentTechnologies6550-iFunnelQTOFMS/Agilent1260HPLC系统进行LCMS。用PLRS柱(8μm，2.1x50mm，Agilent)以流速0.5ml/分钟在80℃，将标准反相色谱用于样品脱盐。使用含有20％乙腈至含有60％乙腈的0.1％甲酸的线性梯度，实施洗脱6分钟。Agilent定性分析法用于处理图谱记录结果和图谱反卷积。为了分析，将图谱记录结果在涵盖洗脱全部相关种类的时间区间范围内加总。加总的图谱按电荷状态解卷积并且记录解卷积的图谱的图像。提取峰的强度值用于可归属种类。基于从所分析抗体序列计算的质量值和含药物分子的缀合物的预期质量位移，进行DAR状态和片段种类的归属。使用全部DAR状态跨某分布的相对峰高度计算平均DAR。平均抗体DAR计算为来自平均2条轻链和平均2条重链的DAR的总和。从小鼠循环三周后的血浆纯化的ADC的平均DAR(如通过MS所测量)与原始ADC制备物中的DAR比较。从两种DAR的比率(从小鼠血浆分离的ADC的DAR除以原始ADC制备物的DAR)算出“有效载荷保留”(表15和表16)，并且代表在三周后小鼠循环中的ADC上留下的有效载荷的百分数。如通过MS所测量的ADC的有效载荷保留大体上与通过前述ELISA测定法对采用化合物F制备的ADC获得的结果一致(表15和表16)。数据显示在3周时间范围内在小鼠中循环期间本文所述的CysADC的药物-抗体连接的高度稳定性。表15.与多种化合物缀合的抗cKITCys突变ADC的药代动力学特性。a名称由突变抗体的描述和化学缀合步骤中所用化合物的名称组成。b由抗MMAFELISA读出的AUC。c由抗IgGELISA读出的AUC。d在小鼠中3周循环后如通过IP-MS所测量的有效载荷保留。n.a：不适用。抗MMAFELISA未检出有效载荷。表16.与多种化合物缀合的抗Her2Cys突变ADC的药代动力学特性。a名称由突变抗体的描述和化学缀合步骤中所用化合物的名称组成。b由抗MMAFELISA读出的AUC。c由抗IgGELISA读出的AUC。d在小鼠中3周循环后如通过IP-MS所测量的有效载荷保留。n.a：不适用。抗MMAFELISA未检出有效载荷。实施例9.制备与Eg5抑制剂缀合的曲妥珠单抗和抗cKITADC。已经报道工程化的CysADC在小鼠和大鼠动物模型中比通过缀合至部分还原的天然二硫键或通过天然赖氨酸残基产生的ADC耐受更好(Junutula等人,(2008)NatBiotechnol.26(8):925-932)。为了评价通过工程化Cys抗体缀合的ADC和与部分还原的天然二硫键缀合的ADC之间的体内效力差异(Doronina等人,(2003)Nat.Biotechnol.21,778-784)，如实施例4中所述，在293FreestyleTM细胞中表达并且纯化曲妥珠单抗和抗cKIT抗体的Cys突变体并且如实施例5中所述制备ADC。将表5中的Eg5接头-有效载荷化合物A缀合至抗体抗cKIT-HC-E152C-S375C双突变体(也称作cKitB，免疫缀合物称作cKitB-CmpdA或cKitB-5B)和抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C双突变体(也称作cKitC，免疫缀合物称作cKitC-CmpdA或cKitC-5B)以及野生型抗cKIT抗体(免疫缀合物也称作cKitA-CmpdA或cKitA-5B)。(残基编号是EU编号)。表17中阐述抗体恒定区的序列。表17：抗体的野生型恒定区和cys置换型恒定区的序列信息。具体而言，通过将5mg/ml抗体与0.35mM化合物A在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中温育1小时，使再氧化的抗体与化合物A缀合。通过RP-HPLC监测反应的完成度并且对于cKitB缀合物和cKitC缀合物，分别获得3.9和4.0的DAR。通过MS进一步验证DAR量值。显示ADC在体外细胞杀伤测定法中强效并且在非携瘤小鼠中具有与未缀合的抗体相似的药代动力学特性。在2步骤方法中如下制备化合物A与cKitA的天然二硫键缀合的ADC。将含有2mMEDTA的PBS中浓度为5-10mg/ml的抗体首先在37℃用50mM巯基乙胺(作为固体添加)部分还原1小时。在脱盐并添加1％w/vPS-20去垢剂后，部分还原的抗体(1-2mg/ml)在4℃与按每10mg抗体为0.5-1mg化合物A的量反应过夜，其中所述的化合物A以10mg/ml溶解于DMSO中。通过蛋白A色谱纯化ADC。用PBS基线洗涤后，将缀合物用50mM柠檬酸盐，pH2.7，140mMNaCl洗脱，中和并无菌过滤。平均DAR是3.2。