专利名称：菊花总黄酮树脂纯化方法
技术领域：
本发明属中药成分纯化方法，主要涉及中药提取物的纯化方法，尤其涉及菊花总黄酮的纯化方法。
中药黄酮类化合物的纯化，传统采用溶剂萃取法和聚酰胺柱层析法，但是溶剂萃取法操作麻烦，萃取过程又易乳化，所用有机溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇有不同程度的毒性，而且菊花总黄酮如用氯仿萃取，只能得到黄酮总量的4％；用乙酸乙酯萃取，也只能得到总量的50％；用正丁醇萃取也仅得到总量的40％左右，因此需用上述几种溶剂依次萃取才可能使总黄酮基本萃取完全。聚酰胺纯化法对菊花总黄酮的不可逆吸附达40％，因此其得率低，且洗脱麻烦。因此上述两种方法在菊花总黄酮纯化中，均不理想。基于大孔树脂在中药纯化中的应用日渐广泛，已用于纯化黄酮(如银杏叶总黄酮[1，2]、葛根总黄酮[3])、皂苷(如甘草皂苷[4]])、生物碱(如苦豆子生物碱)[5]]等中药成分，大孔树脂种类日益增多，在传统D101、D201树脂的基础上，已开发了各种不同性能的大孔树脂，如，天津农药股份公司树脂分公司生产的D-101、DA201、DM301，河北沧州宝恩化工有限公司的HPD系列，以及南开大学化工厂生产的AB-8、D3520等。
本发明提供的菊花总黄酮树脂纯化方法，大孔树脂选用HPD-100、HPD-400、HPD600、HPD-700、D-101、AB-8，优选HPD-100、HPD-400，最优选HPD-100。
本发明提供的菊花总黄酮树脂纯化方法中菊花提取液的上样量，即菊花∶树脂为1∶3～1∶6，优选1∶4～1∶5，最优选1∶5。
本发明提供的菊花总黄酮树脂纯化方法中，所用的洗脱流速为1BV/h～4BV/h，优选1BV～3BV/h，最优选2BV/h。
本发明提供的菊花总黄酮树脂纯化方法中洗脱剂为有机醇，优选乙醇。
本发明提供的菊花总黄酮树脂纯化方法，洗脱剂的洗脱浓度为50％～90％，优选70％～80％。洗脱剂体积为1.5BV～2.5BV，优选2.0BV～2.5BV，最优选2BV。
本发明提供的菊花总黄酮树脂纯化方法，获得纯化的菊花总黄酮含量＞65％，总黄酮转移率＞95％。
本发明具有以下优点1.本发明提供的菊花总黄酮树脂纯化方法操作简便、快捷；2.所选的大孔树脂具有吸附量大、解吸率大；3.以乙醇为溶剂，价廉、无毒；4.用本发明方法纯化菊花，其总黄酮转移率可达95％以上，纯化物总黄酮含量可达65％以上，且重现性好，树脂可重复使用。
图2为70％乙醇对六种树脂吸附菊花总黄酮后的静态解吸图。
图3为70％乙醇对菊花总黄酮的洗脱曲线图。
实施例1 本发明的一种纯化方法(1)菊花提取菊花经70％乙醇回流提取三次，合并三次滤液，减压浓缩至一定体积，过滤，备用。
(2)树脂预处理大孔树脂以95％乙醇浸泡24小时，装柱，以95％乙醇冲洗柱子，至流出液以水稀释5倍未混浊，以去离子水冲洗层析柱至流出液无乙醇味。
(3)上柱将菊花提取液上柱，控制流出液流速为1BV/h，至提取液全部进入树脂床，静止0.5～1小时，让其充分吸附。
(4)洗脱以2BV体积的去离子水冲洗树脂床，控制流出液流速为1BV/h，以除去未被树脂吸附部分，然后以一定体积，一定浓度的乙醇为洗脱剂，控制一定流速，收集洗脱液，减压浓缩至干后粉碎或浓缩至一定体积(以10％固形物为佳)进行喷雾干燥，即得纯化产物。
实施例2 选用不同条件进行纯化采用本发明提供的方法，选用不同条件进行菊花总黄酮纯化实验，结果见表1表1不同条件下的实验结果实验总黄酮转移率总黄酮含量洗脱流速 上样比例 乙醇浓度 洗脱体积编号 (％) (％)1 2Bv/h 1∶2 50％ 2Bv 77.7 70.62 2Bv/h 1∶3 70％ 2.5Bv 98.9 68.03 2Bv/h 1∶5 90％ 3Bv 100.0 70.04 3Bv/h 1∶2 70％ 3Bv 93.8 61.55 3Bv/h 1∶3 90％ 2Bv 97.3 65.06 3Bv/h 1∶5 50％ 2.5Bv 100.6 72.47 4Bv/h 1∶2 90％ 2.5Bv 92.2 63.78 4Bv/h 1∶3 50％ 3Bv 91.3 71.89 4Bv/h 1∶5 70％ 2Bv 100.9 68.0102Bv/h 1∶4 70％ 2Bv 96.5 67.6112Bv/h 1∶5 70％ 2Bv 95.7 68.8表中实验1～9为正交实验结果，综合考察总黄酮的转移率及产品总黄酮含量两方面因素，最佳条件为洗脱流速2Bv/h，上样量1∶5，溶剂浓度70％～90％，洗脱溶剂体积2.5～3BV。但是上样量1∶5实验效率太低，洗脱体积大回收溶剂麻烦，并会增加产品成本，而且2BV洗脱时总黄酮回收率已非常高，因此选用洗脱剂体积2BV。在洗脱流速2BV/h，乙醇浓度70％，洗脱剂体积2BV条件下对上样量1∶4及1∶5进行比较(见表1实验10，11)，结果表明，1∶5，1∶4上样，对总黄酮转移率及产品总黄酮含量差别不大，因此优选1∶4。考虑到实际生产中由于树脂床体积很大，洗脱流速1BV/h已相当大，且从正交实验可以看出流速低有利于提高总黄酮含量及总黄酮转移率，因此洗脱流速优选1BV/h。洗脱剂乙醇浓度70％～80％有利于回收溶剂的再利用，因此乙醇浓度优选70％～80％。所以优选纯化条件为洗脱流速1Bv/h，上样量1∶4，溶剂(乙醇)浓度70％～80％，洗脱溶剂体积2BV。