表18：与化合物A缀合的三种抗cKITADC的特性ADC名称aDARb聚集c抗cKIT-化合物A(cKitA-5B)3.20.8％抗cKIT-HC-E152C-S375C–化合物A(cKitB-5B)3.91.5％抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C-化合物A(cKitC-5B)4.03.2％a名称由突变抗体的描述和化学缀合步骤中所用化合物的名称组成。b根据反相HPLC或HIC的药物对抗体比率。c通过分析性大小排阻色谱测量的聚集；包括二聚体种类和低聚体种类。类似地，制备具有有效载荷与具有半胱氨酸置换的抗cKIT和曲妥珠单抗突变型抗体的以下组合的免疫缀合物并且依据相同方法表征。注意，如果对每个抗体复合物而言4个添加的半胱氨酸残基均与有效载荷缀合，则工程化抗体一致地提供接近预期载量4的DAR(表18和表19)：表19.具有Eg5抑制剂有效载荷的抗cKIT和曲妥珠单抗Cys突变ADC的总结。a名称由突变抗体的描述和化学缀合步骤中所用化合物的名称组成。b根据反相HPLC的药物对抗体比率。c通过分析性大小排阻色谱测量聚集；包括二聚体种类和低聚体种类。实施例10.用Eg5抑制性有效载荷制备的ADC的体外效力和体内效力。从表5中显示的每种Eg5抑制性接头-有效载荷化合物与抗cKIT抗体(也称作cKitA)和HC-E152C-S375CCys-突变形式的抗cKIT抗体(cKitB)缀合来制备免疫缀合物。上表17中显示抗cKIT(cKitA)野生型和Cys置换型突变体的恒定区。通过上文描述的方法对每种有效载荷制备了药物对抗体比率(DAR)在3.5和4.0之间的缀合物。在预计被针对cKit的抗体识别的细胞系中测试免疫缀合物的活性。图2显示包含化合物A、B和C的、与HC-E152C-S375CCys置换型cKIT免疫缀合的免疫缀合物抑制细胞生长。Jurkat细胞是cKIT阴性细胞系，并且对三种抗cKIT(cKitA)免疫缀合物不敏感。然而，cKIT阳性细胞系H526细胞的增殖受全部三种抗cKIT(cKitA)缀合物抑制，IC50范围从100pM至500pM。选择H526细胞系作为体内效力研究的异种移植模型。体内异体移植肿瘤模型模拟在人类中观察到的生物学活性并且由移植相关和充分表征的人原发肿瘤或肿瘤细胞系入免疫缺陷性裸鼠组成。用抗癌症试剂治疗肿瘤异种移植小鼠的研究已经提供了关于所测试试剂的体内效力的宝贵信息(Sausville和Burger,(2006)CancerRes.66:3351-3354)。全部动物研究均根据实验动物护理与使用指南实施(NIH出版；NationalAcademyPress，第8版，2001)。将H526细胞在nu/nu小鼠中皮下植入(Morton和Houghton,NatProtoc.2007；2:247-250)。在肿瘤尺寸达到约200mm3后，将ADC在单次给药中通过静脉内注射施用至小鼠中。在注射ADC后定期测量肿瘤生长。图3中显示这种体内效力研究的实施例。图3总结了用半胱氨酸工程化的抗cKIT抗体制备的两种ADC即抗cKIT-HC-E152C-S375C–化合物A(cKitB-5B)和抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C-化合物A(cKitC-5B)的活性，所述ADC在剂量5mg/kg(图3A)和10mg/kg(图3B)抑制小鼠中H526肿瘤异种移植物生长。因为DAR较低，用野生型抗体通过部分还原制备的抗cKIT-化合物A(cKitA-5B)以较高剂量施用以匹配摩尔有效载荷剂量。每个组就测试的每种ADC而言注射6只小鼠。在任何组中未观察到与ADC治疗相关的明显体重减轻，提示全身毒性低。化合物A的半胱氨酸工程化抗cKITADC比通过部分还原野生型抗cKIT抗体-化合物A制备的ADC(cKitA-5B)更有活性。因此，尽管Eg5抑制剂与多种cKIT抗体(包括未修饰的一种cKit抗体)的免疫缀合物均有活性，这表明了工程化引入新半胱氨酸残基至恒定区中并且使用新半胱氨酸残基作为有效载荷/接头基团接合点的蛋白质能够提供改善的免疫缀合物。在鼠异种移植模型中也测试了Cys置换型cKitA免疫缀合物。两种Cys置换型免疫缀合物均显示比非置换型免疫缀合物更大的活性，如通过植入后肿瘤体积所测量的那样。实施例11:与Eg5抑制剂缀合的抗Her2ADC在小鼠Her2阳性MDA-MB-231克隆16乳腺癌模型中的剂量依赖性体内效力在Her2阳性MDA-MB-231HER2克隆16乳腺癌异种移植模型中评价通过曲妥珠单抗-HC-E152C-S375CCys突变抗体与Eg5抑制剂化合物A缀合所制备的抗Her2ADC曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A的抗肿瘤效力。对雌性无胸腺Foxn1裸小鼠皮下植入磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中含有5x106个细胞的50％MatrigelTM(BDBiosciences)。含有细胞的悬液的总注射体积是200μl。植入肿瘤细胞后13天肿瘤平均体积约220mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到8个组之一(n＝5只/组)后，对小鼠施用PBS、非特异性同种型对照-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)或曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A(2.5、5或10mg/kg)的单次静脉内剂量。每周至少二次测量肿瘤体积(图4)和体重。在肿瘤细胞植入后第40日，用单次施用2.5mg/kg曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A处理的小鼠出现了与运载体对照相比(T/C)显示肿瘤体积平均变化百分数8.22％的肿瘤。用单次施用5mg/kg和10mg/kg曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A处理的小鼠具有分别显示体积消退74.14％和76.35％的肿瘤，二者均与仅运载体和非特异性同种型ADC对照有统计差异(p<0.05，ANOVA，Tukey事后检验)。各处理在全部剂量水平均耐受良好。表20：在第40日小鼠的Her2阳性MDA-MB-231克隆16乳腺癌模型中TBS-HC-E152C-S375C-化合物A的剂量反应。实施例12：与Eg5抑制剂缀合的抗Her2ADC在Her2阳性MDA-MB-453人乳腺癌异种移植小鼠模型中的体内效力也在Her2阳性MDA-MB-453人乳腺癌异种移植模型中评价抗Her2曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物AADC的抗肿瘤效力。对雌性SCID棕灰色小鼠皮下植入磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中含有5x106个细胞的50％MatrigelTM(BDBiosciences)。含有细胞的悬液的总注射体积是200μl。植入肿瘤细胞后7天肿瘤体积为大约168mm3–216mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到4个组之一(n＝6只/组)后，对小鼠施用PBS、非特异性同种型对照-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)或曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)的单次静脉内剂量。每周至少二次测量肿瘤体积(图5)和体重。在植入后第45日，用曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)处理的小鼠具有分别显示体积消退71.2％的肿瘤，这与仅运载体和非特异性同种型ADC对照有统计差异(p<0.05，ANOVA，Tukey事后检验)。各处理在全部剂量水平均耐受良好。表21：曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A在10mg/kg时在第45日Her2阳性MDA-MB-453人乳腺癌异种移植小鼠模型中的ADC效力。实施例13：与Eg5抑制剂缀合的抗Her2ADC在Her2阳性HCC1954人乳腺癌异种移植小鼠模型中的体内效力进一步在Her2阳性HCC1954乳腺癌异种移植模型中评价了抗Her2曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物AADC的抗肿瘤效力。对雌性无胸腺Foxn1裸小鼠皮下植入磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中含有5x106个细胞的50％MatrigelTM(BDBiosciences)。含有细胞的悬液的总注射体积是200μl。植入后11天在肿瘤体积为大约148mm3–216mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到4个组之一(n＝6只/组)后，对小鼠施用PBS、非特异性同种型对照-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)或曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A(10mg/kg)的单次静脉内剂量。每周至少二次测量肿瘤体积(图6)和体重。在植入后第45日，用曲妥珠单抗-HC-E152C-S372C-化合物A(10mg/kg)处理的小鼠具有分别显示体积消退63.0％的肿瘤，这与仅运载体和非特异性同种型ADC对照有统计差异(p<0.05，ANOVA，Tukey事后检验)。