实施例3 优化条件下，在四种不同规格的层析柱上进行了试验，结果见表2表2大孔树脂在不同规格的层析柱上纯化菊花总黄酮的结果比较柱子规格 上样量(g)黄酮转移率(％) 纯化物总黄酮含量(％)2.5cm×30cm 13 99.3±3.6 65.6±0.43.5cm×60cm 130 100.2±2.2 66.9±1.710cm×100cm 2000 99.7±3.8 67.5±2.920cm×160cm 1500095.6±4.2 67.3±2.5n＝3表2可知，用大孔树脂纯化菊花总黄酮，总黄酮转移率高，纯化物总黄酮含量均达到65％以上。且在不同规格的层析柱或相同规格的层析柱上，大孔树脂纯化法的重现性良好。
实施例 4六种树脂对菊花黄酮的静态吸附实验参见
图1，通过比较6种大孔树脂对菊花总黄酮的吸附量及解吸附率可知，HPD400的吸附量最大，其次为HPD100，而一般认为对黄酮类化合物有较好吸附的D101树脂的吸附量最小，由于HPD100与HPD400树脂的吸附量差别不大，考虑到HPD100药用级树脂已有动物急性及长期毒性实验数据，故而选择HPD100树脂进行菊花总黄酮的纯化，可达到吸附量大、解吸率大的目的。
实施例5 乙醇对六种树脂吸附菊花总黄酮后的静态解吸参见图2，通过用70％乙醇对六种树脂吸附菊花总黄酮后的静态解吸观察，可知，所选的六种树脂对菊花总黄酮的解吸速率均很快，解吸率近乎100％，且解吸后数小时内在溶液中浓度恒定，因此选用何种树脂主要由吸附量决定。
实施例6 乙醇对菊花总黄酮的洗脱实验参见图3，以70％乙醇洗脱菊花总黄酮，以1.5倍树脂床体积的乙醇即可基本将菊花总黄酮洗脱下来。若以2BV洗脱剂洗脱总黄酮洗脱率达95％以上。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献1.何奇，及元乔，丁立生等。D140大孔吸附树脂银杏黄酮提取纯化工艺研究，天然产物开发与研究，2001，13(1)56～592.麻秀萍、蒋朝晖、杨玉琴，等。大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附研究。中国中药杂志，1997，22(9)539～5413.潘见，陈强，谢慧明，等。大孔树脂对葛根黄酮的吸附分离特性研究，农业工程学报，1999，15(1)236～2404.冯福盛，宣春生，陈树伟，等。吸附树脂AB-8对甘草酸的吸附性能及其在提取纯化中的应用，天然产物开发与研究，1998，10(1)60～645.秦学功，元英进。用大孔树脂吸附分离苦豆子生物碱，中国中药杂志，2002，27(6)428～430
权利要求
1.菊花总黄酮树脂纯化方法，其特征是将菊花提取液经树脂上柱、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的菊花总黄酮。
2.如权利要求1所述的菊花总黄酮树脂纯化方法，其特征是树脂选用HPD-100、HPD-400、HPD600、HPD-700、D-101、AB-8，优选大孔树脂HPD-100、HPD-400，最优选HPD-100。
3.如权利要求1所述的菊花总黄酮树脂纯化方法，其特征是菊花提取液的上样量(菊花∶树脂)为1∶3～1∶6，优选1∶4～1∶5，最优选1∶5。
4.如权利要求1所述的菊花总黄酮树脂纯化方法，其特征是洗脱流速为1BV/h～4BV/h，优选1BV～3BV/h，最优选2BV/h。
5.如权利要求1所述的菊花总黄酮树脂纯化方法，其特征是洗脱剂为有机醇，优选乙醇。
6.如权利要求5所述的菊花总黄酮树脂纯化方法，其特征是洗脱剂的洗脱浓度为50％～90％，优选70％～80％。
7.如权利要求5所述的菊花总黄酮树脂纯化方法，其特征是洗脱剂体积为1.5BV～2.5BV，优选2.0BV～2.5BV，最优选2BV。
8.如权利要求1所述的菊花总黄酮树脂纯化方法，其特征是获得纯化的菊花总黄酮含量＞65％，总黄酮转移率＞95％。
全文摘要
本发明提供一种菊花总黄酮树脂纯化方法，是以大孔树脂吸附法将菊花提取液经树脂上柱、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的菊花总黄酮。本发明提供的菊花总黄酮树脂纯化方法是一种操作简便、快捷的方法。所选的大孔树脂具有吸附量大、解吸率大。本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。用本发明方法纯化菊花提取物，其总黄酮转移率可达95％以上，纯化物总黄酮含量可达65％以上，且重现性好，树脂可重复使用。
文档编号C07D311/30GK1460678SQ03129150
公开日2003年12月10日 申请日期2003年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者蒋惠娣, 胡季强, 陈忆庭, 曾苏 申请人:浙江现代中药与天然药物研究院有限公司, 浙江大学