各处理在全部剂量水平均耐受良好。表22：曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A在10mg/kg时在第45日Her2阳性HCC1954人乳腺癌异种移植小鼠模型中的ADC效力。实施例14：比较抗cKITCys突变ADC与通过部分还原非工程化抗体制备的ADC的体内效力研究。在H526异种移植小鼠模型中比较两种抗cKITADC：抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F和抗cKIT-化合物F的体内效力(图7)。两种ADC用相同有效载荷即化合物F(表5)制备，使用两个不同方法与不同Cys位点缀合。如实施例5中所述，用Cys突变抗体制备缀合物抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F，其中化合物F与工程化的Cys残基(HC-E152C和HC-S375C)缀合。通过应用实施例9中描述的部分还原方法对野生型抗cKIT抗体制备缀合物抗cKIT-化合物F，其中化合物F与天然Cys残基缀合。抗cKIT-化合物F具有比抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F(DAR3.9，0.6％聚集)略高的DAR(DAR4.6)和聚集(2.9％)。非携瘤小鼠中的药代动力学研究显示，在小鼠中三周循环期间两种ADC以非常不同的程度保留相同的有效载荷：如通过ELISA(图8A，图8B)所示和如通过IP-MS所测定(参见实施例8)，抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F显示比抗cKIT-化合物F(20％)好得多的有效载荷保留(56％)。在H526异种移植模型中，相同剂量的抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F比抗cKIT-化合物F更有效地抑制肿瘤(图7)。在H526细胞中不表达其抗原的抗Her2-HC-E152C-S375C-化合物F(特性参见表12)作为对照纳入并且不显示任何肿瘤抑制活性。实施例15比较在不同位点处与化合物F和化合物A缀合的抗cKITCys突变ADC的体内效力研究在另一个实施例中，在H526异种移植模型中比较抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物F、抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C-化合物F、抗cKIT-HC-E152C-S375C-化合物A、和抗cKIT-HC-K360C-LC-K107C-化合物AADC的体内效力(图9)。使用如实施例7中所述的两种不同抗体，使两种有效载荷-化合物F和化合物A与不同Cys位点缀合。表12中总结了ADC的特性。对于全部四种缀合物，测量的DAR接近于理论DAR4，并且对所得的ADC几乎观察不到聚集(表12)。将单次剂量3.5mg/kg的ADC静脉内注射至携带H526肿瘤的动物中。图9中显示H526异种移植模型中肿瘤体积测量的结果。在这个模型中，相同剂量的抗cKIT-化合物FADC比采用化合物A制备的ADC更有效地抑制肿瘤。与不同的两组Cys突变体缀合的ADC之间不存在肿瘤抑制活性的统计显著差异。实施例16与化合物G缀合的曲妥珠单抗ADC的疏水性为了进一步优化Cys突变体和突变体组合的选择以制备DAR为2、4、6和更高的ADC，就疏水性方面分析曲妥珠单抗Cys突变ADC的特性。如上文所述制备与化合物G(MC-MMAF)缀合的Cys突变ADC。如所述那样实验测定的最终DAR通常接近于目标并且在下表23中列出。通过疏水相互作用色谱如下测量这些ADC的疏水性。使用安装在Agilent1260LC系统(SantaClara，CA，美国)上的TosohBioscience(KingofPrussia,PA,USA)TSK凝胶丁基-NPR柱(100mm×4.6mm，2.5μm)，采集曲妥珠单抗Cys-MMAFADC的分析性HIC数据。该方法由缓冲液A(20mMHis-HCl，1.5M硫酸铵，pH6.0)和缓冲剂B(20mMHis-HCl，15％异丙醇，pH6.0)的双元梯度组成。通过用0.5体积的3M硫酸铵稀释大约20μg抗体(PBS)制备样品。该梯度由如下组成：在100％A维持5分钟，随后是经30分钟的0至100％B线性梯度，经5分钟返回至100％A，并在初始条件最终再平衡10分钟，之后下一次进样。通过在280nm的UV吸收监测分离过程并使用Chromelion软件(Dionex)分析。出人意料地，观察到DAR4ADC的保留时间大幅度变动，尽管唯一差异是化合物G的接合位点。此外，保留时间的范围基本上与对纳入用于比较的DAR2ADC所观察到的范围重叠(表23)。HIC基于疏水性分离分子。全部DAR2ADC均具有大于未缀合抗体(保留时间＝45分钟)的HIC保留时间，其中疏水性药物分子如化合物G与抗体接合时，预计出现前述情况。但是，在不同位点接合有效载荷会在不同程度上增加ADC的疏水性。表23.DAR和DAR＝2、4或6的曲妥珠单抗Cys-化合物GADC的分析性HIC保留时间。出乎意料大的保留时间差异可以从观察抗体结构上接合位点的位置理性得到合理说明：如果药物有效载荷在抗体外部暴露的位点处(例如在测量到几乎19分钟保留时间的HC-P247C处)接合，则保留时间较高。相反，如果有效载荷在内部位点(如可变结构域和CH1结构域之间形成的空穴(例如，HC-E152C)或抗体CH2结构域和CH3结构域之间的大开口(例如，HC-P396C))处接合，则HIC保留时间低于16分钟，因为部分地隔绝了有效载荷与溶剂和HIC柱相互作用。同样，对于包括两个相对内部的位点(例如HC-E152C-P396C和HC-E152C-S375C)的DAR4ADC，保留时间仍然短，在15.5-16.5分钟级别，而包括非常暴露的位点(例如，LC-K107C-HC-K360C)的DAR4ADC能显示大于21分钟的保留时间。通常认为降低蛋白质药物(包括ADC)的疏水性有益，因为这可以减少聚集及从循环中清除。在使它们与溶剂相互作用隔绝并且当药物接合时接合过程最小程度地增加抗体疏水性的位点处缀合药物有效载荷应当是有益的，与缀合化学和有效载荷类别无关。当每个抗体接合4、6或更多药物时或当特别地使用疏水性有效载荷时，仔细选择导致疏水性变化最少的接合位点可能是特别有益的。实施例17.与多种化合物缀合的抗Her2Cys突变ADC的疏水性实施例7中制备的曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C和曲妥珠单抗-HC-K360C-LC-K107CADC的子集(特性参见表12)还通过如下文详述的疏水相互作用色谱表征(表24)。与暴露的Cys残基组合(位置HC-K360C-LC-K107C)缀合的ADC比药物与HC-E152C-S375C抗体接合的ADC更疏水。与细胞毒性肽化合物F相比，对Eg5抑制剂有效载荷化合物A和化合物C的影响更明显。如实施例16中讨论，在使药物与溶剂相互作用隔绝的位点如HC-E152C-S375C处接合药物似乎增加抗体疏水性的程度比在更暴露于溶剂的位置如HC-K360C和LC-K107C处接合时低。尽管有益于许多应用，特别有益于接合疏水性有效载荷，在更暴露于溶剂的位置处缀合有效载荷将在其他应用中具有有益的实用性。表24：与不同有效载荷缀合的各种Cys突变抗Her2-ADC的疏水性评分ADC名称a疏水性评分b曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物F0.91曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物A0.90曲妥珠单抗-HC-E152C-S375C-化合物C0.87曲妥珠单抗-HC-K360C-LC-K107C-化合物F0.51曲妥珠单抗-HC-K360C-LC-K107C-化合物A0.33曲妥珠单抗-HC-K360C-LC-K107C-化合物C0.31a名称由突变抗体的描述和化学缀合步骤中所用化合物的描述组成。b疏水相互作用色谱(HIC)测量：在连接至Agilent1260InfinityLC系统(AgilentTechnologies)的TSK凝胶丁基-NPR柱(4.6mmIDx35mmL，TosohBioscience)上实施不同种类的分离。该系统首先用流动相B(17mMHis/HCl，pH6.0，含有15％异丙醇)平衡和随后用流动相A(20mMHis/HClpH6.0，含有1.5M(NH4)2SO4)平衡直至达到稳定基线。将在4℃贮存于自动进样器中的10μg至50μg样品进样并且以流速1.0mL/分钟在恒定温度25℃分离。在30个柱体积内使用从100％流动相A至100％流动相B的梯度实现不同疏水性的各种类的洗脱。在280nm处检测洗脱种类并且最大峰的保留时间用来计算疏水性指数。相对于疏水性确定的三种参考分子的线性回归，测定这种指数(保留时间对疏水性指数作图)。这种程序允许补偿试验间潜在变异性和因柱批次之间差异所致的变异并且与精确的绝对硫酸铵浓度无关。疏水性指数越低(＝从HIC洗脱晚)，分子的疏水性越高并且在生产或储存原料药和药品期间不利行为的风险越高。可以理解本文所述的实施例和实施方案的目的仅在于说明，并且在其影响下的多种修改或改变将会启发本领域技术人员并且将纳入本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。当前第1页1 2 3